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AuNPs／Sol-gel复合膜法固定乙酰胆碱酯酶生物传感器检测有机磷农药
ｍ 检 出限为 ００ Ｌ， ．２
ｍＬ ．传感器具有 良好 的重现性和稳定性 ， 为有机磷农药 的检测 提供了
种简便易行 的方法 ． 中图分类号 ０ ５ ． ６７ １ 文献标 识码 Ａ 文章编号 ０ ５ －７ ０ ２ １ ） １２ ３ ￣６ ２ １０９ （０ １ １－５ ３
关键词 乙酰胆碱酯酶 ；金纳米粒子 ；溶胶 一 凝胶 ； 生物传感器 ；久效磷
孙春燕等 ： ｕ Ｐ／ ｏ ｇｌ Ａ Ｎ ｓＳ ｌ ｅ 复合膜 法固定 乙酰胆碱 酯酶 生物传 感器检 测有机磷农 药 —
吸收峰较 尖 锐 ， 明粒径 分 布较均 匀 ．将 Ａ Ｎ ｓ 于镀 有碳膜 的铜 网上 ，于室 温下 晾干后 ， Ｔ Ｍ 进 表 ｕＰ滴 用 Ｅ
行观察 ， 仪器工作电压为 ２０ｋ ．由图 ２ Ｂ 可见 ， ｕ Ｐ 粒径均一， ０ Ｖ （） ＡＮｓ 直径约为 ２ ｍ， ０ｎ 并且呈规则的
机 磷农 药 的指标 ，为有 机磷农 药 的检 测提供 了快速 、 敏 的方法 灵 ．
在构建电化学生物传感器的过程中， 将酶固定于工作电极表面的方法有 吸附法 、 包埋法、 共价键 合法 、 交联法及 电聚合法等 ， 因此最大程度保持酶的活性是关键问题 ． 溶胶－ （ｏ ｇ１法可以 凝胶 ｓｌ ｅ） － 很好地保持蛋白质表面微观结构的整体性 ， 对组分的活性和稳定性损伤较小 ，因此能为生物分子如细 胞 、 、 白质 、 酶 蛋 抗原及抗体等 的固定提供 良好的 载 体条 件 ｊ ．由于 金 纳 米 粒 子 （ ｕ Ｐ ） 有 比 Ａ Ｎ ｓ具 表面积大 、 表面 自由能高和吸附能力强等优点 ， 因
有机磷农药由于其较高的杀虫活性而在工农业生产中被广泛应用 ， 农药的长期使用所带来的农药 残 留问题 已成 为影 响人 类健康 与 环境 安全 的重 大隐 患 Ｉ．有机 磷农 药可 以和 乙酰胆 碱酯 酶 （ Ｃ Ｅ） ２ Ｊ Ａ ｈ 活 性 中心丝氨酸上的羟基结合 ， 抑制 Ａ ｈ Ｃ Ｅ的活性 ， 使其失去对 乙酰胆碱 的水解能力 ， 造成组织中乙酰
QuEChERS-超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定水果制品和肉酱中10种四环素类抗生素
谷悦，唐会鑫，李朔，等. QuEChERS-超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定水果制品和肉酱中10种四环素类抗生素[J].食品工业科技，2023，44（18）：313−320. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022100072GU Yue, TANG Huixin, LI Shuo, et al. Determination of 10 Tetracycline Antibiotics in Fruit Products and Meat Sauce by QuEChERS with Ultra Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(18): 313−320. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022100072· 分析检测 ·QuEChERS-超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法测定水果制品和肉酱中10种四环素类抗生素谷 悦1，唐会鑫1，李 朔2，马 玲2，王 可1,2, *，杨莉丽1（1.河北师范大学化学与材料科学学院，河北石家庄 050024；2.石家庄市疾病预防控制中心，石家庄市化学毒物检测及风险预警技术创新中心，河北石家庄 050011）摘 要：使用QuEChERS 结合超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（Ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry ，UPLC-MS/MS ），建立检测水果制品和肉酱中10种四环素类抗生素的分析方法。
硕士论文--多奈哌齐透皮贴剂的药学研究
多奈哌齐透皮给药研究
Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｐａｔｃｈ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ（ＤＰＢ）ｉｓ ａ ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ—ｂａｓｅｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｃｅｔｙ７ｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ＤＰＢ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｌｄ ｔｏ ｍｏｄｅｒａｔｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｔ ａｌｓｏ ｐｌａｙｓ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔ’Ｓ ｍｅｎｔａｌ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｋｅｅｐｉｎｇ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｃｔｉｖｅ．Ｎｏｗ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ＤＰＢ ｈａｓ ｔａｂｌｅｔｓ ａｎｄ ｃａｐｓｕｌｅｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｈａｖｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｉｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｕｓｅ ｏｆ
研究结果表明当使用混合丙烯酸酯压敏胶作为基质时（Ｂ／Ｃ＝３／Ｉ，ｗ／ｗ），多奈哌齐 经皮贴剂中药物浓度超过１５％ｗｔ＿ｉ产生结晶，透皮贴剂能够保证长时间的给药需求， 贴剂中有关物质的生成量较少，药物的稳定性较好，但药物的体外经皮渗透速率较低， 需要加入促渗剂提高药物的经皮渗透速率。使用脂肪酸酯１和有机酸作为混合促渗剂时， 能够起到协同促渗作用，与对照组相比，可将多奈哌齐累积透过量提高２．７倍。使用最 优处方进行大鼠体内药代动力学实验，结果表明，与口服给药相比，多奈哌齐经皮给药 后，血药浓度垒少可以维持４８小时以上，药物生物利用度显著提高，－、Ｉ‘均滞留时间和 半衰期也相应显著延长。
26291346_基于UPLC-MS
Abstract: A UPLC-MS/MS method was established to quantitatively determine the content of alliin in animal plasma to study whether alliin and alliin in garlic enteric preparations can react to produce the active ingredient allicin in the in vivo environment. Methods Reversed-phase C18 column (Waters ICQUITY UPLC BEH, 100 × 2.1 mm, 1.7μm), column temperature: 40 ℃, flow rate: 0.15 mL/min, injection volume: 2μl, Mobile phase: 0.1% formic acid (A)-acetonitrile (B), gradient elution; mass spectrometry ionization: ESI+, determination of allicin in rat plasma . Results The results of two parallel experiments of garlic enteric preparation and enzymatic garlic powder showed that in the garlic enteric preparation with allinase, the plasma concentration of alliin in the blood of rats was significantly lower. Conclusion A UPLC-MS/MS method for the quantitative determination of alliin in animal plasma has been established. Alliin and alliin in garlic enteric-coated preparations can react in vivo.Key words: Garlic enteric preparation; garbonine; UPLC-MS-MS基于UPLC-MS/MS大蒜肠溶制剂中蒜氨酸、蒜酶体内反应情况研究杨亮1，胡小霞4 ，宋百灵4，关明3，李新霞2*（1.新疆警察学院 新疆 乌鲁木齐 8300112.新疆医科大学药学院 新疆 乌鲁木齐 8300113.新疆师范大学化学化工学院 新疆 乌鲁木齐 8300544.新疆医科大学中心实验室 新疆 乌鲁木齐 830011）Study on the Reaction of Garlic and Uterine in the UPLC-MS / MS of Garlic SausolYANG Liang 1，HU Xiaoxia 4 ，SONG Bailing 4，GUAN Ming 3，LI Xinxia 2*(1. Xinjiang Police College, Urumqi 830054, Xinjiang China2.Chemistry and Chemical Engineering of Xinjiang Normal University College, Urumqi 830054, Xinjiang China3.School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang China4.Central Laboratory of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang China ）摘要：目的 建立定量测定动物血浆中蒜氨酸含量的UPLC-MS/MS 方法，研究大蒜肠溶制剂中蒜氨酸、蒜酶能否在体内环境下反应生成活性成分大蒜辣素。
鱼腥草素钠对金黄色葡萄球菌自溶抑制的
鱼腥草素钠对金黄色葡萄球菌自溶抑制的转录组研究与功能性分析刘丽慧1，梁俊超1，李扬1，郭娜2，申凤鸽1，邢明勋1，王学林1，吴秀萍1，于录1（1. 吉林大学人兽共患病研究所，人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林大学畜牧兽医学院，长春130062；2. 吉林大学食品质量与安全系，长春130062）摘要：本实验中，鱼腥草素钠对21 株金黄葡萄球菌具有体外抗菌活性。
鱼腥草素钠可降低Triton X-100 对金黄色葡萄球菌自溶的诱导作用，而酶谱电泳分析和自溶酶定量检测方法证实鱼腥草素钠可降低金黄色葡萄球菌胞外的胞壁质水解酶的活性。
芯片结果显示经鱼腥草素钠作用后的菌株与对照菌株相比，自溶素基因atl, sle1, cidA 和lytN 转录的抑制水平与自溶抑制因子基因lrgAB 和sarA 的诱导水平一致且自溶正调控因子基因agrA 和RNAIII 下调。
负调控因子基因lytSR, mgrA 和arlS 表达水平下降并不能说明自溶抑制是因鱼腥草素钠作用所致。
而大量毒力因子基因转录抑制表明鱼腥草素钠是通过一条共享作用途径影响自溶和毒力因子基因的。
除此之外，一些重要基因的转录也受到鱼腥草素钠的影响。
芯片中的部分结果我们已通过RT-PCR 验证。
关键词：金黄色葡萄球菌；鱼腥草素钠；基因芯片；转录中图分类号：S432.4+2 文献标识码：AIn vitro activity of isoimperatorin in combination withrifampicin, Transcriptional Profiling and Functional Analysis Reveals Sodium Houttuyfonate-mediated Inhibition of Autolysis in Staphylococcus aureus Liu Lihui1, Liang Junchao1, LiYang1, Guo Na2, Shen Fengge1, Xing Mingxun1,Wang Xuelin1, Wu Xiuping1, Yu Lu1(1. Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College ofAnimal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, ChangChun 130062;2. Department of Food Quality and Safty, Jilin University, ChangChun 130062)Abstract: Sodium houttuyfonate (SH) showed in vitro antibacterial activity against 21 Staphylococcus aureus (S. aureus) strains. Triton X-100-induced autolysis was significantly decreased by SH in S. aureus ATCC 25923, and zymographic analysis and quantitative bacteriolytic assays demonstratedSH-mediated reduction of extracellular murein hydrolase activity in these cells. Microarray results showed decreased levels of autolysin atl, sle1, cidA and lytN transcripts in the SH-treated strain as compared to the control strain that were consistent with the induction of the autolytic repressors lrgAB and sarA and with the downregulation of the positive regulators agrA and RNAIII. The reduced expression of the additional negative regulators lytSR, mgrA, and arlS fails to explain the inhibition of autolysi s triggered by SH. In addition, the transcription of a large number of virulence factors were inhibited, indicating that SH affects autolysis and virulence genes via a shared pathway. Moreover, the transcription of several important genes such as those of the iron-regulated surface determinant system was also affected by SH. Some of the microarray results were confirmed by real-time RT-PCR. Keywords:Staphylococcus aureus; sodium houttuyfonate; GeneChip; transcription基金项目：国家自然基金（30871889）；教育部新教师基金（200801831051）；国家科技重大专项子课题（2008ZX10301）；吉林省科技发展计划项目（20080565）；吉林大学基础科研业务费；吉林大学农学部人才建设基金作者简介：刘丽慧，（1987-），女，硕士通信联系人：于录，（1970-），男，教授，.E-mail:***************联用或糖肽类万古霉素[6]和替考拉宁[7]联用可降低细菌自溶。
