miR-15b在荣昌猪不同体组织中的表达差异及其在C_(2)C_(12)细胞中的动态表达分析

2 结果与分析
2.1 miR-15b 在猪不同组织中的表达特征分析 qPCR
分析发现，miR-15b 在荣昌猪各组织中均有表达，在心
脏和胸腺中的表达量较高，在肝脏和肾脏中的表达量较
低。miR-15b 在胸腺表达量最高，肝脏表达量最低，两
者的差异倍数约为 15（P <0.05）。
miR-15b 表达量
R：AACGCTTCACGAATTTGCGT
1.3 RNA 的提取与反转录 利用 Trizol reagent 试剂分 别提取 3 头荣昌猪的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、 肌肉、胸腺和小肠组织的总 RNA，用 NanoDrop 2000 测定各总 RNA 的浓度及 OD 值，1% 琼脂糖凝胶电泳 检测 RNA 的完整性。质检合格的各 RNA 浓度统一稀 释成 200 ng/μL。随后利用 miSCript® II RT Kit 将 RNA 反 转 录 成 cDNA。10 μL 反 转 录 体 系：5×miSCript Hi Flex 2 μL、10×miSCript NuCleiCs Mix 1 μL、miSCript Reverse TransCriptase Mix 1 μL、RNase-free water 1 μL、 总 RNA 5 μL（200 ng/μL）。反应程序：37℃ 60 min、 95℃ 5 min。cDNA 产物于 -20℃保存备用。 1.4 实 时 荧 光 定 量 PCR 利 用 miSCript SYBR Green PCR Kit 在 7900 HT fast real time PCR system 上进行实 时荧光定量 PCR，详细操作参见试剂盒说明书。10 μL 反 转 录 体 系：2×QuantiTeCt SYBR Green PCR Master Mix 5 μL、上游引物 1 μL（10 μmol/L）、10×miSCript Universal Primer（10 μmol/L）1 μL、RNase-free water 2 μL、cDNA 1 μL。反应程序：95℃ 15 min、94℃ 15 s、 55℃ 30 s、70℃ 30 s，40 个循环，熔解曲线采用仪器 默认设置。 1.5 C2C12 细胞增殖和成肌分化培养 利用含 10% 胎牛 血清的 DMEM 培养基进行 C2C12 细胞的增殖培养，培 养条件为 5% 的 CO2，37℃。显微镜下观察增殖第 0、2、4、 6 天时 C2C12 细胞的生长情况，同时收集增殖第 0、1、2、 3、4、5 天和 6 天的 C2C12 细胞用于 miR-15b 表达量分 析。利用含 2% 马血清的低糖 DMEM 培养基进行 C2C12 细胞的成肌分化培养，培养条件为 5% 的 CO2，37℃。 收集诱导分化后第 0、1、2、3、4、5 天和 6 天的 C2C12
图 5 C2C12 细胞分化过程中 miR-15b 的动态表达分析
3讨 论
研究发现，miR-15b 可通过负向调控 DEDD 的表 达来防止 CD8+ T 细胞凋亡，也可通过调控细胞增殖 和抗凋亡信号通路中的相关基因 CCND2、CCND1 和 IGF1R 来促进小鼠脾脏中 B 细胞的增殖 ， [16] 表明 miR15b 在机体免疫中发挥着重要功能。本研究发现 miR15b 在胸腺、脾脏和肺等免疫相关的组织中表达量都较 高， 这 与 前 人 研 究 [16] 结 果 相 一 致， 同 时 也 提 示 miR15b 可 能 通 过 调 控 CCND2、CCND1、IGF1R 等 基 因 在猪胸腺、脾脏和肺等免疫相关组织中发挥生物学功 能。Hitoo 等 [17] 研究发现，在新生大鼠的心肌细胞中， miR-15b 可以通过靶向 Arl2 基因来降低心肌细胞中的 ATP 水平和减少线粒体损伤，继而减少心肌细胞的凋 亡，表明 miR-15b 可能有助于心脏发育。本研究所用 实验样本为 3 月龄荣昌猪，此时心脏也处于快速发育期， miR-15b 在荣昌猪心脏组织中高表达，这一结果也正好 与 Hitoo 等 [17] 的研究结果相互印证。Li[18] 等研究发现， 抑制肥胖小鼠体内 miR-15b 的表达可以增强其胰岛素 的敏感性，表明 miR-15b 可能在肝脏中发挥抑制胰岛 素敏感性的功能，因此正常个体肝脏中 miR-15b 的表 达量较低，而本实验发现，miR-15b 在荣昌猪肝脏组织 中表达量较低，这正好与 Li[18] 等研究结果相一致。