第二章 蛋白质的定性定量分析课件
第2章 第2节—蛋白质(共50张PPT)
判断某分子是不是构成生物体蛋白质的氨基酸
➢ 每个氨基酸至少有一个氨基(—NH2)和一个羧基(— COOH)；
➢ 并且都有一个氨基和羧基连在同一个碳原子上； ➢ R基不同，氨基酸不同
R基决定氨基酸的种类。
氨基酸的种类
氨基酸怎样构成蛋白质呢？
二、蛋白质的结构
氨基酸种类： 20种
CH3
丙氨酸
HO H2N－C－C－OH
CH2 CH CH3 CH3
亮氨酸
氨基酸分子的结构通式
把氨基酸当做一个人：躯干部=C，左手=羧基，右手=氨基，双脚=H，
头部=R基团
侧链基
R
团
氨基
羧
R
C基
NH2 C COOH
氨基
羧基
H
H
结构通式:
氨基 H O 羧基 NH2 C C OH
特点：
R 侧链基团
1、每种氨基酸至少有一个氨基(-NH2)和一个羧基 (-COOH)，并都有一个氨基和一个羧基连在同一个
课堂练习:
1、血液中的血红蛋白和肌肉中的肌蛋白结构不相同的原
因是
D
A.所含氨基酸种类不同； B.所含氨基酸数量不同；
C.所含氨基酸的排列顺序不同；
D.所含氨基酸种类、数目、排列顺序和蛋白质的空间结 构不同。
2.某种蛋白质由两条多肽链构成，共有肽键500个，缩
合成两条肽链的氨基酸分子数和生成的水分子数分别为
原子个数9512，相对分子质量64500。 食物中的蛋白质能否
被人体直接吸收?
不能，蛋白质必须经过消化，成为各种氨基酸，才能被人体吸收和利用。 也就是说，氨基酸是组成蛋白质的基本单位。
一、蛋白质的基本组成单位
蛋白质定性
百泰派克生物科技
蛋白质定性
蛋白质定性分析是根据蛋白质相关性质对蛋白质的种类进行分析，定性蛋白质组学指在组学水平上进行蛋白质定性分析。
百泰派克生物科技提供蛋白质定性分析以及蛋白质组学定性分析服务。
蛋白质定性分析
蛋白质定性，指通过非量化的手段分析蛋白质性质以确定蛋白质的种类。
蛋白质分子非常复杂，与其性质相关的特征参数有很多，包括蛋白质的分子量、等电点、氨基酸序列（一级结构）、高级结构、以及蛋白质间的相互作用等等。
利用蛋白质的这些性质参数，可以借助相关的仪器设备进行蛋白质定性分析。
蛋白质定性的常见方法包括有电泳（如SDS-PAGE）、层析、ELISA、western blot、图像分析技术、测序（如基于Edman降解的N端测序）以及质谱法等。
蛋白质定性检测有助于推断蛋白质的功能和作用机理，且在对蛋白质进行定量之前可先进行定性分析。
蛋白质定性。
蛋白质组学定性分析
蛋白质组学定性分析指在组学水平上对蛋白质进行定性分析，也称为定性蛋白质组学。
定性蛋白质组学研究的方法有多种，其中基于质谱的方法是蛋白质组定性检测的主要方法之一。
质谱可以通过分子量测定、N/C端测序、全序列分析以及翻译后修饰分析等大规模、高通量地进行蛋白质组定性。
蛋白质的定量和定性分析方法
蛋白质的定量和定性分析方法蛋白质是生物体内最重要的功能分子之一，对于研究生物体的结构和功能具有重要意义。
为了准确地了解蛋白质的含量和性质，在科学研究和实际应用中，我们需要使用定量和定性分析的方法来研究蛋白质。
一、定量分析方法1. 低里德伯法（Lowry method）低里德伯法是一种经典而广泛应用的蛋白质定量方法。
该方法利用蛋白质与碱式铜络合物在碱性条件下反应生成蓝色产物，通过比色法测定溶液的吸光度来计算蛋白质含量。
这是一种灵敏且相对简单的方法，适用于大多数蛋白质样品的定量分析。
2. 比色法（Colorimetric assay）比色法是一种常用的蛋白质定量方法，通过蛋白质与染料的结合来测定蛋白质浓度。
常用的染料有布拉德福蓝（Bradford）、库吉铃蓝（Coomassie Brilliant Blue）、BCA法（Bicinchoninic Acid assay）等。
这些染料与蛋白质结合后形成一种复色物，通过比色法测定溶液的吸光度可以定量分析蛋白质。
比色法具有操作简便、灵敏度高等特点，被广泛应用于蛋白质定量领域。
3. 分子标记法（Molecular tagging method）分子标记法是一种新兴的蛋白质定量方法，利用特定的分子标记物（如荧光染料、放射性示踪剂等）标记蛋白质，然后通过测定标记物的荧光强度或放射性信号来计算蛋白质浓度。
分子标记法具有高灵敏度、高特异性等优点，适用于微量蛋白质的定量测定。
二、定性分析方法1. SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定性分析方法，通过电泳将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中分离出来。
在电泳过程中，蛋白质在SDS（十二烷基硫酸钠）的作用下具有相同的电荷密度，只受到大小的限制而移动。
蛋白质在凝胶中的分离程度取决于其分子量大小，可以通过对比标准品的迁移距离来估计样品中蛋白质的相对分子量。
蛋白质的定量测定方法PPT课件
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下 测定其光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中 查出样品溶液的蛋白质含量。
第8页/共24页
【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
蛋白质染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定 的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2 分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便，快速，灵敏 度 高 ， 稳 定 性 好 ， 是 一 种 测 定 蛋第白20质页/含共量24页的 常 用 方 法 。
【实验材料】
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升 Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值 。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量。
第5页/共24页
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白