高效液相色谱法测定植物精油中双氯芬酸钠的含量
26广东产品质量监督检验研究院，广东佛山 528300……………………………………罗敏婷 何海彤 伍志航高效液相色谱法测定植物精油中双氯芬酸钠的含量通过采用Waters BEH-C18色谱柱，以甲醇-质量分数4%乙酸溶液 （体积比70∶30）为流动相，在检测波长为276 nm ，流速0.7 mL/min ，外标法定量条件下，建立高效液相色谱法 （HPLC ）测定植物精油中双氯芬酸钠含量的方法。
结果表明，双氯芬酸钠在0.5 ~ 200 μg/mL 的范围内线性关系良好，回归方程y = 34256x + 6892.9 （R 2 = 0.9999），方法平均回收率在90.26% ~ 98.77%之间，RSD （n =6）在0.89% ~ 2.11%之间。
该方法简便、快速、准确、重复性好，适用于植物精油中双氯芬酸钠含量的检测。
高效液相色谱法 植物精油 双氯芬酸钠Determination of the Content of Diclofenac Sodium in Essential Oils by High Performance Liquid ChromatographyLUO Minting HE Haitong WU Zhihang(Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision, Foshan 528300, Guangdong, China)Abstract ： To establish the method for determining the content of diclofenac sodium in essential oils by HPLC, Waters BEH-C18 column was used with the mobile phase of methyl alcohol and 4% (mass fraction) glacial acetic acid (volume ratio 70/30), at the flow rate of 0.7 mL/min, the detection wavelength was 276 nm with external standard method for quantification. Results revealed that the concentration of diclofenac sodium was in the range of 0.5-200 μg/mL with good linear relation. The regression equation was y = 34 256x + 6 892.9 (R 2 = 0.999 9). And the average recovery rate was 90.26%-98.77%, RSD (n = 6) was 0.89%-2.11%. The method is simple, rapid, accurate and repeatable, which is suitable for determining the content of diclofenac sodium in essential oils. Keywords ：HPLC essential oils diclofenac sodium作者简介罗敏婷 （1992—），女，研究生学历，硕士，主要从事食品、食品相关产品和化妆品检测工作。
HPLC-ESI-MS／MS快速测定泽兰水提物中的7种成分
HPLC-ESI-MS／MS快速测定泽兰水提物中的7种成分强光辉;刘昆善;姚宏武;李军【期刊名称】《西北药学杂志》【年(卷),期】2015(30)6【摘要】目的：建立泽兰水提物中主要成分咖啡酸、迷迭香酸、熊果酸、芦丁、木犀草素、齐墩果酸和槲皮素快速测定的超高效液相色谱‐电喷雾‐三重四级杆串联质谱方法。
方法超声法制备泽兰水提物，XBridge‐C18（100 mm ×2．1 mm ，3．5μm）反相梯度洗脱法对样品进行分离；电喷雾电离源负离子模式多级反应监测扫描法对各成分进行定量分析。
结果方法的相对标准偏差在0．24％～2．8％范围内，回收率在93．3％～105．2％之间，检测限为0．05～1．0μg · L －1。
结论该方法具有分析速度快，灵敏度高和特异性强的特点，可为中药中目标成分的含量测定提供方法学参考。
%Objective To develop a method for rapid and simultaneous determination of rosmarinci acid ,caffeic acid ,ursolicacid ,cya‐nidenon ,phytomelin ,oleanolic acid and quercetin by ultra‐performance liquid chromatography‐electrospray‐triple quadrupole mass spectrometer .Methods Ultrasonic method was used to prepare the aqueous extract of Lycopus lucidus Turcz .;an XBridge‐C18re‐verse phase column was employed to separate the interest compounds through gradient elution ;multi reaction monitoring method under electrospray ionization and negative ion mode was utilized to determine the seven compounds .Results The relative standard deviations of the method werein the range of 0 .24%‐2 .8% ;the recoveries were ranged from 93 .3%‐105 .2% ;the limits of detec‐tion were 0 .05‐1 .0 μg · L -1 .Conclusion The proposed method has the advantages of rapid speed of analysis ,high sensitivity and specificity .It is possible to become an alternative for the determination of target compounds in traditional Chinese medicine .【总页数】4页(P693-696)【作者】强光辉;刘昆善;姚宏武;李军【作者单位】西安市自来水有限公司，西安 710082;西安市自来水有限公司，西安 710082;西安市自来水有限公司，西安 710082;西安市自来水有限公司，西安710082【正文语种】中文【中图分类】R282【相关文献】1.HPLC-ESI-MS/MS快速测定鱼肉中的氯霉素残留 [J], 李资玲;黄优生;熊向源;李玉萍;吴光杰2.LC-MS/MS法同时测定犬血浆中7种人参皂苷类成分及其在人参提取物药代动力学研究中的应用 [J], 林力;刘建勋;张颖;李欣志;段昌令;林成仁;李磊3.HPLC-ESI-MS法同时测定印度獐牙菜中5种酮类化合物的含量 [J], 张大业;陈丽娟;刘健4.UPLC-MS/MS法快速测定龟甲胶中龟源成分 [J], 郭尚伟;庞慧慧;段小波;徐云鹏;王玉娇;赵婷婷;黄雅钦5.HPLC-ESI-MS/MS法同时测定血必净注射液中11种有效成分的含量 [J], 王红;刘玲;苏联麟;郭志花;崔永伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基于人血清白蛋白占位的内标型比率荧光探针检测抗癫痫药物盐酸噻加宾
收稿日期:2019-10-12基金项目:国家自然科学基金(N o .21705010,21735001,2157501,91853104);湖南省自然科学基金(N o .2019J J 50653);湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室开放基金(N o .2017018) *通讯作者:杨荣华,男,博士,教授,主要从事化学与生物传感技术研究.E -m a i l :Y a n g r h @p k u .e d u .c n 邹振,男,博士,讲师,主要从事化学与生物传感技术研究.E -m a i l :k o b e 474779970@126.c o m第35卷第6期V o l .35 N o .6分析科学学报J O U R N A LO FA N A L Y T I C A LS C I E N C E 2019年12月D e c .2019D O I :10.13526/j .i s s n .1006-6144.2019.06.016基于人血清白蛋白占位的内标型比率荧光探针检测抗癫痫药物盐酸噻加宾廖小豆,曹雅诗,艾思欣,杨 艳,汤鑫慧,刘 芸,周梦洁,邹 振*,杨荣华*(长沙理工大学化学与食品工程学院,湖南长沙410114)摘 要:本文提出了一种检测抗癫痫药物盐酸噻加宾(T G B )的内标型比率荧光探针(P D I -H S A -A C )㊂该探针以人血清白蛋白(H S A )为竞争结合反应载体,染料苝二酰亚胺衍生物(P D I )为荧光基团,茜素络合指示剂(A C )为内标物㊂通过对P D I ㊁H S A ㊁A C 和T G B 相互作用的研究,我们发现P D I 的荧光能够被H S A 猝灭,并且P D I 结合在H S A 的位点Ⅱ处,当存在T G B 时,T G B 竞争结合在H S A 的位点Ⅱ,P D I 被置换下来,从而实现了荧光恢复㊂此外,T G B 的存在基本不影响结合在H S A 位点Ⅰ处的A C 的荧光信号,因此实现了对T G B 的比率荧光法的检测㊂构建的荧光探针具有灵敏度高㊁选择性好以及检测方法简单㊁实验条件温和㊁检测迅速等优点,并且能够应用于实际尿液中T G B 的检测㊂关键词:人血清白蛋白;内标型比率荧光探针;盐酸噻加宾;竞争性结合;位点选择中图分类号:O 657.39 文献标识码:A 文章编号:1006-6144(2019)06-797-07癫痫是神经系统最常见的疾病之一,它严重威胁患者的健康并影响其生活质量[1]㊂目前,癫痫最主要及最常用的治疗手段仍然是药物治疗[2]㊂盐酸噻加宾(T G B )是一种新型的抗癫痫药物,其作用机制是阻滞神经元和神经胶质细胞对γ-氨基丁酸(G A B A )的再摄取,增加突触部位G A B A 的水平,从而达到抗癫痫的作用[3]㊂然而,研究表明T G B 的过量使用会产生一系列的副作用,例如头晕无力㊁腹部疼痛㊁体重变化㊁思想异常㊁认知能力下降㊁精神运动迟缓和抑郁等[4-7],甚至还可能导致患者产生自杀的想法或行为[8]㊂因此,T G B 的检测对指导临床用药具有重大的意义㊂目前,T G B 的检测方法为高效液相色谱法(H P L C )[9-10]㊂该方法选择性好,准确度高,但是存在样品预处理复杂,分析成本高,检测时间长,对操作人员要求高等缺点[11]㊂荧光光谱法由于其灵敏度高㊁选择性好㊁检测成本低廉和操作简便等特点,已经在诊断学㊁药理学㊁病理学㊁化学生物学等领域得到了广泛的应用,已成为一种必不可少的分析手段[12]㊂但单一发射的荧光探针容易受到周围环境㊁自身浓度和检测仪器等因素的影响,导致检测结果的准确性降低[13]㊂而同时具有两个或多个荧光发射峰的比率型荧光探针,可以通过自身信号峰进行校正,提高检测的准确性[14]㊂人血清白蛋白(H S A )是人血浆中含量最为丰富的蛋白质,其含量约占血浆总蛋白的60%[15]㊂H S A 有两个主要的配体结合位点(位点Ⅰ和位点Ⅱ),能够与多种内源性和外源性物质相结合[16]㊂因此,H S A 也常常被用作蛋白载体,用于脂肪酸㊁类固醇激素㊁药物等物质的输送[17]㊂同时,据文献报道有些荧光分797第6期廖小豆,等:基于人血清白蛋白占位的内标型比率荧光探针检测抗癫痫药物盐酸噻加宾第35卷子也可与H S A 发生选择性位点结合,改变荧光分子的光致发光性质㊂然而,目前报道的H S A 结合荧光探针皆为荧光增强型,只适用于H S A 检测或 T u r n -o f f 模式下的位点筛选[18-20]㊂在本工作中,我们发现染料苝二酰亚胺衍生物(P D I )能与H S A 的位点Ⅱ结合,并发生荧光猝灭㊂本文利用这一独特的现象,并选择位点Ⅰ结合探针茜素络合指示剂(A C )为内标物,构建了内标型比率荧光探针(P D I -H S A -A C )㊂该荧光探针对尿液中T G B 具有很好响应,并呈现出明显的比率荧光识别特点,有望用于临床药物分析㊂1 实验部分1.1 仪器及试剂U V -2700紫外-可见分光光度计(日本,岛津公司);P T I 荧光分光光度计(美国,P T I 公司)㊂人血清白蛋白(H S A )购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司㊂布洛芬购于生工生物工程股份有限公司㊂丹酰胺(D N S A )购于梯希爱化成工业发展有限公司㊂盐酸噻加宾(T G B )以及其他生化试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司㊂染料苝二酰亚胺衍生物(P D I )由于聪教授课题组提供㊂本研究所用的化学试剂均为分析纯,未经任何处理㊂实验用水为超纯水㊂1.2 紫外-可见吸收光谱与荧光光谱的测定将P D I 和H S A 分别溶于50%的乙醇和超纯水中,均配成1m m o l /L 的母液,使用时均用超纯水稀释至所需浓度㊂取一定体积P D I 母液稀释为10μm o l /L ,通过紫外-可见分光光度计测量P D I 的最大激发波长㊂在所得的最大激发波长处测定P D I 中加入一系列呈梯度浓度的H S A 之后的溶液荧光强度的变化㊂分别取一定体积的P D I 和H S A ,稀释为一系列比例浓度为1ʒ9㊁2ʒ8㊁3ʒ7㊁4ʒ6㊁5ʒ5㊁6ʒ4㊁7ʒ3㊁8ʒ2㊁9ʒ1(P D IʒH S A )的溶液,通过荧光光谱仪测得一系列的荧光强度F ,再将H S A 换成超纯水作为空白对照,测得的一系列荧光强度F 0,分别取最大发射处的荧光强度值计算F /F 0,以此探究P D I 和H S A 的最佳结合比㊂为考察P D I 与H S A 结合位点,选取两种H S A 位点标志物:位点Ⅰ的标志物丹酰胺(D N S A ),位点Ⅱ的标志物布洛芬(I b u p r o f e n )㊂将上述两种位点标志物分别加入到10μm o l /LP D I 和10μm o l /L H S A 的混合溶液体系中,分别改变位点Ⅰ和位点Ⅱ标志物的浓度,测量溶液荧光强度的变化㊂图1 基于人血清白蛋白占位的内标型比率荧光探针检测抗癫痫药物盐酸噻加宾的原理图F i g .1 S c h e m a t i c i l l u s t r a t i o no f h u m a n s e r u ma l b u m i n -o c c u p y i n g -b a s e d i n t e r n a l s t a n d a r d r a t i o f l u o r e s c e n t p r o b e f o r d e t e r m i n a t i o no f a n t i -e p i l e p t i c d r u g t i a g a b i n e h yd r o c h l o r i de 2 结果与讨论2.1 内标型比率荧光探针P D I -H S A -A C 的构建及检测原理图1为基于H S A 占位的内标型比率荧光探针检测抗癫痫药物T G B 的原理图㊂染料苝二酰亚胺衍生物(P D I )具有强烈的荧光,当P D I 结合在H S A 的位点Ⅱ时,P D I 的荧光发生猝灭,茜素络合指示剂(A C )作为内标物结合在H S A 的位点Ⅰ㊂当存在T G B 时,T G B 与H S A 发生位点竞争性结合,置换出具有897第6期分析科学学报第35卷荧光性质的P D I,并且T G B的存在基本不影响A C的荧光信号,从而实现对T G B的比率荧光法的检测㊂2.2P D I和H S A相互作用的光谱特性及选择性分析图2A为10μm o l/LP D I溶液的激发和发射光谱㊂可以看出P D I在波长为385n m和500n m处均有吸收㊂其中,在500n