bHGA对体外培养成骨细胞活性的影响

第35卷第2期中南民族大学学报（自然科学版）Vol．35No．22016年6月Journal of South-Central University for Nationalities （Nat．Sci．Edition ）Jun．2016收稿日期2015-12-09作者简介王朝元（1964-），男，教授，博士，研究方向：生物医学工程，E-mail ：wangchaoyuan@mail．scuec．edu．cn 基金项目湖北省自然科学基金资助项目（2013CFB450）bHGA 对体外培养成骨细胞活性的影响王朝元，刘亮亮（中南民族大学生命科学学院，武汉430074）摘要为探讨12b-羟基-去-D-杰氏山竹子素A （bHGA ）的体外潜在成骨活性，用bHGA 处理MC3T3-E1成骨细胞，研究了其对细胞碱性磷酸酶活性、矿化、骨相关基因表达及早期成骨分化相关基因表达水平的影响．结果表明：bHGA 处理细胞后，对Ｒunx2mＲNA 表达无显著影响，而对Osx mＲNA 的表达具有一定抑制作用．bHGA 能同时促进骨钙蛋白基因OCN 和Ⅰ型胶原Col 1mＲNA 的表达，但抑制碱性磷酸酶mＲNA 的表达，其对骨桥蛋白基因OPN mＲNA 的表达没有显著影响．说明bHGA 不利于骨早期分化，但它通过促进骨钙蛋白和I 型胶原mＲNA 的表达而促进骨成熟．关键词12b-羟基-去-D-杰氏山竹子素A ；成骨活性；骨相关基因；成骨分化相关基因中图分类号Q28文献标识码A文章编号1672-4321（2016）02-0031-05Effects of bHGA on Activity of Cultured Osteoblasts in vitroWang Chaoyuan ，Liu Liangliang（College of Life Sciences ，South-Central University for Nationalities ，Wuhan 430074，China ）AbstractTo study the potential osteogenetic activity of 12b-hydroxy-des-D-garcigerr in A （bHGA ）in vitro ，MC3T3-E1was treated with bHGA and the alkaline phosphatase activity ，mineralization ，the expression of bone-related genes and the early osteogenic differentiation-related genes of MC3T3-E1cells were measured．The results showed that the mＲNA expression of Ｒunx2was generally not affected by bHGA ，however ，it inhibited the mＲNA expression of Osx ．bHGA promoted the expression of OCN and Col 1but inhibited the mＲNA expression of APL．OPN expression was not affected by bHGA．Our study demonstrated that bHGA was not conductive to the early differentitation of bone ，while it might stimulate bone maturation by enhancing OCN and Col 1mＲNA expression．Keywords 12b-hydroxy-des-D-garcigerrin A ；osteogenic activity ；bone-related genes ；osteogenic differentiation-related genes人面果（Garcinia xanthochymus ）是我国的一种传统傣药，是藤黄科藤黄属植物，一般生长于海拔100 1000m 的丘陵、沟谷和潮湿的密林中，在我国其主要分布于云南省南部及西南部．作为传统中药，它具有清热退火，消肿止痛，活血化瘀的疗效，可用于跌打损伤，风湿关节疼痛的治疗［1］．