质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最
பைடு நூலகம்
广泛的方法之一。
第2页/共24页
【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于／L氢氧化钠溶液中，再把 硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后 将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
蛋白质组学定量研究常见方法-PPT课件
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1：双向电泳
基于2D-PAGE 的经典定量分 析方法。 1、样品准备 和定量：抽提 对照组和各种 不同实验组的 蛋白质。 2、蛋白质分 离：蛋白质经 过2D-PAGE分离 后染色（银染、 考染等）。 3、蛋白质的 定性与定量分 析：通过与对 照组相Image Master 7.0分 析出实验组中 差异点，质谱 鉴定差异点蛋 白质,同时应用 软件分析出其 表达量的变化。
4：化学标记法—ICAT
ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子 的空间位阻 （3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每 个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特 异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4） ICAT分子量相对较大（约500Da），这对小肽而言是一个较大的修饰 物，会增加数据库搜索的复杂性 （5）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造 成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （6）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生β -消除反应 使部分标签断裂。
蛋白质组学定量研究常见方法
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蛋白质组学定量研究常见方法
1：常规双向电泳 2：DIGE 3：15N等同位素标记 4：ICAT 5：iTRAQ 6：SILAC
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蛋白质组定性定量分析
蛋白质组定性定量分析
质谱技术用于蛋白质组学研究，可以进行蛋白质组定性定量分析。
在基于质谱的蛋白质组学分析中，可对样品中的蛋白质进行定性分析，也可对样品中的蛋白质进行定量分析。
百泰派克生物科技提供基于质谱的蛋白质组定性定量分析服务。
蛋白质组定性定量分析
在介绍蛋白质组学定性定量分析之前，先简单介绍一下蛋白质定量检测和定性检测的区别。
蛋白质定性分析是对样品中蛋白质的种类进行分析确定，蛋白质定量分析是对样品中蛋白质的含量进行分析确定。
在对样品中的蛋白质进行定量分析之前，一般可先进行定性分析。
蛋白质组定性定量分析是从整体水平上对样品中的蛋白质进行定性和定量分析，在定量蛋白质组分析中包括蛋白质组的定性。
蛋白质组定性定量分析。
蛋白质组定性定量分析方法
蛋白质组定性定量分析的方法包括有电泳技术、色谱技术、蛋白质芯片技术、核磁共振和质谱技术等。
其中质谱技术作为当前蛋白质组学研究的主要技术之一，即可用于蛋白质组定性分析，也可用于蛋白质组定量分析。
基于质谱的蛋白质组定性分
析可以分析蛋白质组的肽质量指纹图谱、氨基酸序列、翻译后修饰情况。
基于质谱的蛋白质组定量分析可以实现蛋白质组的相对定量和绝对定量。
第二章蛋白质的定性定量分析【共54张PPT】
2. SDS-PAGE凝胶的制备
制备分离胶
制备浓缩胶
装板
加样
电泳
卸板并进行凝胶染色
3. SDS-PAGE基本原理
➢ 影响迁移率的因素
➢ SDS 十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate )
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大 于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的 电荷差异
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。
对各种纯化蛋白质反应不同
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定
SDS与蛋白质之间的结合程度
SDS-PAGE基本原理
封闭非特异结合位点 注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；
Watch SDS-PAGE原理
Watch SDS-PAGE原理
80-100 ug/cm2
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白
+
pH 3
pH 7.5
Isoelectric Focusing
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
3–10
3–10NL 4–7 3–6
5–8
7–10
ReadyStripTM IPG Strips
蛋白质定性定量分析课件.ppt
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蛋白质定性定量分析课件
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免疫印迹技术的基本操作(例PKC)
1、细胞裂解物的制备 2、细胞裂解液蛋白含量测定 3、细胞裂解物SDS－PAGE电泳 4、蛋白质转膜 5、目的蛋白的检测
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Ve＝K1－K2logMr
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方法的局限性： 1、在pH6～8的范围内，直线关系比 较好，在极端pH时因蛋白质变性而引 起偏离； 2、分子量与分配系数Kav有关，当蛋 白质的轴比较大时，会引起测定偏离；