m处显示最强的吸收峰,故在后续考察P D I与H S A的相互作用实验中选择的激发波长为500n m㊂此外,以500n m为激发波长,发现P D I在549n m波长处有最强的发射㊂通过荧光变化研究了P D I与H S A之间的相互作用㊂实验结果如图2B所示,随着H S A的浓度不断升高,溶液的荧光强度逐渐降低㊂表明H S A对P D I的荧光具有猝灭作用,推测该猝灭作用是来源于P D I 和H S A的结合㊂采用了等摩尔连续变化法考察了P D I与H S A之间相互作用的结合比㊂如图2C所示,以荧光强度的比值F/F0(F和F0分别为存在和不存在H S A的体系的荧光强度)对两者摩尔比作图㊂从图中可以看出P D I与H S A之间是单一的键合模式,最佳的猝灭比即结合比为1ʒ1㊂为了考察P D I对不同的氨基酸和蛋白质的选择性,在10μm o l/LP D I溶液中分别加入L-谷氨酸,L-精氨酸㊁葡萄糖氧化酶㊁胰蛋白酶㊁糜蛋白酶㊁木瓜蛋白酶㊁溶菌酶和H S A,结果如图2D所示㊂实验发现除了H S A之外,其它的氨基酸和蛋白质对溶液体系的荧光几乎无影响,由此可见P D I对H S A具有很好的选择性㊂图2(A)10μm o l/LP D I溶液的激发和发射光谱;(B)在10μm o l/LP D I溶液中加入不同浓度的H S A之后的荧光光谱(λe x=500n m);(C)P D I与H S A的等摩尔变化曲线(λe x=500n m,λe m=549n m);(D)不同氨基酸和蛋白质对P D I荧光强度的影响F i g.2(A)E x c i t a t i o na n d e m i s s i o n s p e c t r a o f10μm o l/LP D I s o l u t i o n;(B)F l u o r e s c e n c e s p e c t r a o f P D I u p o n t i t r a t i n g w i t hH S A(λe x=500n m);(C)I s o m o l a r c u r v e o f P D I a n dH S A(λe x=500n m,λe m=549n m);(D)E f f e c t o f v a r i o u s a m i-n o a c i d s a n d p r o t e i n s o n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o fP D I2.3P D I与H S A的结合位点研究众所周知,H S A有两个主要的结合位点,分别是位点Ⅰ和位点Ⅱ㊂利用位点竞争实验,可以探究P D I 与H S A的结合位点㊂如图3A和3B所示,在10μm o l/LP D I和10μm o l/L H S A的混合溶液体系中,分别加入不同浓度的位点Ⅰ的标志物丹酰胺(D N S A)和位点Ⅱ的标志物布洛芬(I b u p r o f e n),结果显示加入不同浓度的丹酰氯之后,溶液的荧光强度基本没有变化,而加入不同浓度的布洛芬之后,溶液的荧光强度随着其浓度的增加而升高㊂表明布洛芬的加入,使得与H S A结合的P D I被置换下来,从而恢复P D I的荧光,因此可以说明P D I与H S A的结合位点是位点Ⅱ㊂997第6期廖小豆,等:基于人血清白蛋白占位的内标型比率荧光探针检测抗癫痫药物盐酸噻加宾第35卷图3P D I与H S A结合位点的荧光光谱㊂(A)不同浓度D N S A存在下H S A和P D I体系的荧光光谱;(B)不同浓度I b u p r o f e n存在下H S A和P D I体系的荧光光谱F i g.3F l u o r e s c e n c e s p e c t r a o f t h e b i n d i n g s i t e s o fP D I a n dH S A.(A)F l u o r e s c e n c e s p e c t r a o fH S Aa n dP D I s y s t e m s i n t h e p r e s e n c e o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n o f D N S A;(B)F l u o r e s c e n c e s p e c t r a o fH S Aa n dP D I s y s t e m s i n t h e p r e s e n c e o f v a r i-o u s c o n c e n t r a t i o no f I b u p r o f e n2.4探针对T G B的检测实验根据文献报道,A C由于疏水性可与H S A的位点Ⅰ结合[21]㊂而T G B可以和H S A位点的L y s-414, A r g-410,A r g-485,L e u-453,S e r-489,T y r-411等氨基酸残基相互作用,占据H S A的结合位点Ⅱ[8],这为T G B的比率荧光检测提供了理论依据㊂首先,考察了A C的光谱性质以及A C㊁H S A㊁P D I和T G B的相互影响,结果如图4A和图4B所示㊂图4A为20μm o l/LA C溶液的激发和发射光谱,由图可知A C的最大激发波长为385n m,最大发射波长为443n m,由于385n m的激发光能同时激发P D I和A C,实验中选择激发波长为385n m㊂由图4B的荧光光谱可以看出,T G B的加入恢复了P D I的荧光,且H S A㊁P D I和T G B对A C的荧光信号均无影响,表明A C可作为内标物,可实现比率荧光法检测T G B㊂图4(A)20μm o l/LA C溶液的激发和发射光谱;(B)A C㊁H S A㊁P D I和T G B相互作用的荧光光谱(λe x=385n m);(C)温度对检测T G B实验的影响(λe x=385n m,λe m=549n m);(D)P D I-H S A-A C探针对T G B响应时间的考察(λe x= 385n m,λe m=549n m)F i g.4(A)E x c i t a t i o na n d e m i s s i o n s p e c t r a o f20μm o l/LA Cs o l u t i o n;(B)F l u o r e s c e n c e s p e c t r ao fA C H S A,P D I a n d TG Bi n t e r a c t i o n s(λe x=385n m);(C)T h e i n f l u e n c e o f t e m p e r a t u r e o nT G Bd e t e c t i o n e x p e r i m e n t(λe x=385n m,λe m=549 n m);(D)R e s p o n s e t i m e o fP D I-H S A-A C p r o b e t oT G B(λe x=385n m,λe m=549n m)008第6期分析科学学报第35卷经实验优化得到的浓度分别为10μm o l/L㊁10μm o l/L和70μm o l/L的P D I㊁H S A和A C三元复合物比率荧光探针(P D I-H S A-A C)对T G B进行检测㊂2.4.1温度对检测T G B的影响设置温度分别为20㊁25㊁30㊁35㊁37㊁40ħ,考察不同温度下荧光探针P D I-H S A-A C(P D I㊁H S A和A C的浓度分别为10μm o l/L,10μm o l/L和70μm o l/L)的荧光强度(F0),以及在探针中加入200μm o l/LT G B之后的荧光强度(F),通过计算不同温度下F/F0比值的大小,研究温度对检测T G B实验的影响,如图4C所示㊂其中,F和F0分别为有和无T G B存在情况下体系的荧光强度㊂从图中可以看出,荧光强度比值F/F0几乎不随温度的变化而变化,表明温度对T G B的检测基本没有影响㊂2.4.2探针的灵敏度和稳定性通过荧光光谱时间扫描,考察内标型比率荧光探针P D I-H S A-A C对检测T G B的响应速度以及稳定性㊂首先对探针体系P D I-H S A-A C进行1m i n的时间扫描,然后分别加入100μm o l/L㊁200μm o l/L和400μm o l/LT G B,继续时间扫描,观察溶液荧光强度的变化情况㊂如图4D 所示,在探针体系中分别加入100μm o l/L㊁200μm o l/L和400μm o l/LT G B之后,溶液的荧光强度立即上升,并且在十几秒钟之内达到平衡并保持稳定㊂该实验结果表明探针P D I-H S A-A C对T G B的检测具有快速响应性以及优异的稳定性㊂2.4.3方法的线性范围和检出限利用探针测定不同浓度T G B对应的荧光强度㊂如图5A~5C所示,随着T G B的浓度增加,溶液的荧光强度逐渐增强㊂在T G B浓度为1~100μm o l/L的范围内,该探针对T G B的检测具有较好的线性关系,相关系数达到0.990,且通过检出限的计算公式(L O D=3σ/S,σ为11次空白样品的标准偏差,S为所得到的线性关系的斜率[22])得到该探针的检出限为0.527μm o l/L,由此可见该比率型荧光探针对T G B的检测具有较低的检出限㊂图5(A)内标型比率荧光探针P D I-H S A-A C检测不同浓度T G B的荧光光谱;(B)比率荧光强度(F549/F443)和T G B (1~600μm o l/L)浓度的关系;(C)比率荧光强度(F549/F443)和T G B(1~100μm o l/L)浓度的线性关系;(D)内标型比率荧光探针P D I-H S A-A C对T G B的选择性F i g.5(A)T h e f l u o r e s c e n c e s p e c t r a o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f TG Bw e r e d e t e c t e d b y t h e i n t e r n a l s t a n d a r d r a t i o f l u-o r e s c e n t p r o b eP D I-H S A-A C;(B)R e l a t i o n s h i p b e t w e e n r a t i o f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y(F549/F443)a n d t h e c o n c e n t r a t i o no f T G B(1~600μm o l/L);(C)T h e l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n r a t i o f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y(F549/F443)a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o fT G B(1~100μm o l/L);(D)S e l e c t i v i t y o f t h e i n t e r n a l s t a n d a r d r a t i o f l u o r e s c e n t p r o b eP D I-H S A-A Cf o rT G B2.4.4探针的选择性实验为考察内标型比率荧光探针P D I-H S A-A C对T G B的选择性,选取C l-㊁N a+㊁K+㊁M g2+㊁C a2+㊁葡萄糖㊁半胱氨酸㊁精氨酸㊁谷氨酸㊁甘氨酸㊁加巴喷丁㊁卡马西平㊁丙戊酸钠㊁苯妥英108第6期廖小豆,等:基于人血清白蛋白占位的内标型比率荧光探针检测抗癫痫药物盐酸噻加宾第35卷钠㊁尿素㊁尿酸等多种离子㊁氨基酸和药物等㊂将上述物质和T G B的浓度都固定为200μm o l/L,分别加入到荧光探针P D I-H S A-A C体系中,测量溶液荧光强度的变化㊂如图5D所示,除了T G B可以使得探针的比率荧光强度(F549/F443)增强之外,其它的离子㊁氨基酸和药物等对探针的比率荧光强度只有轻微的变化,这说明该探针对T G B具有较好的选择性㊂2.5实际样品尿液中T G B的检测尿液样品取自健康的女性捐赠者㊂将尿液用超纯水稀释10倍,加入探针P D I-H S A-A C和不同浓度的T G B,分别测其荧光强度值,重复3次,计算T G B在尿液中的回收率㊂如表1所示,尿液中添加T G B 的回收率较好,证明了我们构建的探针在复杂生物环境中检测T G B的准确性和选择性㊂因此,该探针为实际样品中T G B的检测提供了一种灵敏㊁选择性好的比率荧光检测方法㊂表1人体尿样中T G B含量测定结果(n=3)T a b l e1D e t e r m i n a t i o no fT G B i nu r i n e(n=3)S a m p l e A d d e d(μm o l/L)R e c o v e r y(μm o l/L)F o u n d(μm o l/L)F o u n d(%)R S D(%)(%)R S D(%)S a m p l e A d d e d(μm o l/L)R e c o v e r y55.81162.655052.61053.14U r i n e1011.21123.06U r i n e8075.3942.65 2021.51073.1210092.4922.933结论本工作成功构建了P D I-H S A-A C三元配合物体系的内标型比率荧光探针,探究了它的荧光光谱特性以及对盐酸噻加宾(T G B)的检测㊂结果表明该探针对T G B的检测具有很好的响应性和选择性,能够实现实际尿液中T G B的高灵敏分析㊂该内标型比率荧光探针具有构造简单㊁抗干扰能力强㊁易操作等优势,探针还可扩展至其它H S A结合药物的检测,在临床药物分析中具有潜在的应用价值㊂参考文献:[1] Z HA OJ,L IX Y,WA N G M,e t a l.J o u r n a l o f I n t e r n a t i o n a lN e u r o l o g y a n dN e u r o s u r g e r y(赵娟,李筱瑜,王敏,等.国际神经病学神经外科学杂志),2015,42(6):530.[2] Z HA N G X W.C l i n i c a lR a t i o n a lD r u g U s e(张小伟.临床合理用药),2017,10(11C):180.[3] S o r r i I,K a l v i a i n e nR,M a n t y j a r v iM.E p i l e p s y R e s e a r c 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t e r a c t i o nB e t w e e nA n t i b i o t i cD r u g s a n dH u m a nS e r u m A l b u m i n.S h a n x iU n i v e r s i t y(慕丽晓.抗生素类药物和人血清白蛋白相互作用的研究.山西大学),2012.[18]F a nXP,H eQ Y,S u nSG,e t a l.C h e m i c a l C o m m u n i c a t i o n s,2016,52(6):1178.[19]R e j aS I,K h a n IA,B h a l l aV,e t a l.C h e m i c a l C o m m u n i c a t i o n s,2016,52(6):1182.[20]E r JC,V e n d r e l lM,T a n g M K,e t a l.A C SC o m b i n a t o r i a l S c i e n c e,2013,15(9):452.[21]D i n g F,Z h a n g L,D i a o JX,e t a l.E c o t o x i c o l o g y a n dE n v i r o n m e n t a l S a f e t y,2012,79:238.[22]S a m a n t aS,H a l d e r S,D a sG.A n a l y t i c a l C h e m i s t r y,2018,90(12):7561.