它含有二苯甲酮衍生物、黄酮、三萜和口山酮类等化合物，其中一些化合物具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗糖尿病、抗菌、抗细胞毒素和抗HIV 病毒等［2］．12b-羟基-去-D-杰氏山竹子素A 为黄色无定形固体，是从傣药人面果中提取的药物小分子化合物，具有抗菌、抗肿瘤作用［3］，其成骨生物活性尚不清楚．本文通过对其进行了体外成骨活性的相关测试，为中药人面果临床上的应用奠定一定的理论基础．1材料和方法1．1材料和仪器小鼠原成骨细胞MC3T3-E1购自武汉大学典型培养物保藏中心，α-MEM 培养基（Thermo 赛默飞世尔生化制品有限公司），胎牛血清（杭州四季青公司），0．25%胰蛋白酶（Thermo ），Alamar Blue 试剂盒（北京泛博生物化学有限公司），碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物工程研究所），SYBＲGreen 荧光染料（日本TOYOBO 公司），反转录试剂盒（Thermo ）．细胞培养瓶，96孔、24孔、6孔培养板，酶联免疫分析仪（MULTISKAN ASCENT 354型，Thermo ），CO 2培养箱（HF90/240型，利康生物医疗科技控股集团），凝胶成像分析仪（JS-380A ，上海培清科技），荧光定量PCＲ仪（ABI7500Fast ，美国应用生物系统公司）．1．2bHGA 的结构从云南西双版纳收集的人面果中分离提取bHGA ，其分子结构见图1，分子量为442，通过NMＲ，质谱，HＲMS 数据鉴定得到［4］．图1bHGA 的分子结构Fig．1Molecular structure of bHGA1．3bHGA 储存液的配制将bHGA 溶于DMSO ，60ħ加热30min 助溶，制得初始浓度为16mM 的贮存液，保存在－20ħ备用．1．4细胞培养基基础培养基：10%胎牛血清的α-MEM 培养基加入100U /mL 青霉素和100mg /mL 链霉素．诱导培养基：在基础培养基中加入终溶度为50μg /mL 抗坏血酸、10－8mol /L 地塞米松、10mmol /L 的β-甘油磷酸钠．1．5bHGA 细胞毒性的测试用Alamar Blue 实验检测bHGA 对细胞存活率的影响［5］．MC3T3-E1细胞以1ˑ103/孔的密度接种于96孔板中，细胞粘附后换用含不同浓度bHGA 的诱导培养基（bHGA 终浓度分别为0，2，4，8，16μM ），每组设3个平行样，将培养板放置于37ħ，5%CO 2培养箱中培养0，24，72h ，每孔加入18μL 的Alamar Blue 试剂使其最终体积分数为10%，黑暗条件孵化4h ，用荧光酶标仪于540nm 检测光吸收值（激发光544nm ，发射光590nm ），以0．5%DMSO 为阴性对照．1．6bHGA 对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响将MC3T3-E1细胞按1ˑ104/孔接种于24孔板中，每孔加入2mL 诱导培养基．细胞粘附后，加入bHGA （终溶度为2，4，8μM ），每组设3个重复，含0．5%DMSO 诱导培养基作为阴性对照．培养细胞8d 、16d ，每孔加入600μL 的0．1%Triton PBS 裂解液，4ħ放置12h 裂解细胞，用碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性．1．7bHGA 对成骨细胞体外矿化的影响将MC3T3-E1细胞按7．5ˑ103/孔接种于48孔板中，分别加入含有3种不同浓度bHGA （bHGA 终浓度为2，4，8μM ）的诱导培养基，以含0．5%的DMSO作为阴性对照，每组设3个平行样，培养细胞没2 3d 更换一次培养基，分别培养8d 和16d 后，用PBS 将样品洗2次．室温条件下，加入－20ħ冰冷的甲醛固定细胞10min ，用dH 2O 洗2次，加入1%茜素红孵化10min ，用dH 2O 洗若干次后风干，置倒置显微镜下观察．为了定量测定细胞矿化，在每孔中加入10%的乙酸800μL ，室温放置30min ，间歇震荡．后用细胞刮刀刮下细胞，加入10%的醋酸，漩涡震荡30s ，再加入200 300μL 矿物油覆盖，加热至85ħ，10min ，转移至冰上5min ，20000r /min 离心15min．取每管上清液300 400μL 转移至新的1．