蛋白质的含量测定
凯氏定氮法：1883年丹麦化学家 Kjeldhl建立，经后人改良后形成的一 种定量测定蛋白质最为精确、敏感的 方法。 原理：蛋白质的含氮量为16％，只要 测出样品中氮的含量，即可计算出蛋 白质的含量
样品中蛋白质的含量＝N×6.25
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蛋白质定性定量分析课件
1
凯氏定氮的基本流程： 1、消化：生物样品与浓硫酸共煮， 样品蛋白质被无机化，其中氮元素
蛋白质的测定PPT课件
杜马斯法（燃烧法）
样品在高温下（700-800℃）燃烧，释放的氮 气由带热导检测器（TCD)的气相色谱仪测定。 测得的含氮量转换成样品中的蛋白质含量。
几种蛋白质测定方法比较
原理 装置 溶剂
时间 灵敏 度 干扰
凯式定氮法 双缩脲
总氮量
蛋白氮
凯式定氮装置 分光光度计
浓硫酸
用量较少
长
较低
简单快速 低
较小
▪ Y为标准曲线查得蛋白质得浓度（mg/ml） ▪ N为稀释倍数 ▪ c为样品原浓度（mg/ml）。
福林-酚法（双缩脲法的发展）
▪ 两步反应
(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋 白质—铜络合物。
(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(Ｆolin试剂) 还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物) 。
0.0 4.0
A540
取两组测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋 白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定
取4支试管分成两组，按下表平行操作：
0Байду номын сангаас
1
样品稀释液/ml
0.5
蒸馏水/ml
1.0
0.5
双缩脲试剂/ml
4.0
4.0
A540
3、计算
▪ 取两组测定的平均值计算：
固体样品蛋白质的含量(%) Y N 100% c
第四节 氨基酸定量测定
一、甲醛滴定法
氨基酸本身有碱性-NH2基，又有酸性COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后， 与-NH2结合，碱性消失，再用强碱来滴定 -COOH基。
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法 利用特定氨基酸残基法
蛋白质定性、定量分析
蛋白质定性、定量分析蛋白质定性定量分析（图片来源：百泰派克生物科技）蛋白质定性、定量分析随着质谱技术的飞速发展，利用质谱技术进行蛋白质（组）的定性和定量分析得到更为广泛的应用和研究。
1. 蛋白质定性分析：确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质。
蛋白质定性分析通常是指利用质谱法进行蛋白质鉴定和序列分析。
蛋白质定性分析分为top-down分析和bottom-up分析两种策略。
目前，bottom-up分析策略被更广泛的应用于蛋白质定性分析工作。
Bottom-Up（自底向上）和Top-Down（自顶向下）两种策略“自底向上”策略是指通过分析由蛋白质酶解生成的肽段来鉴定蛋白质。
当应用该策略来分析蛋白质组混合物时，因其类似于基因组测序的鸟枪法，所以又被称为鸟枪法蛋白质组学（Shot-gun Proteomics)。
“自顶向下”策略直接鉴定完整蛋白质，在翻译后修饰和蛋白质同素异构体鉴定方面有一些潜在的优势。
可是该策略的缺陷是蛋白质在气相中分离、电离及碎裂都十分困难。
而鸟枪法蛋白质组学由于将蛋白质酶解成肽段，使其在气相中更容易被分离、电离和碎裂。
2. 蛋白质定量分析：确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量。
蛋白质相对定量分析相对定量的目的是测定目的蛋白在两个或多个样本中的表达量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的表达量。
例如，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本做为对照组，经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的蛋白含量相对于对照组样品的百分比。
蛋白质绝对定量分析目前基于质谱的绝对定量蛋白质组学研究主要是指靶向蛋白质组学。
靶向蛋白质组学分析，是指对目标蛋白质（或修饰肽段）进行定性和/或定量分析，或者用于验证大规模蛋白质组学的结果。
基于质谱的靶向蛋白质组学分析方法，由于没有物种限制并具备多目标同时分析能力等优势，受到越来越多的关注和应用。
蛋白质质谱定性定量
百泰派克生物科技
蛋白质质谱定性定量
对蛋白质进行定性定量鉴定即对目标蛋白的种类和含量进行鉴定是蛋白质组学研究中最基本的研究内容。
质谱技术是目前常用的蛋白质组学分析技术，它基于蛋白肽段离子的质荷比（m/z）和离子峰强度信息可实现蛋白质的定性和定量鉴定。
在质谱分析中，蛋白质先被酶解消化为小分子的肽段，小分子肽段在离子源中电离成肽段母离子，再利用质量分析器检测肽段母离子的质荷比和离子峰强度。
将肽段离子的质荷比数据与理论数据库进行比较、匹配可以确定其分子质量，进而获得该肽段的氨基酸组成，通过各肽段之间的拼接最后确定完整蛋白的分子量和氨基酸组成信息以实现定性鉴定。
肽段母离子的浓度与样品量成正相关，样品量越多，其产生的肽段离子就越多，相应的离子峰信号强度就越大，因此可以利用离子峰信号强度进行蛋白的含量测定。
若引入已知浓度的标准品（内标肽）还可以对蛋白进行精确的含量测定。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台结合Nano-LC色谱，提供快速高效的蛋白质质谱定性定量鉴定服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的细胞寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括细胞培养、细胞标记、蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析，欢迎免费咨询。