〛H u m a nS e r u m A l b u m i n-O c c u p y i n g-B a s e dR a t i oF l u o r e s c e n t P r o b e f o rD e t e r m i n a t i o no fA n t i-e p i l e p t i cD r u g T i a g a b i n eH y d r o c h l o r i d eL I A O X i a o-d o u,C A O Y a-s h i,A I S i-x i n,Y A N G Y a n,T A N G X i n-h u i,L I U Y u n,Z H O U M e n g-j i e,Z O UZ h e n*,Y A N G R o n g-h u a*(C o l l e g e o f C h e m i s t r y a n dF o o dE n g i n e e r i n g,C h a n g s h aU n i v e r s i t y o f S c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,C h a n g s h a410114)A b s t r a c t:A n i n t e r n a l c a l i b r a t i o n-b a s e d r a t i o f l u o r e s c e n t p r o b eP D I-H S A-A Cw a s f i r s t l yp r o p o s e d f o r t h e d e t e c t i o no fa n t i-e p i l e p t i cd r u g t i a g a b i n h y d r o c h l o r i d e(T G B).T h e p r o b ec o n s i s t e do fh u m a ns e r u m a l b u m i n(H S A)a s t h ec o m p e t i t i v eb i n d i n g r e a c t i o nc o n t a i n e r,p e r y l e n ed i i m i d ed e r i v a t i v e(P D I)a s t h e f l u o r e s c e n t r e p o r t u n i t,a n d a l i z a r i n c o m p l e x o n e(A C)a s t h e i n t e r n a l s t a n d a r ds u b s t a n c e.I n t h e s t u d y o f t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nP D I,H S A,A Ca n dT G B,w e f o u n d t h a t t h e f l u o r e s c e n c e o f P D I c a nb e q u e n c h e d b y H A Sv i ab i n d i n g t o s i t eⅡo fH S A.I n t h e p r e s e n c eo fT G B,T G Bc o m p e t i t i v e l y b i n dt os i t eⅡa n d r e p l a c eP D I o fH S A.A sar e s u l t,t h ef l u o r e s c e n c eo fP D I i sr e c o v e r e d.I na d d i t i o n,t h eT G Bd o e sn o t a f f e c t t h e f l u o r e s c e n c e s i g n a l o fA Ca t t h eH S As i t e I,t h u s a c h i e v i n g t h e r a t i o f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o no f T G B.T h e p r o b eh a s t h ea d v a n t a g e so fh i g hs e n s i t i v i t y,g o o ds e l e c t i v i t y,s i m p l ed e t e c t i o n m e t h o d,m i l d e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s,r a p i d d e t e c t i o n,a n d c a nb e a p p l i e d t o t h e d e t e c t i o n o fT GB i n a c t u a l u r i n e.K e y w o r d s:H u m a ns e r u m a l b u m i n;I n t e r n a ls t a n d a r dr a t i of l u o r e s c e n t p r o b e;T i g a b i n eh y d r o c h l o r i d e;C o m p e t i t i v eb i n d i n g;S i t e s e l e c t i o n308。
211050375_牛奶中全氟烷基酸的简便萃取与定量研究
浙江省大型科研仪器开放共享平台—质谱专栏 (54 ~ 62)牛奶中全氟烷基酸的简便萃取与定量研究李城华，汪 嫣，蒋可志（杭州师范大学 材料与化学化工学院 有机硅化学与材料技术重点实验室，浙江 杭州 311121）摘要：采用阴离子交换树脂和硅胶作为混合填料对牛奶中的全氟烷基酸进行固相萃取，并结合液相色谱质谱联用技术，建立了一种简便的牛奶中21种全氟烷基酸同时定量方法. 在牛奶样中加入乙腈析出大量蛋白，萃取液在自制固相萃取小柱采用1.5 mL 80%乙腈水溶液进行洗脱纯化. 对纯化液进行液相色谱质谱联用分析，分析条件如下：以乙腈-5 mmol 的醋酸铵水溶液为流动相，在XDB-C 18色谱柱上进行梯度洗脱，采用电喷雾负离子模式电离（ESI ），质量扫描模式为多反应监测（MRM ）模式检测. 方法中全氟烷基酸（PFAAs ）的检出限为0.01~0.20 ng/mL ，定量限为0.03~0.67 ng/mL ，方法的线性关系（R 2>0.999）和重现性均良好，回收率范围为66%~125%. 对13种常见市售牛奶中全氟烷基酸进行分析，主要检出了7种全氟烷基酸，其牛奶质量浓度在2.43~12.00 ng/mL 之间.关键词：全氟羧酸；全氟磺酸；牛奶；液相色谱-串联质谱；固相萃取中图分类号：O657. 63 文献标志码：B 文章编号：1006-3757（2023）01-0054-09DOI ：10.16495/j.1006-3757.2023.01.009Simple Extraction and Determination of Perfluoroalkyl Acids in MilkLI Chenghua ， WANG Yan ， JIANG Kezhi（College of Material , Chemistry and Chemical Engineering , Key Laboratory of Organosilicon Chemistry and Material Technology of Ministry of Education , Hangzhou Normal University , Hangzhou 311121, China ）Abstract ：A simple method for the simultaneous quantification of 21 perfluoroalkyl acids in milk has been developed using solid-phase extraction (SPE) with anion-exchange resin and silica gel as the mixed packing material, combined with the liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) technique. A large amount of protein was precipitated by adding acetonitrile to the milk sample, and the extract solution was purified through the elution in a self-made solid phase extraction column using 1.5 mL of 80% acetonitrile water solution. The purified solution was analyzed using LC-MS under the following conditions: an XDB-C18 column with gradient elution using acetonitrile-5 mmol of aqueous ammonium acetate as the mobile phase, electrospray negative ionization mode ionization (ESI), the mass scan mode was multiple reaction monitoring (MRM) mode detection. The limits of detection (LOD) of perfluoroalkyl acids (PFAAs)were 0.01~0.20 ng/mL and the limits of quantification (LOQ) were 0.03~0.67 ng/mL. The linearity (R 2>0.999) and reproducibility of the method were good, and the recoveries ranged from 66% to 125%. Thirteen common commercially available milk were analyzed for perfluoroalkyl acids, and seven perfluoroalkyl acids were mainly detected with milk mass concentrations ranging from 2.43 to 12.00 ng/mL.Key words ：perfluorocarboxylic acid ；perfluorosulfonic acid ；milk ；LC-MS/MS ；SPE牛奶作为一种老少皆宜的饮品，在人类膳食结构中占据着较高地位. 牛奶含有人体必需元素，如氨基酸、矿物质和维生素等[1]，对儿童生长和免疫功能发育至关重要[2]. 全氟烷基酸（PFAAs ）是一类持收稿日期：2023−01−31； 修订日期：2023−03−02.基金项目：浙江省分析测试基金项目（LGC20B050011） [Analysis and Detection Foundation of Science and TechnologyDepartment in Zhejiang Province (LGC20B050011)]作者简介：李城华（1996−），女，硕士研究生，研究方向：色质谱分析，E-mail ：通信作者：蒋可志（1980−），男，副教授，研究方向：色质谱分析，E-mail ：.第 29 卷第 1 期分析测试技术与仪器Volume 29 Number 12023年3月ANALYSIS AND TESTING TECHNOLOGY AND INSTRUMENTS Mar. 2023久性有机污染物[3]，其中最常见的是全氟烷基羧酸（PFCAs）和全氟烷基磺酸（PFSAs），具有7个或更少碳原子的PFCAs和具有6个或更少碳原子的PFSAs被归为短链PFAAs，大于8个碳原子的PFCAs和大于7个碳原子的PFSAs是长链PFAAs[4]. PFAAs具有良好的疏水疏油特性[5]，许多生产企业利用其优良性能使全氟化合物在食品接触材料中广泛使用[6–8]，因此牛奶产品的包装材料可能引入PFAAs. 饲料、草料作为奶牛的主要食物来源，在整个乳制品生产过程中，不可避免会受到水、土壤等的影响，从而将环境污染物带入食品供应，而PFAAs具有高度稳定性[9]，可能由于各类途径残留在牛奶中，再通过食物链进入人体，脆弱人群接触PFAAs的主要途径是牛奶和乳品[10]. PFAAs具有生殖毒性、神经毒性、发育毒性，还可能造成内分泌紊乱，尤其对幼儿的生长发育不利[11-12]. 因此，对牛奶样品中PFAAs进行分析对人类饮食健康有着重要意义.由于牛奶是一种复杂的介质[13]，大多数前处理方法都有冗长的样品制备步骤、高额处理成本以及较长的处理时间等缺点. 以往报道的文献中，乳制品多采用WAX小柱进行固相萃取去除基质[14–16].本文采用乙腈去除牛奶中大量蛋白质，IRA900阴离子交换树脂与SiO2混合作为填料进行固相萃取（SPE），考察了填料类型对PFAAs提取效率影响，且优化了填料用量、填料比例、洗脱溶剂和洗脱体积等4个前处理条件，并结合色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测技术分析了牛奶中PFAAs的含量.1 试验部分1.1 仪器与试剂液相色谱-串联质谱仪：Agilent 6495型串联三重四极杆质谱，配Agilent1290型液相色谱仪（Agilent 公司，美国）. UV-1200紫外光谱仪（Thermifisher公司，美国）. Microflex MALDI-TOF质谱仪（Bruker 公司，德国）.21种PFAAs标准品，包括8种全氟烷基磺酸盐：全氟丁基磺酸盐（PFBS）、全氟戊基磺酸盐（PFPeS）、全氟己基磺酸盐（PFHxS）、全氟庚基磺酸盐（PFHpS）、全氟辛基磺酸盐（PFOS)、全氟壬基磺酸盐（PFNS）、全氟癸烷磺酸盐（PFDS）和全氟十二烷磺酸盐（PFDoS）. 13种线性全氟烷基羧酸盐：全氟丁酸（PFBA）、全氟戊酸（PFPeA）、全氟己酸（PFHxA）、全氟庚酸（PFHpA）、全氟辛酸（PFOA）、全氟壬酸（PFNA）、全氟癸酸（PFDA）、全氟十一烷酸（PFUnDA）、全氟十二烷酸（PFDoA）、全氟十三烷酸（PFTrDA）、全氟十四烷酸（PFTeDA）、全氟十六烷酸（PFHxDA）和全氟十八烷酸（PFODA）（HPLC，2 µg/mL，Wellington Laboratories）.甲醇（HPLC，≥99.9%，Sigma-Aldrich），乙腈（HPLC，≥99.9%，Sigma-Aldrich），醋酸铵（AR，国药集团化学试剂有限公司），SiO2（宁波鸿谱实验科技有限公司），IRA900阴离子交换树脂（阿拉丁），石墨化碳黑（宁波鸿谱实验科技有限公司），C18（宁波鸿谱实验科技有限公司），芥子酸（AR，默克），固相萃取空柱（3 mL，吴桥津杨过滤器材厂），WAX固相萃取小柱（Oasis），氨水（AR，阿拉丁）. 试验用水均为去离子水，电阻率大于18.2 MΩ·cm. 试验所用的牛奶样品均为市售产品.1.2 试验方法1.2.1 标准样品制备取PFAAs混合标准品200 µL，加入200 µL甲醇，涡旋20 s，配制成质量浓度为1 µg/mL的标准品储备液，密封置于4 ℃的冰箱中储存备用，后续再使用甲醇将PFAAs混合标准储备液稀释成0.05、0.1、0.5、1、5、10、50 ng/mL的标准系列溶液，使用0.45 µm滤头过滤.1.2.2 牛奶样品的前处理方法首先在固相萃取空柱中填入硅胶和IRA900阴离子交换树脂（质量比2∶3，共0.15 g），小柱分别用5 mL去离子水、5 mL乙腈预处理，充分活化.取0.5 mL牛奶，加入0.5 mL乙腈，涡旋20 s，直接倒入已活化的固相萃取柱，然后以缓慢均匀的流速洗脱（流速约为1滴/s），洗脱剂为1.5 mL 80%的乙腈，再通过0.45 µm滤头过滤，定容后进行LC-MS/MS 检测分析.优化前处理条件时，在牛奶中加入标准品（100µg/mL的PFAAs混合标准溶液，20 µL）后探究最佳条件.1.2.3 液相色谱质谱联用分析方法液相色谱使用XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm），柱温：30 ℃；流速：0.5 mL/min；流动相A为5 mmol/L的醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，流动相A在水中加入少量醋酸铵. 梯度洗脱：0~1 min，35% B；1~17 min，35%~75% B；17~19 min，75%~98% B；19~24 min，98% B；进样量为5 µL. 在离子多反应监测（MRM）模式下通过电喷雾负电离检测分析物，第 1 期李城华，等：牛奶中全氟烷基酸的简便萃取与定量研究55毛细管电压3 000 V，雾化气（N2）压强为0.14 MPa，干燥气（N2）的流速为14 L/min，干燥气（N2）的温度为200 ℃，汽化温度为250 ℃，各个化合物主要质谱参数如表1所列.