现 有研究发现，miR-15b 可通过活化 Akt/mTOR 信号通路 和失活 JNK 酶防止人肾皮质近曲小管上皮细胞凋亡 、 [19] 通过靶向抑制 BCl2 加速小鼠肾小球膜细胞凋亡 、 [20] 通 过靶向 Sema3A 抑制足细胞的凋亡、氧化应激及炎症反 应 ， [21] 但是这些生物学过程均是在机体遭受高糖应激 时发生，并未有研究证实 miR-15b 与正常的肾脏细胞 生物学功能有关，提示 miR-15b 在正常猪肾脏中可能 发挥的生物学功能较少。本实验也发现 miR-15b 在荣 昌猪肾脏组织中低表达，这与先前的研究结果 [19-21] 相 一致。鉴于 miR-15b 在猪免疫相关组织以及心脏中的 生物学功能，后续可以通过观察在分离培养的胸腺、脾 脏等免疫相关组织的淋巴细胞中干扰或过表达 miR-15b 后细胞的表型及 miR-15b 靶基因变化情况验证 miR-15b 在猪体内的生物学功能。
细胞用于 miR-15b 表达量分析，同时对诱导分化后第 0、 1、2、3、4、5 天和 6 天的 C2C12 细胞进行吉木萨染色， 显微镜下观察 C2C12 细胞的分化情况。 1.6 统 计 分 析 采 用 2- ∆∆ Ct 方 法 [15] 计 算 miR-15b 的 表 达水平，并利用 Excel 2007 中的 T-test 检验分析显著性 水平，以 P<0.05 为差异显著。
miR-15b 表达量
4.0
4
d d
3.5
d
3 bc
2.5
b
2
be
1.5 a
1
0.5
0 0
1
2
3
4
5
6
增殖天数
不同字母代表差异显著（P <0.05）。
图 3 C2C12 细胞增殖过程中 miR-15b 的动态表达分析
A
B
C
100 μm
100 μm
D
E
F
100 μm
100 μm
100 μm
100 μm
1 材料与方法ห้องสมุดไป่ตู้
1.1 实验材料 实验用的 3 头 3 月龄健康无病荣昌猪选 自重庆市荣昌区国家级荣昌猪保种场，样品采集参考陈 灿灿等 [14] 的方法。C2C12 细胞由猪品种遗传改良国家地 方联合工程实验室保存；RNA 提取试剂 Trizol reagent、 胎牛血清、马血清、DMEM 培养基和低糖 DMEM 培 养 基 购 自 GbiCo 公 司（ 美 国）；miSCript® II RT Kit、 miSCript®SYBR® Green PCR Kit 购自 QIAGEN 公司（德 国）；吉木萨染色液购自 Sigma 公司（日本）。其他试
遗传育种·Genetics and Breeding
2021 年 第 57 卷 第 07 期
miR-15b 在荣昌猪不同体组织中的表达差异及其 在 C2C12 细胞中的动态表达分析
龙 熙 1，孙文阳 2，柴 捷 1，王金勇 1，吴 玲 3，张廷焕 1* （1. 重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2. 甘肃农业大学动物科技学院，甘肃兰州 730070；
20
18 a
16
14
a
12
a
b
10
8 c
6
4
d
d
2
e
e
0
腺
脏
脏
肺
胃
肠
肉
脏
脏
胸
心
脾
小
肌
肾
肝
不同字母代表差异显著（P<0.05）。
图 1 miR-15b 在荣昌猪不同组织中的表达谱
2.2 miR-15b 在 C2C12 细胞增殖过程中的动态表达分析 细胞形态学观察发现，C2C12 细胞在接种早期增殖速度 相对较慢，在第 4 天时增殖速度明显增快，基本铺满整 个 6 孔板，在第 6 天时细胞数量基本与第 4 天相同（图 2）。qPCR 分析发现，miR-15b 在 C2C12 细胞的整个增 殖过程均有表达。在增殖的第 1~3 天，miR-15b 表达量 随着培养时间的增加显著升高，在第 3~5 天达到最高值 并趋于稳定，第 6 天又显著降低（图 3）。 2.3 miR-15b 在 C2C12 细胞分化过程中的动态表达分析 利用吉木萨染色液对分化时期的 C2C12 细胞进行染色发 现，在诱导分化后的第 1~4 天，C2C12 分化程度较低， 第 5、6 天细胞的分化程度较高（图 4）。qPCR 分析发 现，miR-15b 在 C2C12 细胞的整个分化过程中均有表达， 并呈现先显著升高再显著降低的趋势。在诱导分化的第 1~4 天，miR-15b 表达量随着时间增加显著升高，在第 5~6 天显著降低（图 5）。
收稿日期：2020-08-28；修回日期：2020-10-31 资助项目：重庆市绩效激励引导专项项目（19540）；重庆市 绩效激励引导专项项目（19536）；国家自然科学基金项目（31771 376） 作者简介：龙熙（1990-），女，四川资阳人，硕士，助理研究员， 主要从事猪遗传育种与繁殖研究，E-mail：13618288075@163. Com；并列第一作者：孙文阳（1989-），男，宁夏银川人，博 士，主要从事猪遗传育种与繁殖研究，E-mail：1256487172@ * 通讯作者：张廷焕（1988-），男，四川南充人，硕士，助理 研究员，主要从事猪遗传育种与繁殖研究，E-mail：ztinghuan @