蛋白质的测定课件参考.ppt
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
原 理
在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与
Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。
而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成
稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的
光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，
可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量
优 点
• 终产物稳定
• 检测敏感性高
缺 点 •巯基试剂和去垢剂干扰 • 蛋白质发生不可逆的变性
蛋白质的免疫印迹分析 (western blot)
第一章 蛋白质的含量测定
蛋白质的含量测定
基于蛋白质的 基于蛋白质的 基于蛋白质的 元素组成特点 化学显色反应 光吸收特性
蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％
由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此
只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据
标准品的选择及处理 待测样品的制备 电泳分离及染色 相对迁移率的计算
Watch SDS-PAGE操作
Analysis for SDS-PAGE electrophoresis
5. 注意事项
选择合适的胶浓度 SDS与蛋白质之间的结合程度
二硫键是否完全被还原 溶液中SDS的浓度 溶液的离子强度
二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量
1. 基本原理
分子筛效应 洗脱体积与相应分子量的关系
2. 凝胶过滤测定分子量的操作
装柱 平衡 加样 平衡 洗脱
收集样品并计算Ve
绘制标准曲线
3. 注意事项
柱床表面不能干燥
Sephadex 溶胀 凝胶的选择 G值的意义
凝胶柱的再生与保存
• 光密度范围
二、考马斯亮蓝G-250检测法
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定 溶液中蛋白质含量的方法
原 理
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种 不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条 件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，
产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物
在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液
一、免疫印迹分析的应用
对蛋白质进行定性分析 对蛋白质进行半定量分析 信号转导分析
生物大分子相互作用分析
二、免疫印迹分析的基本流程
制备蛋白样品 电泳分离蛋白 转移至固相膜 蛋白质转移
封闭非特异结合位点 与第一抗体温育反应 与第二抗体交联物温育反应 显色
抗体检测Βιβλιοθήκη 疫印迹操作流程图1. 样品的制备
–
pH 10
Isoelectric Focusing
ReadyStrip IPG Strips
3–10 3–10NL 4–7 3–6 5–8 7–10 3.9–5.1 4.7–5.9 5.5-6.7 6.3-8.3
TM
High-purity monomers Narrow ranges for resolution of low-abundance proteins Overlapping gradients for “cyber gels” Three lengths --- 7 cm, 11 cm and 17 cm --- 0.5 mm x 3.3 mm
显色
— AKP可催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸
(bromochloroindolyl phosphate，BCIP)与氮蓝四唑 (niro-blue tetrazolium，NBT)发生反应，产生深蓝 色化合物，显示出蛋白质所在的位置。 — HRP可催化底物显色生成棕色化合物，显
示出蛋白质所在的位置
组织或细胞中提取
裂解
去污剂 (SDS、Triton X-100、NP-40、Tween-20)
蛋白酶抑制剂 (PMSF、EDTA、Pepstatin、
Leupeptin、Aprotinin)
蛋白质的定量 (Bradford、BCA、Lowry)
基因工程表达重组产物
2. 电泳分离
SDS-PAGE
卸板并进行凝胶染色
3. SDS-PAGE基本原理
影响迁移率的因素
SDS
十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate )
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大 于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带 负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成 的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电 荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异
• 若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确
三、Lowry检测法
这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已
得到广泛应用.