表 1 全氟烷基酸的质谱定量参数Table 1 Quantitative mass spectrometric parameters forperfluoroalkyl acid分析物分子式分子量/(g/mol)前体离子/(m/z)子离子/(m/z)碰撞能量/eVPFBA C4HF7O2214.0213.0168.85 PFPeA C5HF9O2264.0263.0218.94 PFHxA C6HF11O2314.0313.0269.04 PFHpA C7HF13O2364.1363.0318.95PFOA C8HF15O2414.0413.0368.98PFNA C9HF17O2464.1463.0419.04PFDA C10HF19O2514.1513.0468.99 PFUdA C11HF21O2564.1563.0518.99 PFDoA C12HF23O2614.1613.0568.99 PFTrDA C13HF25O2664.1663.0619.19 PFTeDA C14HF27O2714.1712.9669.19 PFHxDA C16HF31O2814.1812.9769.09 PFODA C18HF35O2914.1912.9869.013PFBS C4HF9O3S300.1298.9298.926PFPeS C5HF11O3S350.1348.9348.921 PFHxS C6HF13O3S400.1398.9398.917 PFHpS C7HF15O3S450.1448.9448.921PFOS C8HF17O3S500.1498.9498.925PFNS C9HF19O3S550.1548.9548.925PFDS C10HF21O3S600.1598.9598.925 PFDoS C12HF25O3S700.2698.9698.9252 结果与讨论2.1 21种PFAAs的LC-MS分析所有PFAAs均可以在电喷雾电离源（ESI）中通过负离子模式电离成去质子化离子[M-H]−. 本工作中使用含有5 mmol/L乙酸铵的乙腈流动相改善色谱峰形状，获得优化的色谱分离结果[17]，结果如图1所示. 由图1可见，在1.2.3所述色谱条件下，21种PFAAs在22 min内得到完全分离.2.2 SPE条件的优化2.2.1 SPE填料的选择SPE填料的选择对牛奶中PFAAs的准确灵敏检测至关重要. 牛奶基质复杂，含有大量蛋白质、无机盐、糖类等物质，需要采用SPE技术去除基质. 本文采用C18、GCB、IRA900阴离子交换树脂、SiO2这4种填料考察萃取效果，结果如图2所示. 由图2可见，IRA900阴离子交换树脂和SiO2的萃取效果明显优于C18和GCB这两种填料，IRA900阴离子交换树脂和SiO2的混合填料又稍优于IRA900阴离子交换树脂或SiO2. 因此，后续研究中选择两者的混合物作为SPE填料进行优化.2.2.2 SPE填料比例的选择对填料比例进行优化，选择SiO2和IRA900阴离子交换树脂的质量比分别为4∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4进行牛奶中PFAAs的萃取，结果如图3所示. 由图3可见，填料比例对萃取效率的影响不是很大，为保证长链PFCAs的回收率，最终选择的填料比例为2∶3.2.2.3 SPE填料质量的选择为减少填料的浪费，本文对填料质量进行优化.试验中，选择填料质量为0.03、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g进行固相萃取，结果如图4所示. 由图41.2×1051.0×1058.0×1046.0×1044.0×1042.0×10446PFBAPFPeAPFHxAPFHpAPFBSPFPeSPFHxSPFOAPFNAPFHpSPFOSPFDAPFUdAPFDoAPFTrDAPFTeDAPFHxDAPFODAPFDoSPFDSPFNS81012Retention time/minRelativeabundance1416182022图1 21种PFAAs的总离子流图Fig. 1 Total ion flow diagram of 21 PFAAs70605040质量浓度/(ng/mL)30201018填料类型22图2 填料类型对萃取效率的影响Fig. 2 Effect of packing type on extraction efficiency56分析测试技术与仪器第 29 卷可见，填料质量由0.03g增加至0.15 g时，随着填料质量升高，PFAAs含量也随之升高，填料质量继续增加，萃取值基本达到平衡，最终选择的混合填料质量为0.15 g.2.2.4 洗脱溶剂的优化合适的洗脱溶剂才能将分析物洗脱下来，洗脱溶剂选择含0.5% NH3·H2O的乙腈水溶液，分别用1 mL 60%、70%、75%、80%、85%、90%、100%的乙腈水溶液进行洗脱，结果如图5所示. 由图5可见，PFSAs受洗脱剂的影响很小，而长碳链的PFODA受洗脱剂的影响较大，为保证回收率，洗脱溶剂选择80%的乙腈水溶液（含0.5%的NH3·H2O）.2.2.5 洗脱剂体积的优化为减少洗脱剂的损失，对洗脱剂的体积进行优化. 分别考察了0.2、0.5、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0 mL 的洗脱剂体积对萃取效率的影响，结果如图6所示.由图6可见，洗脱剂体积在0.2~1.2 mL范围时，PFAAs萃取效率随体积的增加而逐渐升高，而体积大于1.2 mL时，萃取效率达到平衡. 最终洗脱剂体积选择1.5 mL.2.3 自填柱与WAX商品柱的对比牛奶中PFAAs的检测通常采用SPE的方式，而WAX柱是处理牛奶、母乳等蛋白质含量较高的样品时最常用的固相萃取小柱. 经过上述的条件优化，得到最佳萃取条件，首先对比两者的萃取效果，结果如图7（a）所示，除短链PFSAs外，PFCAs 和长链PFSAs经过自填柱的固相萃取较WAX柱均有提升. 通过紫外光谱分析两种小柱洗脱液中质量浓度/(ng/mL)质量浓度/(ng/mL)质量浓度/(ng/mL)质量浓度/(ng/mL)填料比例填料比例填料比例填料比例图3 填料比例对萃取效率的影响（a）短链PFCAs（PFPeA，PFOA，PFHxA，PFNA，PFHpA，PFDA），（b）长链PFCAs（PFUdA，PFTeDA，PFDoA，PFHxDA，PFTrDA，PFODA），（c）短链PFSAs（PFBS，PFPeS），（d）长链PFSAs（PFHxS，PFNS，PFHpS，PFDoS）Fig. 3 Effect of packing ratio on extraction efficiency45短链 PFCAs长链 PFCAs短链 PFSAs长链 PFSAs36271890.050.100.150.200.250.30质量浓度/(ng/mL)填料质量/g图4 填料质量对萃取效率的影响Fig. 4 Effect of packing quality on extraction efficiency第 1 期李城华，等：牛奶中全氟烷基酸的简便萃取与定量研究57蛋白质的含量，结果如图7（b）所示. 由图7（b）可见，蛋白质的特征吸收波长在280 nm处，自填柱的吸收峰显著降低. 另外，通过maldi分析洗脱液[以芥子酸（SA）为基质，4.0 µL混合溶液在不锈钢靶上干燥，用于MALDI-TOF质谱分析]，结果如图7（c）（d）所示. 由图7（c）（d）可见，WAX柱洗脱后，洗脱液中基质、蛋白质含量较高（m/z>2 000），而自填柱的洗脱液中基质含量低很多（m/z>2 000）. 此外，对比相对昂贵的商品小柱，自填小柱的成本非常低，能够节省试验成本.2.4 方法学验证在上述优化条件下，通过LC-MS/MS分析了PFCAs和PFSAs的一系列混合标准溶液，并通过峰面积与浓度的关系绘制了相应的标准曲线. 如表2所列，每种PFCAs和PFSAs在相应线性范围内实现了良好的线性关系，相关系数（R2）在0.999 1~ 0.999 9之间. 对质量浓度为0.5 ng/mL的PFAAs标准溶液进行5次重复分析，得出日内重现性在1.04%~4.21%之间，日间重现性在1.13%~4.26%之间. 检出限（LOD，S/N=3）范围为0.01~0.20 ng/mL，定量限（LOQ，S/N=10）范围为0.03~0.67 ng/mL.2.5 实际样品检测在优化的固相萃取条件下，将所建立的分析方法用于13种市面上常见的牛奶中PFAAs含量的检测，同一样品重复检测3次，结果如表3所列. 对每种样品都进行加标回收试验，结果如表4所列，乙腈体积分数/%乙腈体积分数/%乙腈体积分数/%乙腈体积分数/%质量浓度/(ng/mL)质量浓度/(ng/mL)质量浓度/(ng/mL)质量浓度/(ng/mL)图5 洗脱溶剂乙腈的体积分数对萃取效率的影响（a）短链PFCAs（PFPeA，PFOA，PFHxA，PFNA，PFHpA，PFDA），（b）长链PFCAs（PFUdA，PFTeDA，PFDoA，PFHxDA，PFTrDA，PFODA），（c）短链PFSAs（PFBS，PFPeS），（d）长链PFSAs（PFHxS，PFNS，PFHpS，PFDoS）Fig. 5 Effect of volume fractions of eluting solvent acetonitrile on extraction efficiency洗脱体积/mL质量浓度/(ng/mL)图6 洗脱溶剂体积对萃取效率的影响Fig. 6 Effect of volume of eluting solvent on extractionefficiency58分析测试技术与仪器第 29 卷表 2 PFAAs 标准品的标准曲线、线性范围、重现性、检出限、定量限Table 2 Standard curves, linear ranges, reproducibilities, detection limits, quantitative limits of PFAAs standards 分析物标准曲线方程R2线性范围/（ng/mL ）重现性(0.5 ng/mL)LOD/(ng/mL)LOQ/(ng/mL)日内/%日间/%PFPeA y =116.16x +3.530.999 80.1~10 3.12 3.150.050.17PFHxA y =434.18x −205.940.999 90.05~10 2.29 2.340.010.03PFHpA y =421.20x +7.160.999 10.5~50 4.21 3.170.150.50PFOA y =296.42x −127.380.999 30.1~10 3.56 2.130.050.17PFNA y =224.44x +15.860.999 50.1~11 1.04 2.110.050.17PFDA y =250.36x +9.610.999 10.1~12 3.93 2.450.010.03PFUdA y =279.18x −0.290.999 30.1~13 4.12 3.670.050.17PFDoA y =350.31x -29.640.999 30.05~10 1.69 3.620.020.07PFTrDA y =313.78x +6.430.999 70.05~10 1.75 4.150.020.07PFTeDA y =250.42x +8.910.999 90.5~50 2.94 4.260.200.67PFHxDA y =166.40x −60.460.999 80.1~50 1.34 4.210.010.03PFODA y =586.21x −58.740.999 60.05~10 2.87 2.130.010.03PFBS y =1 553.30x −6.860.999 80.1~10 2.62 1.130.050.17PFPeS y =934.53x −9.630.999 90.1~10 3.51 2.190.020.07PFHxS y =682.35x −17.010.999 50.05~10 3.42 2.570.010.03PFHpS y =638.18x −26.120.999 30.05~10 3.27 1.340.010.03PFNS y =983.64x −17.100.999 80.05~10 1.45 1.310.010.03PFDS y =1 098.70x −0.960.999 90.05~10 2.14 4.210.050.17PFDoSy =790.44x −3.300.999 10.05~52.992.920.010.03波长/nm4 0008 00012 00016 00020 000WAX 柱m /z4 0008 00012 00016 00020 000m /z(c)(d)5×1034×1033×1032×1031×103I n t e n s5×1034×1033×1032×1031×103I n t e n s自填柱萃取效果对比质量浓度/(n g /m L )吸光度图7 （a ）WAX 柱与自填柱的萃取效果对比，（b ）WAX 柱与自填柱洗脱液的紫外分析，（c ）WAX 柱洗脱液的maldi 分析，（d ）自填柱洗脱液的maldi 分析Fig. 7 (a) Comparison of extraction effect between WAX column and self-filled column, (b) UV analysis of eluate of WAX column and self-filled column, (c) maldi analysis of eluate of WAX column, (d) maldi analysis of eluate of self-filled column第 1 期李城华，等：牛奶中全氟烷基酸的简便萃取与定量研究59表 3 市售牛奶样品中PFAAs的含量测定Table 3 Determination of PFAAs content in milk samples on market/(ng/mL)样品PFAAs质量浓度PFPeA PFHxA PFHpA PFOA PFDA PFHpS PFDoA∑牛奶10.91±0.05 2.04±0.020.31±0.028.22±0.050.41±0.020.15±0.00N.D.12.00±0.11牛奶2 1.81±0.07N.D0.37±0.027.24±0.110.62±0.04N.D.0.66±0.0610.70±0.18牛奶3 1.45±0.09N.D.0.30±0.01 4.18±0.05N.D.N.D.N.D. 5.93±0.15牛奶40.62±0.05N.D.0.36±0.03 4.55±0.06N.D.N.D.N.D. 5.53±0.09牛奶50.78±0.06 2.22±0.020.21±0.03 5.38±0.03N.D.N.D.N.D.8.59±0.03牛奶6 1.18±0.070.70±0.120.22±0.01 2.45±0.18N.D.N.D.N.D. 4.55±0.32牛奶7 1.42±0.09 1.04±0.050.35±0.03 2.54±0.11N.D.N.D.N.D. 5.35±0.26牛奶8 1.43±0.210.83±0.080.25±0.03 2.53±0.10N.D.N.D.N.D. 5.04±0.22牛奶9 1.56±0.130.62±0.040.25±0.02N.D.N.D.N.D.N.D. 2.43±0.16牛奶10 2.11±0.180.66±0.050.47±0.03 2.92±0.18N.D.N.D.N.D. 6.16±0.18牛奶11 2.57±0.100.49±0.030.46±0.05 2.43±0.11N.D.N.D.N.D. 5.95±0.05牛奶120.74±0.150.42±0.020.36±0.03 2.45±0.08N.D.N.D.N.D. 3.97±0.13牛奶130.88±0.09N.D.0.21±0.02 2.10±0.11N.D.N.D.N.D. 3.19±0.18表 4 13种牛奶的加标回收率Table 4 Spiked recovery of 13 milks/%样品PFPeA PFHxA PFHpA PFBS PFOA PFPeS PFNA PFHxS PFDA牛奶1966911587661058710388牛奶267118110931161089310576牛奶37611376687178727772牛奶47911070769575827973牛奶5827280697088767466牛奶61171191011006793729281牛奶788981021008791758885牛奶81078991859680728377牛奶994102999212076679079牛奶10101113100100100969697116牛奶116812210610394997990119牛奶12781171059211479889295牛奶13100118125104106927991121样品PFHpS PFUdA PFDoA PFNS PFTrDA PFTeDA PFDoS PFHxDA PFODA 牛奶1937210210295100101118121牛奶288818696908895112115牛奶373957477848379108105牛奶46885707176767011485牛奶5676884757575718988牛奶6103104779810610099117107牛奶710611886106102106101119101牛奶88699739092978410981牛奶9971127793101999210769牛奶1011411997101103101110116101牛奶111031231181079689989692牛奶1210710679102101999512067牛奶131111211091111041071151099360分析测试技术与仪器第 29 卷加标回收率处于66%~125%的范围. 13个牛奶样本中均显示存在PFAAs ，检出了PFPeA 、PFHxA 、PFHpA 、PFOA 、PFDA 、PFHpS 、PFDoA 这7种PFAAs ，仅有一种PFSA ，其中PFPeA 、PFHpA 的检出频率是100%. PFOA 的检出值（8.22 ng/mL ）最高，检出的∑PFOA 值（47.05 ng/mL ）占∑PFAAs （79.70ng/mL ）的59.03%. 