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Science and Technology·科学技术
剂均为国产分析纯。
1.2 引物设计与合成 根据 miBase 中猪源 miR-15b（登
录号：MI0002419）的参考序列设计引物，与 miR-15b 配 对 的 下 游 引 物 由 miSCript®SYBR® Green PCR Kit 中
A、B、C、D、E、F 分别代表 C2C12 细胞在分化第 1、2、3、4、5、6 天的状态（放 大倍数为 100×，比例尺大小为 100 μm ）。
图 4 不同分化时期的 C2C12 细胞状态
6
a
miR-15b 表达量
5
b 4
3
b
2
1
e
d
c c
0
0
1
2
3
4
5
6
分化天数
不同字母代表差异显著（P <0.05）。
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A
B
1000 μm
C
D
1000 μm
1000 μm
1000 μm
A、B、C、D 分别代表 C2C12 细胞在第 0、2、4、6 天的增殖状态 （放大倍数为 40×）。
图 2 不同增殖时期的 C2C12 细胞生长状态
3. 绥江县动物卫生监督所，云南昭通 657000）
摘 要：为探究 miR-15b 在荣昌猪不同体组织中的表达差异及其在 C2C12 细胞不同发育时期的动态表达变化， 本研究采用 RT-qPCR 方法检测 miR-15b 在荣昌猪心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、肌肉、胸腺和小肠组织
及其在 C2C12 细胞增殖和分化过程中的表达水平。结果表明：miR-15b 在荣昌猪各组织中均有表达，其中在心 脏和胸腺中的表达量最高，在肝脏和肾脏中的表达量最低；miR-15b 的表达量在 C2C12 细胞的整个增殖过程中 均显著升高，在 C2C12 细胞的整个分化过程中先显著升高再显著降低。综上所述，miR-15b 在荣昌猪各组织广 泛表达，其表达量在 C2C12 细胞的增殖和早期分化中显著升高，推测 miR-15b 在 C2C12 细胞的增殖以及分化早 期发挥重要功能。
泛的调控作用。miR-15b 位于染色体结构维持蛋白 4 （StruCtural MaintenanCe of Chromosomes 4，SMC4） 的编码基因的第 5 内含子 [4]，参与调节机体的多种生物 学功能，如抑制人胶质瘤细胞 [5] 和神经母细胞瘤 [6] 的 增殖或促进肺腺癌细胞的增殖 [7]、促进 [8] 或抑制 [9] 细 胞凋亡、诱导初始 T 细胞向 iTreg 细胞分化 、 [10] 限制记 忆性 T 细胞的分化及细胞周期 、 [11] 双向调控 CD8+T 淋 巴细胞的免疫应答功能 、 [12] 调节血管平滑肌细胞的生
长从而参与外周动脉疾病进程 [13] 等。因此，miR-15b 在细胞增殖和分化、细胞周期调控以及细胞免疫应答等 方面均发挥着重要作用。
中国是猪肉生产大国，肉质发育和疾病免疫应答 极大程度上决定着猪肉产量。到目前为止，miR-15b 在 猪体内的表达特征及生物学功能研究还未见报道，在 C2C12 细胞中的生物学功能及其作用机制研究也寥寥无 几。因此，本研究探究 miR-15b 在猪不同体组织及其 在 C2C12 细胞系不同发育时期的表达特征，以期为明确 miR-15b 在荣昌猪各组织中的表达差异及其在 C2C12 细 胞增殖和分化过程中的生物学功能奠定基础。
关键词：miR-15b；荣昌猪；C2C12 细胞；表达特征；细胞形态
中图分类号：S828.2
文献标识码：A
DOI 编号：10.19556/j.0258-7033.20200828-08
miRNA 是 一 类 长 18~22 nt 的 在 转 录 水 平 上 负 向 调控靶基因表达的内源性非编码小 RNA，在细胞的增 殖分化 [1]、凋亡 [2]、机体免疫 [3] 等方面发挥着十分广
自带。以 U6 基因作为内参基因，利用 Primer 5.0 设计
U6 基因定量用引物，详细信息见表 1。所有引物均在
苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表 1 qPCR 扩增用引物信息
引物名称
引物序列（5' → 3'）
miR-15b
F：TAGCAGCACATCATGGTTTACA
U6
F：CTCGCTTCGGCAGCACA