原 理
首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然 后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色， 这种深蓝色的复合物在745 ～750 nm处有最大 的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度 成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算 蛋白质的含量
1975年，Edwen Southern提出了分子印 迹(渍)的概念
目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA
和蛋白质的检测
印迹技术的类别及应用
DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析 RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析 蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究 由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为 免疫印迹技术 (immunoblotting)
Watch procedure
四、免疫印迹注意事项
SDS-PAGE凝胶的浓度 膜的选择 电转移（方向、电流、转移效率） 充分封闭和洗膜 抗体的使用（稀释比例、分装） 免疫检测（显色）
闭 ，防止抗体非特异性结合在膜上，
降低背景颜色
BSA、脱脂奶粉
靶蛋白与第一抗体反应 — 单抗、多抗 注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对
照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；阳
性对照可用已知靶蛋白等 作用：排除假象
与第二抗体反应
第二抗体一般是针对第一抗体的免疫球蛋 白，可用同位素或非同位素物质进行标记 酶标抗体常用酶： 碱性磷酸酶( alkaline phosphatase，AKP ) 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP) 胶体金标记、125I标记标记
第三节
等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点
等电点 (isoelectric point, pI)
两性电解质性质 支持介质 (supporting media) Figure of IEF
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
优 缺
点 • 一种可靠的蛋白质定量方法 • 不同蛋白质之间差别很小 点 • 干扰物质多 • 某些试剂不稳定 • 使蛋白质发生不可逆变性
计算方法 • 标准曲线法
注意事项 • 在加入试剂30 min后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱
• 许多干扰物质降低颜色反应
• 高盐浓度可引起沉淀
四、BCA (二喹啉甲酸)检测法 这是近年来新研制的一种改进的Lowry 测定法
芳香族氨基酸的紫外吸收
优
点
• 快速 • 对蛋白质无破坏性 • 不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液 • 核酸可引起强干扰作用 •芳香族氨基酸含量差异可以 起误差
缺
点
计算方法 • 标准曲线法 • 蛋白质浓度 (mg/ml) =1.45×A280-0.74×A260 注意事项 • 石英比色杯 • 调零所用溶液 • 配制标准蛋白所用溶液
第二节 蛋白质相对分子量测定
分子量测定 (molecular weight, MW)
质谱 (ESI-MS) 沉降平衡超速离心 排阻层析 动态弹性光散射 孔径梯度电泳
一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量 1. 不连续系统原理 2. SDS-PAGE凝胶的制备 制备分离胶 加样 电泳 制备浓缩胶 装板
非变性PAGE
EIF
3. 蛋白质的电转移
作用：将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维 素膜上 注意：在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺 凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间 不能有任何气泡 ！？ 方法：半干法、湿法
常用的蛋白质转移膜
种类
NC膜 PVDF膜
微孔大小
0.45 um 0.22 um
结合能力
以下公式推算出蛋白质的大致含量：
100克样品中蛋白质的含量 ( g % )
= 每克样品含氮克数× 6.25×100
1/16%
一、紫外光谱 (A280)吸收法
这一方法可用来快速检测溶液中是否含有 蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋 白质的洗脱峰
原 理
色氨酸、酪氨酸的最 大吸收峰在280 nm附近 大多数蛋白质含有这两 种氨基酸残基，所以测定 蛋白质溶液280 nm的光吸 收值是分析溶液中蛋白质 含量的快速简便的方法
中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光
吸收值大小计算蛋白的含量
所需时间 • 10 min
优 缺 点 点
• 快速（反应时间仅需2 min） • 敏感，几乎没有蛋白质损失 • 对各种纯化蛋白质反应不同