牛奶中短链PFAAs 检出频率较高，长链仅PFOA 的检出频率较高，而短链PFAAs 具有一定的水溶性，在环境介质（而不是材料）中的检出概率比较大. 因此，草料和水源可能是牛奶中PFAAs 的主要来源.3 结论本文建立了一种基于SPE 的LC-MS 检测13种市售牛奶中PFAAs 含量的方法. 该方法采用IRA900阴离子交换树脂和SiO 2作为自制SPE 填料，能够去除大部分的蛋白质和其他基质，得到满意回收率. 本方法重复性好、灵敏度高、回收率良好、操作简单且成本低，能够为牛奶中PFAAs 的测定提供技术支持.参考文献：姚春毅, 李东东, 唐录华, 等. 微波等离子体发射光谱法测定乳及乳制品中的11种元素[J ]. 分析科学学报，2021，37（3）：408-412. [YAO Chunyi, LI Dong-dong, TANG Luhua, et al. Determination of eleven elements in milk and dairy products by microwave plasma optical emission spectrometry [J ]. Journal of Analytical Science ，2021，37 （3）：408-412.]［ 1 ］Pereira P C. Milk nutritional composition and its rolein human health [J ]. Nutrition ，2014，30 （6）：619-627.［ 2 ］张海燕, 张敏. 高效液相色谱-质谱联用技术在PFOS类化合物检测中的应用[J ]. 分析测试技术与仪器，2010，16（1）：1-5. 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HPLC法测定肾复康Ⅱ号胶囊中5个成分的含量
HPLC法测定肾复康Ⅱ号胶囊中5个成分的含量作者：尹继瑶沈霞胡静崔小敏任慧曲彤李宁屈凯陈志永来源：《中国药房》2022年第15期中图分类号 R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2022）15-1838-04DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.15.09摘要目的建立同时测定肾复康Ⅱ号胶囊中莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹酚酸B和淫羊藿苷含量的高效液相色谱（HPLC）法。
方法采用Agilent 5 TC-C18色谱柱，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱），柱温为30 ℃，流速为1 mL/min，检测波长为240 nm，进样量为10 μL。
结果莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹酚酸B和淫羊藿苷的检测质量浓度分别在4.80～240.00、4.84～242.00、7.00～350.00、4.72～236.00、5.18～259.00 μg/mL范围内与各自峰面积呈良好的线性关系（r≥0.999 8）;精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于3%（n=6）;平均加样回收率为97.22%～101.36%，RSD为1.19%～2.43%（n=6）。
5批样品中上述5个成分的含量范围依次为2.019 3～2.360 0、1.624 2～1.847 1、5.637 7～6.828 0、5.015 9～5.717 0、1.208 8～1.754 6 mg/g。
结论该方法简便、准确，重复性好，可用于提升肾复康Ⅱ号胶囊的质量控制水平。
关键词肾复康Ⅱ号胶囊;含量测定;高效液相色谱法;莫诺苷;马钱苷;芍药苷;丹酚酸B;淫羊藿苷Content determination of five constituents in Shenfukang Ⅱ capsule by HPLCYIN Jiyao1，SHEN Xia1，HU Jing2，CUI Xiaomin2，REN Hui2，QU Tong2，LI Ning2，QU Kai1，3，CHEN Zhiyong1，2 （1. College of Basic Medicine， Shaanxi University of Chinese Medicine，Shaanxi Xianyang 712083，China; 2. Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine，Xi’an 710003，China; 3. Dept. Two of Nephropathy， Shaanxi Provincial Chinese Medicine Hospital，Xi’an 710003，China）ABSTRACT OBJECTIVE To develop an HPLC method for the simultaneous determination of morroniside，loganin，paeoniflorin，salvianolic acid B and icariin in Shenfukang Ⅱ capsule. METHODS The determination was performed on Agilent 5 TC-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphate acid （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. Thecolumn temperature was 30 ℃，and detection wavelength was set at 240 nm. The sample size was 10 μL. RESULTS The linear range of morroniside，loganin，paeoniflorin，salvianolic acid B and icariin were 4.80-240.00，4.84-242.00，7.00-350.00，4.72-236.00 and 5.18-259.00 μg/mL（r≥0.999 8），respectively. RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3% （n=6）. Average recoveries were 97.22%-101.36% with the RSDs of 1.19%-2.43%（n=6）. The contents of above 5 components in 5 batches of samples were 2.019 3-2.360 0，1.624 2-1.847 1，5.637 7-6.828 0， 5.015 9-5.717 0 and 1.208 8-1.754 6 mg/g，respectively. CONCLUSIONS The method is simple，accurate and reproducible. It can improve the quality control level of Shenfukang Ⅱ capsule.KEYWORDS Shenfukang Ⅱ capsule; content determination; HPLC method; morroniside; loganin; paeoniflorin; salvianolic acid B; icariin肾复康Ⅱ号胶囊（陕药制字Z20130011）为陕西省中医医院的医疗机构制剂，由山茱萸、菟丝子、熟地黄、淫羊藿、金樱子、赤芍、丹参、黄芪、山药、王不留行、姜黄、醋鳖甲12味中药组成;其作为防治肾小球硬化的有效方剂，临床疗效显著[1-4]。
【CN109900666A】一种快速、灵敏的果昔中抗生素的传感检测方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910160642.0(22)申请日 2019.03.04(71)申请人 唐玉乐地址 361000 福建省厦门市集美区塘埔路37号之三204室(72)发明人 全兵 (74)专利代理机构 汕头兴邦华腾专利代理事务所(特殊普通合伙) 44547代理人 聂文文 张树峰(51)Int.Cl.G01N 21/64(2006.01)(54)发明名称一种快速、灵敏的果昔中抗生素的传感检测方法(57)摘要本发明属于果昔中抗生素检测技术领域，尤其涉及一种快速、灵敏的果昔中抗生素的传感检测方法。
本发明首先利用5-氨基间苯二甲酸与CH 3COONa在离子液体-水混合液中高温反应，得传感材料；然后将传感材料、氨基修饰的纳米纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯、溶解剂混合，经静电纺丝，干燥，剪切得传感膜；最后将所得的传感膜贴于荧光比色皿的一端，加入果昔样品溶液，放于荧光分光分度计中，即可检测抗生素浓度。
本发明方法操作简单，检测成本低、灵敏度高，结果稳定，所得的传感膜可以重复使用。
权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 109900666 A 2019.06.18C N 109900666A权 利 要 求 书1/1页CN 109900666 A1.一种快速、灵敏的果昔中抗生素的传感检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）传感材料的制备：将5-氨基间苯二甲酸与CH3COONa按1：2的质量比混合后溶解在离子液体-水混合液中，加入Tb(NO3)3·6H2O，在120-130 ℃，600-1000 rpm反应3-5 h后，过滤收集沉淀物，依次用乙醇和水洗涤3-5次，真空干燥，得传感材料；（2）传感膜的制备：将传感材料、氨基修饰的纳米纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯、溶解剂超声20-30 min混合，转移至静电纺丝的微型泵中，在电压18-25 kv、接受筒与针尖距离10-20 cm、注射器给液速率0.5-0.8 mL/min的条件下纺丝，冷冻干燥后剪切成2 cm×4 cm的膜，即得传感膜；（3）果昔样品溶液的制备：将5-10 g果昔样品与10-20 mL乙腈-水混合液混合均匀，在300-600 W, 45-60 ℃条件下超声15-20 min后过滤，得果昔样品溶液；（4）样品检测：将步骤（2）所得的传感膜贴于荧光比色皿的一端，取2 mL果昔样品溶液于荧光比色皿中，静置5 min后，放于荧光分光分度计中，测量样品的发射光谱，并计算其浓度。
流动注射化学发光法检测剑麻皂苷元
流动注射化学发光法检测剑麻皂苷元王彦超;孙昊;周菲菲;郝再彬【摘要】Luminol-K3 Fe(CN)6 was used to detect content of tigogenin separated from sisal residue and sisal cream by the flow-injection chemiluminescence.When Luminol (1.0×10-5mol��L-1)was dissolved in NaOH(0.1 mol��L-1), K3Fe (CN)6(1.6×10-5mol��L-1)was dissolved in deionized water and RPM of peristaltic pump was from 50 to 80. This system showed the best character of chemiluminescence for tigogenin dissolved in ethanol.Under this condition, the LOD was 3.0×10-3mg��mL-1 .The correlation coefficient of standard curve was 0.9996,the average recovery was 98.5% and the RSD was 2.9% to 4.2%.Determination of tigogenin by HPLC was used for comparative trial.%采用Luminol-K3Fe(CN)6化学发光体系,建立流动注射化学发光法检测从剑麻残渣和麻膏中分离得到的皂苷元.当用0．1 mol��L-1 NaOH 作为溶剂配制鲁米诺浓度为1．0×10-5 mol��L-1,用去离子水作为溶剂配制K3Fe(CN)6浓度为1．6×10-5mol��L-1,主副蠕动泵转数均在50~80 r��min-1时,用无水乙醇溶解的皂苷元流入体系具有最强的化学发光.在该条件下,剑麻皂苷元最低检出限为3．0×10-3 mg��mL-1,标准曲线相关系数为0．9996,平均回收率为98．5％,相对标准偏差在2．9％~4．2％之间.同时与 HPLC检测方法对样品检测结果进行了比较.【期刊名称】《广西植物》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】5页(P135-138,142)【关键词】流动注射;化学发光;剑麻皂苷元【作者】王彦超;孙昊;周菲菲;郝再彬【作者单位】东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030;桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004;桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林541004;东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030; 桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004【正文语种】中文【中图分类】Q946.83剑麻(Agave sisaiana),又名菠萝麻、西纱尔麻、龙舌兰麻,是龙舌兰科龙舌兰属植物.剑麻皂苷元(tigogenin)是螺甾烷醇的衍生物(5α,25D-螺甾烷-3β羟基,图1),它与薯蓣皂苷元(diosgenin)和番麻皂苷元(hecogenin)均为合成甾体激素类药物的医药中间体和重要原料,广泛应用于肾上腺皮质激素、性激素及蛋白同化激素,三大类激素可以制造200多种药物(吴立军等,2011).药理研究表明,这些皂苷元成分具有较明显的抗炎、抗菌、止血、抗衰老和降血糖的生物活性(宣伟东等,2005).剑麻皂苷元来自于剑麻纤维传统产品之后废弃的麻汁和麻渣.检测植物体内提取的天然甾体皂苷元方法虽然较多,薄层色谱法(万建波等,2004)、气相色谱法(Cuiet al．,1997)、HPLC-UV(Lauet al．,2004;Liet al．,2005;Wanet al．,2006)、荧光分光光度法(Shangguanet al．,2001).色谱法可以检测皂苷元的单体种类和含量;分光光度法不能做皂苷元的单体分析,可以检测皂苷元的总含量.但是这些方法有耗时长、设备昂贵等不足.流动注射化学发光法是一种对皂苷元的总含量检测,使用该方法对剑麻皂苷元进行检测鲜见报道,该方法容易操作、检测时间短,为剑麻皂苷元的工业化生产在线检测提供新技术和理论依据.1．