5mL 的离心管中，加入体积分数为10%的氢氧化铵200μL 中和酸，取上清液150μL 转移至96孔板中于405nm 检测吸光值．1．8bHGA 对成骨细胞骨分化相关基因表达的影响将MC3T3-E1细胞按7．5ˑ103/孔接种于48孔板中，加入含有bHGA 的诱导培养基（bHGA 的终浓度为2，4，8μM ），每组3个重复，0．5%的DMSO 为阴性对照．培养8d 和16d ，收集细胞，用Trizol 法裂解细胞提取总ＲNA ［6］．按试剂盒说明书反转录成cDNA 第一条链．荧光定量PCＲ的引物［7］见表1，GAPDH 为内参基因．PCＲ循环参数如下：初始变性：95ħ，10min ；变性：95ħ，15s ；退火和延伸：60ħ，60s ；循环数：45．用软件SDS2．2．2处理数据，通过2-△△CT计算相关基因表达影响［8］．表1PCＲ引物序列Tab．1Primer sequences of PCＲ基因名称上游引物（5'-3'）下游引物（5'-3'）ALPGCTGATCATTCCCACGTTTT CTGGGCCTGGTAGTTGTTGTOPN CGATGATGATGACGATGGAG TGGCATCAGGATACTGTTCATC OCN AAGCAGGAGGGCAATAAGGT TTTGTAGGCGGTCTTCAAGC Col 1ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT BSP CAGAGGAGGCAAGCGTCACT CTGTCTGGGTGCCAACACTG Ｒunx2TCACTACCAGCCACCGAGAC ACGCCATAGTCCCTCCTTTT Osx ATGGCGTCCTCTCTGCTTGAG AGGACTGCCTGCAGGAGAGAG BMP2GCTCCACAAACGAGAAAAGC AGCAAGGGGAAAAGGACACT GAPDHAACTTTGGCATTGTGGAAGG ACACATTGGGGGTAGGAACA1．9统计分析采用t -检验法（student's t-test ）对实验数据进行显著性差异分析，置信度p 取值0．05．23中南民族大学学报（自然科学版）第35卷2结果与分析2．1bHGA 对细胞存活率的影响bHGA 对体外培养成骨细胞增殖的影响结果如图2．如图2所示，到第3d ，不同浓度bHGA （0 16μM ）与对照组相比，16μM 组对成骨细胞具有较强细胞毒性．故选定3种浓度（2，4，8μM ）用于后续细胞成骨活性实验．图2bHGA 对体外培养成骨细胞增殖的影响（n =3）Fig．2Effect of bHGA on osteoblast viability in vitro2．2bHGA 对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响bHGA 对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响结果见图3，如图3所示，与对照组相比，4μM 和8μM bHGA 处理8d 显著抑制了细胞内碱性磷酸酶的活性．但处理16d 后，3种浓度的bHGA 对细胞碱性磷酸酶活性无明显抑制．说明这些浓度的bHGA 对成骨细胞的碱性磷酸酶活性存在短期抑制作用．与对照比较，*p ＜0．05，n =3图3bHGA 对体外培养成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响Fig．3Effect of bHGA of different concentrations on osteoblast alkaline phosphatase activity in osteoblasts in vitro2．3bHGA 对体外培养成骨细胞基质矿化的影响2、4、8μM 三种浓度bHGA 处理细胞8d 后，所测A 405平均值分别为0．11、0．12、0．13，处理16d 后A 405平均值分别为1．13、0．98、1．0．其中对照组8d 和16d A 405平均值分别为0．11和1．10．三种浓度bHGA 处理结果与对照组相比，不存在显著性差异，未影响细胞外基质的矿化．2．4bHGA 对体外培养成骨细胞骨相关基因mＲNA 表达的影响骨生长期间，一系列骨相关基因的表达水平能反映出成骨细胞的成骨活性状况．本研究结果中，bHGA 对成骨细胞的碱性磷酸酶mＲNA 表达具有一定的抑制作用（见图4）．