1 材料与设备剑麻皂苷元标准品(98%,HPLC纯,上海研生生物技术有限公司);剑麻残渣和麻膏(广西剑麻集团);无水乙醇、石油醚、盐酸、氢氧化钠、鲁米诺和铁氰化钾等生化试剂均为国产分析纯;高效液相色谱所用试剂均为Fisher色谱纯.IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈电子有限公司);EL104万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);DHG-9097电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HH-S数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂);SIGMA 3K30离心机(德国希格玛离心机有限公司);岛津LC-20AB高效液相色谱仪,ELSD检测器;氮气(99．9%,广西桂林海湾恒日化工气体有限公司). 1．2 试验方法1．2．1 皂苷元的提取与分离取一定量的剑麻残渣,干燥后粉碎过100目筛,用60%乙醇超声提取3次后合并上清液干燥成粉.称取该粉末100 mg加入到25 m L具塞玻璃试管中,再加入6 mol·L-1的HCl 9 m L,置于90℃水浴中水解50 min,冷却后用6 mol·L-1的NaOH调节p H为中性,4 500 r· min-1离心15 min,弃上清液.分别向沉淀中加入沸程60～90℃的石油醚30 m L,分三步进行萃取,合并石油醚相,置于40℃旋转蒸发浓缩干燥.取一定量的麻膏,干燥后粉碎过100目筛,称取该粉末100 mg加水充分搅拌后置于80℃水浴中恒温2 h,4 500 r·min-1离心15 min,弃上清液,沉淀部分重复以上操作2次.分别向沉淀中加入沸程60～90℃的石油醚30 m L,分三步进行萃取,合并石油醚相,置于40℃旋转蒸发浓缩干燥.1．2．2 试剂的配制取一定质量的剑麻皂苷元标准品和自制样品,用无水乙醇配制成浓度为1 mg·mL-1的标准溶液和待测样溶液;取一定质量的鲁米诺固体,用0．1 mol·L-1的NaOH作为溶剂配制鲁米诺浓度为1．0×10-1mol·L-1;再取一定质量的K3Fe(CN)6固体,用去离子水作为溶剂配制K3Fe(CN)6浓度为1．6×10-1mol·L-1,以上均作为储备液备用.取一定质量的剑麻皂苷元标准品和自制样品,分别用甲醇配制成浓度为1 mg·m L-1的标准溶液和待测样溶液,以供HPLC使用.1．2．3 检测皂苷元条件的优化乙醇浓度：用0．1 mol·L-1NaOH作为溶剂稀释鲁米诺储备液至浓度为1．0×10-5mol·L-1,用去离子水作为溶剂稀释K3Fe(CN)6储备液至浓度为1．6×10-5mol·L-1,去离子水配置不同浓度的无水乙醇溶液进样,以去离子水为空白,将发光体系溶液以50～80 r·min-1的流速通过六通注射阀,注样时间10～25 s,各液混合,流入流通池检测其化学发光强度,记录数据.空白发光强度记录为Io,乙醇发光强度记为Is,抑光强度记为△I(△I＝Io－Is).上述测试过程均保持在35℃恒温下进行.鲁米诺浓度：用0．1 mol·L-1NaOH作为溶剂稀释鲁米诺储备液至不同浓度,用无水乙醇稀释标准剑麻皂苷元溶液浓度至0．5 mg·m L-1为待测样,以无水乙醇为空白,其它操作方法同上.K3Fe(CN)6浓度：用去离子水作为溶剂稀释K3Fe(CN)6储备液至不同浓度,用无水乙醇稀释标准剑麻皂苷元溶液浓度至0．5 mg·m L-1为待测样,以无水乙醇为空白,其它操作方法同上.1．2．4 制备皂苷元的标准曲线制备皂苷元的标准曲线(FI-CL法)：准确吸取1 mg·m L-1皂苷元标准液0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、0．7、0．8、0．9和1．0 m L分别置于10支10 m L容量瓶中,无水乙醇定容至刻度,充分摇匀,静置10 min.取上述溶液分别与1．0×10-5mol·L-1鲁米诺溶液、1．6×10-5mol·L-1K3Fe(CN)6溶液在流动注射化学发光仪上测试(无水乙醇为空白).以浓度为横坐标,发光强度为纵坐标作图,绘制标准曲线.制备皂苷元的标准曲线(HPLC法)(Zhouet al．,2012;方惠娟等,2012)：Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4．6 mm,5μm),ELSD-LTⅡ检测器,漂移管温度40℃,载气压力350 k Pa,柱温35℃,流动相为甲醇∶水＝90∶10(V/V),流速1．0 m L· min-1,进样量10μL,时间35 min.用甲醇作为溶剂稀释剑麻皂苷元标准溶液定容于容量瓶中,制成50、100、200、300、500、1 000和2 000μg·m L-1的不同溶液,分别进样,以浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标绘制标准曲线.1．2．5 检测皂苷元的回收率实验用无水乙醇为溶剂稀释自剑麻残渣中提取的皂苷元样品溶液溶度至0．1 mg·m L-1,作为加标试样.取浓度为0．1 mg· m L-1的标准剑麻皂苷元溶液0．5、1．0和1．5 m L,70℃烘干,分别加入加标试样溶液1 m L,进行流动注射化学发光检测(根据需要按相同比例增加体积).2．1 检测皂苷元条件的优化10%～40%的乙醇对发光体系的抑光强度是逐渐增强的,40%～100%的乙醇对发光体系的抑光强度是趋于平稳的,所以选择无水乙醇作为皂苷元的溶剂(图2).由图3和4可知,该发光体系检测皂苷元的最佳条件鲁米诺和K3Fe(CN)6的浓度分别为1．0×10-5mol·L-1和1．6×10-5mol·L-1.2．2 检测剑麻皂苷元的标准曲线流动注射化学发光法测得剑麻皂苷元标准曲线方程为y＝721．41x＋25．242,其中x以mg·m L-1计,浓度在0．1～1．0 mg·m L-1范围内具有良好的线性关系,R2＝0．9996(图5).HPLC法检测剑麻皂苷元的标准曲线方程为y＝6311x－73389,其中x以μg·m L-1计,浓度在50～2 000μg·m L-1范围,R2＝0．999 8.2．3 干扰试验剑麻皂苷元来源于剑麻叶片,在提取过程中共存其他组分,它们可能对该化学发光体系测定皂苷元有一定的影响.为此,研究了Na＋、Cl－、K＋、Br-、CO32－、SO42－、NO3－、Fe3＋、Ca2＋、Cu2＋、Mn2＋、和淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖以及葡萄糖等分别对100μg·m L-1的皂苷元进行干扰测定实验.结果表明,它们不干扰测定.2．4 剑麻皂苷元加标回收率实验剑麻皂苷元样品溶液中不同的加标量所测得的回收率分别为94．4%、96．8%和104．3%,相对标准偏差在2．9%～4．2%,均在误差允许范围内(表1).FI-CL方法检测的样品大部分易溶于水,极少部分微溶于水.如杨丹等(2006)、马艳等(2013)和Jianget al．(2013)在用该方法分别检测大豆异黄酮、黄体酮和穿心莲内酯时都是先用少量乙醇溶解再用去离子水定容,曾华金等(2013)在用该方法检测芦丁时用二甲基亚砜溶液(V(DMSO)∶V(H2O)＝1∶100)对芦丁片作预处理.本文选择了无水乙醇作为检测样品的溶剂,溶解性较好.首先,乙醇比水对Luminol-K3Fe(CN)6化学发光体系有很强的光抑制作用(图2);其次,当乙醇中溶解了一定质量的皂苷元时,这种光抑制作用会减弱(即反抑光强度)(图3,图4);最后,这种减弱的抑光强度与皂苷元的浓度在一定的范围内成正比(图5).FI-CL方法分别测定了剑麻残渣和麻膏中皂苷元的含量,同时与HPLC方法对样品检测结果进行比较可知(表2),该方法检测两种材料中皂苷元的结果与HPLC方法比较接近,HPLC方法的相对标准偏差较小更接近于实际值,两种方法相对标准偏差均在误差允许的范围内.麻膏中皂苷元的含量比剑麻残渣中皂苷元的含量高出近5倍,是因为麻膏来源于剑麻叶片经抽丝加工过程中压榨出的汁液,经长期自然发酵风干而成.FI-CL方法的优点是容易操作且检测时间短,可实现皂苷元工业化生产中的在线检测,极大地降低生产成本(Jianget al．, 2013);缺点是检测样品结果的稳定性和重现性稍差一些,稳定性和重现性由多种因素决定,比如光电倍增管的灵敏度、反应池前进液管路的长短以及环境的温度等.在实际操作中要尽量熟练,减小操作失误产生的误差.本文建立了流动注射Luminol-K3Fe(CN)6化学发光体系检测剑麻皂苷元的方法,并对检测条件进行了优化;无水乙醇作为皂苷元样品的溶剂可行,该方法为检测剑麻皂苷元提供了新技术及其理论依据;由于该方法检测一个样品可以在3～5 min内完成,所以可以实现样品的批量检测,缩短检测时间,以HPLC作为末端样品检测相结合,可应用于剑麻皂苷元的工业化生产在线检测和农业上的剑麻皂苷元高含量育种及栽培.吴立军,娄红祥,周晶．2011．天然药物化学[M]．北京：人民卫生出版社：350 Cui JF,Bjorkhem I,Eneroth P．1997．Gas chromatographic-mass spectrometric determination of 20(S)-protopanaxadiol and 20 (S)-protopanaxatriol for 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progesterone (流动注射化学发光法测定黄体酮)[J]．J Anal Sci(分析科学学报),29(1)：105－108Shangguan DH,Han HW,Zhao R,et al．2001．New method for high-performance liquid chromatographic separation and fluorescence detection of ginsenosides[J]．J Chromatogr A,910(2)：367－372Wan JB,Lai CM,Li SP,et al．2006．Simultaneous determination of nine saponins fromPanax notoginsengusing HPLC and pressurized liquid extraction[J]．J Pharm Biomed,41 (1)：274－279Wan JB(万建波),Li SP(李绍平),Jian JC(简家荣),et al．2004．Analysis of saponins fromPanax notoginsengusing pressurized solvent extraction coupled with high performance thin layer chromatography(加压溶剂提取-高效薄层扫描法测定三七中皂苷类成分)[J]．Chin J Nat Med(中国天然药物),2(4)：215－218Xuan WD(宣伟东),Chen HS(陈海生),Tan XQ(谭兴起),et al．2005．HPLC-ELSD method in determination of steroidal spaonin TTS-12 inTribulus terrestris(HPLC-ELSD法测定刺蒺藜中甾体皂苷TTS-12含量)[J]．Acad J Sec Mill Med Univ(第二军医大学学报),26(2)：222－223Yang D(杨丹),Cang J(苍晶),Hao ZB(郝再彬),et al．2006．Flow injection-chemiluminescence determination of soybean isoflavone(流动注射化学发光法测定大豆异黄酮)[J]．Chin J Anal Chem(分析化学),34(8)：1 113－1 115 Zhou LB,Cheng ZH,Chen DF．2012．Simultaneous determination of six steroidal saponins and one ecdysone inAsparagus filicinususing highperformance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection[J]．Acta Pharm Sin B,2 (3)：267－273Zeng HJ(曾华金),Liang HL(梁会丽),You J(游静),et al．2013．Simultaneous determination of ascorbic acid and rutin by flow-injection chemiluminescence method using partial least squares regression(偏最小二乘法结合流动注射化学发光法同时测定芦丁和维生素C)[J]．Chin J Lumin(发光学报),34(3)：369－374。
液质联用快速确定药物中的微量成分
被引用次数:1次
1.张玉峰基于液质联用技术的中药化学成分鉴定方法学研究[学位论文]2008
2.徐慧液质联用快速确定原料药中的微量成分及甘脲衍生物的质谱行为研究[学位论文]2007
3.赵亮液质联用在中药狼毒化学成分研究中的应用[学位论文]2007
4.郭少飞食品中药物残留的液质联用分析及应用研究[学位论文]2008
浙江大学理学院
硕士学位论文
液质联用位级别:硕士
专业:化学
指导教师:潘远江;孙翠荣
20060201
液质联用快速确定药物中的微量成分
作者:裴赛峰
5.刘晓帆液质联用技术应用于小柴胡汤药效物质基础研究[学位论文]2009
1.雷勇胜.宋丽明.蒋庆峰液质联用技术在药物的有关物质分析中的应用[期刊论文]-现代仪器 2011(4)本文链接:/Thesis_Y1175514.aspx
LC-MS／MS测定小鼠肾脏中甘草次酸的含量
LC-MS／MS测定小鼠肾脏中甘草次酸的含量封聪;霍韬光;王守云;张颖花;吴辉;姜泓【摘要】建立LC‐M S／M S测定小鼠肾脏中甘草次酸含量的方法。
本法以原儿茶酸为内标物质，采用多反应监测模式，对肾脏中甘草次酸进行定量研究。
结果所建方法灵敏、精确、快速、线性范围宽，可用于甘草次酸与雄黄联合用药小鼠肾脏中甘草次酸的含量测定。
%LC‐MS/MS method was established for the determination of glycyrrhetinic acid in kidney of mouse .Multiple reaction monitoring scanning mode was used for the quantification of glycyrrhetinic acid using protocatechuic acid as the internal standard .The method has the ad‐vantages of sensitive ,accurate ,rapid and a wide linear range .The method was successfully used for the quantification of glycyrrhetinic acid in kidney of mouse treated combination with glycyrrhetinic acid and realgar .【期刊名称】《化学研究》【年(卷),期】2016(027)003【总页数】5页(P318-322)【关键词】液相色谱质谱联用;甘草次酸;原儿茶酸;含量测定【作者】封聪;霍韬光;王守云;张颖花;吴辉;姜泓【作者单位】中国医科大学公共卫生学院，辽宁沈阳110122;中国医科大学公共卫生学院，辽宁沈阳110122;中国医科大学药学院，辽宁沈阳110122;中国医科大学公共卫生学院，辽宁沈阳110122;中国医科大学公共卫生学院，辽宁沈阳110122;中国医科大学公共卫生学院，辽宁沈阳110122【正文语种】中文【中图分类】R2860.2甘草次酸(glycyrrhetinic acid)是甘草的主要有效成分甘草酸及其盐(即甘草甜素)的代谢产物，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、免疫调节、保护肝细胞、抗氧化及肾上腺皮质激素样作用，具有明显增强肝肾的解毒功能和脑保护作用[1-3]. 近年来，对生物样品中甘草次酸含量测定方法的研究时有报道，但多集中在对血浆样品中甘草次酸含量测定上[4-6]，而有关组织样品中测定甘草次酸含量的方法少有报道. 本研究将采用二级质谱扫描的方法对肾脏中甘草次酸进行定量分析，并首次选用原儿茶酸作为内标物质，建立LC-MS/MS测定小鼠肾脏中甘草次酸含量的方法. 并将该法应用于甘草次酸对雄黄解毒的研究中，为甘草与雄黄配伍机制的研究提供理论依据和实验数据.1.1 仪器与试剂1290液相色谱-6420 三重串联四级杆质谱联用系统(美国，Agilent)，ER-182A 全自动电子天平(十万分之一) (日本A&D公司)；3K-18型超速低温冷冻离心机(Sigma公司)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)；Easypure纯水系统(美国，Barnstead公司). 甘草次酸(上海源叶生物科技有限公司)，原儿茶酸(中国药品生物制品检定所，809-9201)，甲醇(质谱纯，美国Sigma公司)，乙腈(质谱纯，美国Sigma公司).1.2 实验方法1.2.1 甘草次酸标准系列溶液和内标溶液的配制精密称取甘草次酸对照品适量，用甲醇溶解，得浓度为322.6 mg/L的甘草次酸储备液. 精密量取储备液适量，配成浓度为67.20、134.4、336.0、672.0、1 344、6 720 μg/L的系列标准对照溶液，4 ℃保存备用.精密称取原儿茶酸适量，用甲醇溶解，得浓度为920.0 μg/L的原儿茶酸储备液.临用前精密量取储备液适量，用甲醇稀释成浓度为184.0 μg/L溶液，作为内标溶液，4 ℃保存备用.1.2.2 色谱条件和质谱条件ZORBAX SB-C18色谱柱(Agilent 4.6 mm×100 mm，3.5 μm)，柱温30 ℃，流动相为乙腈-水(体积比80∶20)，流速为1 mL/min，进样量10 μL.电喷雾(ESI)离子源，负离子模式，扫描方式为多反应检测(MRM)，甘草次酸m/z为469.4→425.4，原儿茶酸m/z为153.1→109.1. 毛细管电压为3 500 V，离子源温度为330 ℃，甘草次酸和原儿茶酸的毛细管出口电压分别为200 V和100 V，碰撞电压(CE)分别为38 V和15 V；保护气流量10 L/min.1.2.3 样品溶液的制备精密称取肾脏组织200 mg，加入乙腈1.0 mL，超声破碎2 min，然后加入浓度为184 μg/L的原儿茶酸内标溶液200 μL，混匀，离心(4 ℃，12 000 r·min-1)10 min. 取上清液，浓缩至干，残渣以50 μL乙腈-水(体积比80∶20)复溶，离心5 min (4 ℃，12 000 r·min-1)，取上清液进样分析.1.2.4 应用SPF级雄性ICR小鼠50只，体重(20±2) g，均由中国医科大学实验动物部提供，标准饲料喂养，小鼠自由摄食及饮水，实验前适应性饲养1 w. 按照体重随机分为5组，每组10只. 第1组为对照组，灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液；第2组为雄黄对照组，灌胃给予雄黄1.35 g/kg；第3组为甘草次酸对照组，灌胃给予甘草次酸48 mg/kg；第4组为甘草次酸干预低剂量组灌胃给予甘草次酸(16 mg/kg)+雄黄(1.35 g/kg)；第5组为甘草次酸干预高剂量组灌胃给予甘草次酸(48 mg/kg)+雄黄(1.35 g/kg). 每日灌胃1次，连续8 w. 每隔3 d称量体重1次，调节灌胃容量. 于末次给药24 h后，无水乙醚麻醉，冰浴取小鼠肾脏组织，用冷0.9%生理盐水冲洗干净，待用.1.3 方法学考察1.3.1 专属性取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，除不加内标物质，按“1.2.3”项下依法操作；将一定浓度的甘草次酸和内标溶液加入混合肾组织匀浆液中，依同法操作；取雄黄对照组、甘草次酸对照组、甘草次酸联合用药低剂量组和联合用药高剂量组大鼠肾组织样品，依同法操作，进样10 μL，得色谱图.1.3.2 线性范围和标准曲线取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，分别加入甘草次酸系列对照品溶液和内标溶液各200 μL，得浓度为9.600、19.20、48.00、96.00、192.0、960.0 μg/L的甘草次酸肾组织样品，按“1.2.3”项操作处理，制备标准曲线. 以甘草次酸和内标物色谱峰面积比值为纵坐标，以甘草次酸浓度为横坐标，采用加权最小二乘法线性回归，求得回归方程.1.3.3 精密度和准确度按“1.3.2”项下操作，制备甘草次酸低、中、高三个浓度(50.00、250.0、800.0 μg/L)的质量控制(QC)样品，每一浓度样本平行制备5份，重复三个分析批，连续测定3 d，并与标准曲线同批测定，以当日的标准曲线计算QC样品的测定浓度，与配制的浓度对照，求得精密度和准确度.1.3.4 提取回收率取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，按“1.3.2”项下操作，制备甘草次酸低、中、高三个浓度(50、250、800 μg/L)的QC样品，每一浓度样本平行制备5份；另取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，除不加系列标准溶液和内标外，按“1.3.2”项下操作，向获得的残渣中加入内标溶液和相应浓度的标准系列溶液各200 μL，涡旋混合，浓缩至干，残渣用50 μL乙腈-水(体积比80∶20)复溶，离心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液进样分析，获得峰面积，以每一浓度两种处理方法的峰面积比计算甘草次酸和内标的提取回收率.1.3.5 样品稳定性取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，按“1.3.2”项下操作，制备甘草次酸低、中、高三个浓度(50、250、800 μg/L)的QC样品，每一浓度样本平行制备5份，分别考察样品经3次冷冻-解冻循环后(-20到20 ℃)、室温放置24 h及-20 ℃储存30 d的稳定性.1.3.6 基质效应取6只对照组小鼠混合肾组织匀浆液，除不加系列标准溶液和内标外，按“1.3.2”项下操作，向获得的残渣中加入内标溶液和相应浓度的标准系列溶液各200 μL，涡旋混合，浓缩至干，残渣用50 μL乙腈-水(体积比80∶20)复溶，离心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液进样分析. 另精密吸取低、中、高三个浓度的甘草次酸对照品溶液200 μL，加入内标溶液200 μL浓缩至干，残渣用50 μL乙腈-水(体积比80∶20)复溶，离心(4 ℃，12 000 r·min-1)5 min，取上清液进样分析，以每一浓度两种处理方法的峰面积比计算甘草次酸和内标的基质效应.1.4 统计分析所得数据以平均值±标准差表示，用SPSS 17.0软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行各指标组间差异的显著性检验，以P < 0.05作为检验的显著性差异.2.1 LC-MS/MS条件优化近年来，采用LC-MS测定甘草次酸含量的研究报道多采用一级质谱扫描方式进行测定[4]，这种扫描方式无法减小因生物基质效应给测定结果造成的干扰. 本研究采用电喷雾离子源，负离子扫描模式，扫描方式为多反应检测对肾脏中甘草次酸的含量进行测定. 在保证提高检测灵敏度、准确度的同时，可有效的减小生物基质效应给测定结果造成的干扰. 本研究对二级质谱扫描进行了优化，结果表明，甘草次酸m/z为469.4→425.4，原儿茶酸为153.1→109.1. 毛细管电压3 500 V，离子源温度330 ℃，甘草次酸和原儿茶酸的毛细管出口电压分别为200 V和100 V，碰撞电压(CE)分别为38 V和15 V；保护气流量10 L/min. 并对色谱条件进行了优化，结果表明，流动相为乙腈-水(体积比80∶20)，流速为1 mL/min，进样量10 μL. 2.2 内标物的选择及方法的专属性采用内标法测定甘草次酸含量时，有研究报道熊果酸、格列喹酮、泼尼松龙作为内标物质[4-6]. 根据内标物质的选择原则，本实验选择原儿茶酸、齐墩果酸、没食子酸为内标物进行比较，原儿茶酸的化学结构与甘草次酸类似，能完全溶解于待测组织匀浆液中，不与甘草次酸发生化学作用，并与甘草次酸色谱峰完全分离，甘草次酸和原儿茶酸的保留时间分别为3.265和0.897 min(见图1)，且甘草次酸m/z为469.4→425.4，原儿茶酸为153.1→109.1. 所选3种内标物中原儿茶酸响应最高，稳定性最好，所以选用原儿茶酸作为内标物. 目前，有关选用原儿茶酸作为甘草次酸含量测定的研究未见报道.在分析复杂的生物组织样品时，生物基质效应对测量结果的影响不容忽视. 由图1可见，小鼠肾脏组织中其他内源性物质不干扰甘草次酸和原儿茶酸的测定. 结果表明，该方法具有良好的专属性.2.3 标准曲线、精密度、准确度、回收率、稳定性及基质效应在优化的实验条件下，利用建立的LC-MS/MS联用系统进行分析. 甘草次酸回归方程为Y=0.123 03X+1.036 7(r=0.998 9)，结果表明，在9.600～960.0 μg/L范围内线性关系良好.精密度、准确度、回收率、稳定性与基质效应见表1. 实验证明，日内及日间精密度、准确度和回收率较好，并且基质效应不会对甘草次酸的含量测定结果造成影响.此外，对样品的稳定性进行了考察，结果在室温条件下稳定24 h，-20 ℃冰冻条件下稳定30 d，反复冻融3次均不影响样品中甘草次酸的含量.2.4 应用及讨论结果表明，甘草次酸对照组、甘草次酸联合用药低剂量组、甘草次酸联合用药高剂量组中甘草次酸的含量分别为(4 992.6±719.7) ng/g、(337.18±119.16) ng/g和(862.70±251.96) ng/g，对照组和雄黄组未检出甘草次酸. 甘草次酸高剂量组、甘草次酸对照组与甘草次酸低剂量组比较有统计学意义(P < 0.05).雄黄是含砷矿物药，雄黄及其制剂中含有大量砷[7-8]，在给予雄黄的大鼠血、脑及肾脏中均检测到砷[9-11]，而长期服用含雄黄制剂易引起药源性慢性砷中毒，造成肾脏损害[12-15]. 临床上，雄黄常与甘草配伍使用. 甘草为国老药，具有调和诸要的作用，对雄黄的毒性也有一定的解毒作用[16]. 本研究结果表明，甘草次酸干预后，肾脏中甘草次酸含量明显降低，可能与甘草次酸对雄黄的解毒作用有关，具体机制有待于进一步探讨.以原儿茶酸为内标物质，采用二级质谱扫描的方法建立了LC-MS/MS测定肾脏中甘草次酸含量的方法，该法具有较高的专属性、灵敏度、精密度、准确度和回收率，可用于甘草与雄黄配伍机制的研究.【相关文献】[1] TAIRA Z, YABE K, HANMAGUCHI Y, et al. 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HPLC-HG-AFS法测定雄黄中As(Ⅲ)的含量[J]. 化学研究, 2008,19(4): 67-69.[8] 张颖花, 霍韬光, 姜泓, 等. 高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法检测牛黄解毒片中的砷[J]. 化学研究, 2012, 23(4): 60-63.[9] 霍韬光, 畅蓓, 李维凯, 等. 雄黄染毒后大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的变化[J]. 化学研究, 2012, 23(2): 87-90.[10] 霍韬光, 杨卉蕾, 畅蓓, 等. 雄黄对大鼠脑组织能量代谢的影响[J]. 化学研究, 2012, 23(1): 53-55.[11] 张颖花, 高咏, 霍韬光, 等. 利用氢化物发生-冷阱捕集-原子吸收光谱联用技术测定雄黄染毒大鼠血中砷的含量[J]. 化学研究, 2013, 24(3): 274-276.[12] 苑洁, 霍韬光, 王艳蕾, 等. HG-FAAS法测定雄黄染毒小鼠肝及肾脏中的砷含量[J]. 化学研究, 2015, 26(1): 61-63.[13] 陈默, 苑洁, 霍韬光, 等. HPLC测定雄黄染毒小鼠血浆及肝脏中活性硫的含量[J]. 化学研究, 2016, 27(1): 81-84.[14] 梁爱华, 李春英, 王金华, 等. 雄黄的毒性研究[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(14): 1889-1894.[15] 李国明, 刘新清, 张雪艳, 等. 雄黄对小鼠肾脏形态学的影响[J]. 河北医药, 2002, 24(1): 60-60.[16] 董菊, 严晓鹰, 王明燕, 等. 牛黄解毒片配伍影响雄黄砷毒性的动物实验研究[J]. 时珍国医国药, 2014, 2(25): 317-319.。
高效液相色谱_电喷雾质谱法测定血浆中曲美他嗪浓度
高效液相色谱/电喷雾质谱法测定血浆中曲美他嗪浓度焦阳1苏明明1陈闽军31贾伟1陶萍2仇益群3黄仲义31(上海交通大学药学院,上海2002402(上海交通大学分析测试中心,上海2000303(上海市静安区中心医院,上海200040摘要建立了高效液相色谱/电喷雾质谱法(HP LC /ESI 2MS 测定人血浆中曲美他嗪浓度。
以利多卡因为内标,样品经甲醇沉淀蛋白,取上清液用三氟乙酸酸化后,50℃真空离心,浓缩至干,流动相溶解后进样。
色谱柱:W aters Xterra M S C18(150mm ×4.6mm,5μm ,柱温:40℃,流动相:pH 2.00的三氟乙酸溶液2甲醇(60∶40,V /V ,流速:0.6mL /m in;电喷雾离子源,四级杆质谱检测器,选择离子监控模式,检测离子的质核比分别是235(利多卡因和267(曲美他嗪。
曲美他嗪的线性范围为2.5~100μg/L,检出限2.5μg/L;日间、日内相对标准差均小于7%;相对回收率96.45%~103.03%,提取回收率72.45%~80147%。
关键词曲美他嗪,高效液相色谱2电喷雾质谱,血浆,药代动力学2006206228收稿;2006211214接受3E 2mail:cm j@sjtu .edu .cn1引言曲美他嗪(万爽力,Tri m etazidine 是临床治疗心肌能量代谢紊乱的有效药物之一[1],它能够选择性抑制线粒体β氧化32酮酰辅酶A 硫解酶的活性,将氧化代谢底物由脂肪酸转向葡萄糖,从而显著提高心脏三磷酸腺苷水平,起到保护缺血心肌细胞作用[2]。
血浆中曲美他嗪浓度的测定方法有高效液相色谱法(HP LC [3]、高效液相色谱荧光检测法(HP LC /F D [4]、气相色谱质谱联用法(GC /MS [5]和高效液相色谱/串联质谱联用法(HP LC /MS/MS [6,7]。
HP LC 的检测灵敏度很难满足临床药代动力学的要求;HP LC /F D 和GC /MS 法都需要衍生化,导致样品前处理繁琐,不利于大样本量检测。
高效液相色谱法同时测定槐花中芦丁、槲皮素和山柰酚的含量
高效液相色谱法同时测定槐花中芦丁、槲皮素和山柰酚的含量夏虹;彭茂民【摘要】建立了同时测定槐花中芦丁、槲皮素和山柰酚含量的高效液相色谱分析方法。
采用酸水解提取法和超声提取法提取槐花中芦丁、槲皮素和山柰酚。
结果表明，酸水解提取液中检测不到芦丁，槲皮素含量远大于超声提取液中的含量，加标回收率为93.6%~99.2%。
%A method was developed for the simultaneous determination of rutin,quereetin and kaempferol in flos sophorae by HPLC. Adopted the extraetion of aeid hydrolysis method and ultrasionie extraetion method. The result showed that the extraetion of aeid hydrolysis was not deteeted rutin,the eontent of quereetin mueh larger than the ultrasionie extraetion of eontent. The reeoveries were in the range of 93 . 6% ~99 . 2%.【期刊名称】《应用化工》【年(卷),期】2014(000)010【总页数】3页(P1919-1921)【关键词】槐花;芦丁;槲皮素;山柰酚;高效液相色谱法【作者】夏虹;彭茂民【作者单位】农业部食品质量监督检验测试中心，湖北武汉 430064;农业部食品质量监督检验测试中心，湖北武汉 430064【正文语种】中文【中图分类】TQ244.2;O657.7槐花为豆科植物槐的干燥花及花蕾，前者称“槐花”，后者称“槐米”，具有凉血止血、清肝泻火的功效［1］。
槐花中所含芦丁、槲皮素、山柰酚等黄酮类物质为其主要有效成分，现代研究认为芦丁具有降低毛细血管的异常通透性和脆性的作用，是心血管疾病制剂的主要成分;槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗菌、抗病毒等作用［2］;山柰酚具有抗癫痫、抗溃疡、解痉、利尿、止咳的功效。