培养8d 和16d 后，各实验组的碱性磷酸酶mＲNA 均显著低于对照组（p ＜0．05，p ＜0．01，见图4a ）．bHGA 对成骨细胞的I 型胶原及骨钙蛋白mＲNA 表达均具有显著的促进作用（p ＜0．05，p ＜0．01），见图4b ，4d ）．bHGA 对骨桥蛋白mＲNA 的表达无显著影响（p ＞0．05，见图4c ）．bHGA 对成骨细胞骨涎蛋白mＲNA 表达则具有一定时间依赖性，长时间处理（16d ）可以促进其表达（p ＜0．05），短期处理（8d ）则无显著影响（p ＞0．05，见图4e ）．33第2期王朝元，等：bHGA 对体外培养成骨细胞活性的影响与对照组比较，*p＜0．05；＊＊p＜0．01，n=3a）碱性磷酸酶；b）骨钙蛋白；c）骨桥蛋白；d）I型胶原；e）骨涎蛋白图4bHGA对体外培养成骨细胞骨相关基因mＲNA表达的影响Fig．4Effect of bHGA on bone-related mＲNA expression in osteoblasts in vitro同时，研究了bHGA对早期成骨分化相关基因Ｒunx2、Osx及BMP2mＲNA的表达的影响（如图5）．bHGA对Ｒunx2mＲNA表达似乎没有影响（仅在高浓度bHGA长期处理是显示出一定的抑制作用，如图5a所示．与Ｒunx2不同，bHGA对Osx mＲNA表达具有显著的抑制作用，如图5b所示．bHGA对BMP2 mＲNA的影响具有一定的时间依赖性，2μM及4μM bHGA长期处理可以一定程度上提高BMP2的表达，如图5c所示．a）Ｒunx2；b）Osx；c）BMP2与对照组比较，*p＜0．05，＊＊p＜0．01，n=3图5bHGA对体外培养成骨细胞成骨分化相关基因表达的影响Fig．5Effect of bHGA on expression of osteogenic differentiaton-related genes in osteoblasts in vitro3讨论生物体内成骨细胞的发育分为3个阶段：前成骨细胞的分化阶段（Ｒunx2和Osterix参与），骨基质形成阶段（APL，Col1，OPN，OCN和BSP等参与）和骨基质矿化阶段．在骨细胞成熟阶段中，骨相关基因的表达对骨基质和骨基质钙化的形成起着关键性的作用［9，10］．Ｒunx2和Osx是早期骨原细胞分化为成骨细胞过程中的两个关键基因［11，12］．Ｒunx2通过结合到Osx基因的启动子上，促进MSC（间充质干细胞）表达Osterix，最终使MSC分化为前成骨细胞或骨细胞［13］．Osterix是一种成骨细胞特异性转录因子，它只在骨组织发育阶段和成骨细胞中表达［14］．本研究中，bHGA对Ｒunx2基因mＲNA表达影响不大，但是对Osx的表达具有一定的抑制作用，这表明bHGA是不利于充质干细胞分化形成早期成骨细胞，具体作用机制尚不明确．骨相关基因在骨基质形成过程中起着关键作用［15］．本研究发现，bHGA显著的促进I型胶原和骨钙蛋白的表达．I型胶原是骨的主要有机成分，骨钙蛋白也是成骨晚期表达的主要成分之一［16］．因此，bHGA对于成骨晚期具有显著的促进作用．43中南民族大学学报（自然科学版）第35卷碱性磷酸酶活性是早期成骨细胞的标志之一［17］，在成骨早期高度表达，随后会逐渐降低表达水平．在研究bHGA对碱性磷酸酶mＲNA表达的影响时发现，bHGA对碱性磷酸酶mＲNA具有显著的抑制作用，但bHGA对成骨细胞碱性磷酸酶活性无明显影响．说明bHGA可能通过调控碱性磷酸酶mＲNA表达之外的其他途径调控碱性磷酸酶活性．综上研究结果表明：bHGA对成骨的晚期，即骨基质的形成和钙化具有显著的促进作用，但是在其应用的早期会对基质干细胞向成骨细胞分化，以及成骨细胞早期的活性有一定的不利影响．参考文献［1］钟芳芳，傣药人面果树皮的化学成分与生物活性研究［D］．武汉：中南民族大学，2008．［2］林艳芳，依专，赵应红．中国傣医药彩色图谱［M］．昆明：云南民族出版社，2003：5．［3］Wu Yunhua，Yang Guangzhong．Interaction between garcigenrin and DNA by spectrophotometry and fluorescence spectroscopy［J］．Spectrosc 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