禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究
禽流感的流行特点和检测技术
中国动物保健2021.06禽流感（avian influenza ，AI ）的潜伏期一般较短，通常为4～5d 。
发病时精神沉郁，食欲、饮欲降低甚至废绝，被毛散乱，体温升高，趴卧不动，偶有流泪。
头部、面部水肿，脚鳞发紫出血，肉垂和鸡冠呈干枯紫色，甚至坏死。
呼吸困难，咳嗽，听诊呈啰音；下痢，粪便呈淡黄或白色。
出现神经症状，共济失调，不能站立或行走。
并且该病为人畜共患病，处理不好不但会危害养禽业的经济发展，还会危害人类身体健康。
1禽流感的流行病学特点1.1传染源主要由感染或携带禽流感病毒的鸡、鸭、鹅等家禽，野外野生鸟类，特别是迁徙性水禽相互传染所致。
1.2传播途径主要通过病禽的分泌物、排泄物、尸体，污染的饮水、饲料和其他物体，直接或间接接触引发感染，主要感染途径为呼吸道和消化道，以及直接接触病毒毒株感染。
人工接种可通过气溶胶经口鼻内、气管内、眼结膜、腹腔、肌肉、静脉和泄殖腔内等途径使易感禽类感染。
1.3易感动物禽流感病毒在世界范围内广泛分布。
许多家禽、野禽、人类、特别是鸭等迁徙水禽，发生病毒感染的概率比其他禽类高，而家养的鸡和火鸡所发生的流感最为严重。
1.4特点多为大流行，世界范围流行。
过去呈三年小流行，五年大流行。
该病主要在寒流较多，气温变化大的秋冬、冬春交替季节流行。
2禽流感的检测技术2.1血清学诊断技术中和试验中和试验的操作步骤复杂，容易造成材料的浪费，临床上不常用，但其为最原始的病毒检测技术，常用来做标准与其他检测方法作比较。
本试验常用鸡胚或组织培养细胞作为样本鉴定禽流感病毒。
中和试验是具有高度的灵敏性和特异性的血清学方法，抗体只和病毒上表面抗原相对应，特别是已吸附的宿主细胞上的病毒颗粒表面的抗原相对应。
所以，在某种特定血清型的中和实验中，抗体只和组内的其他病原发生有限的交叉反应。
琼脂扩散试验琼脂扩散试验检测禽流感时，以具有血凝素活性的鸡胚尿囊液作为样品，采用已知的阳性血清和未知抗原进行病毒抗原型的特异性鉴定。
禽流感病毒H5N1的重组酶介导检测方法学研究
CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY禽流感病毒H5N4的重组酶介导检测方法学研究陈淑丹I廖静I王玲I罗鹏I郭利川2郑伟广吴忠华I应清界2摘要采用逆转录-重组酶介导核酸扩增技术(Reverse Transcription Recombinase-aided amplification,RT-RAA)建立检测禽流感病毒H5N1的快速方法，根据禽流感病毒H5N1保守序列设计引物及探针，将H5N1RNA逆转录为cDNA,然后以cDNA作模板.扩增检测病毒核酸序列本研究构建了带有H5N1核酸序列的质粒，以此为模板检测不同浓度的质粒.分析该方法的灵敏度，对已知样本进行检测来验证方法的特异性.设计的H5N1特异性引物和探针，能在3『C恒温下，10-30min可有效扩增岀相应病毒的核酸.与其他流感病毒无交叉反应；对质粒的检测灵敏度可达10拷贝建立的RT-RAA检测禽流感病毒H5N1方法灵敏度和特异性均较髙.且该方法操作简单，适用于禽流感病毒H5N1的快速检测关键词禽流感病毒H5N1；逆转录-重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)；分子检测Rapid Detection of H5N1Avian Influenza Virus Based onRAA Fluoresce n ee AssayCHEN Shu-Dan1LIAO Jing1WANG Ling1LUO Peng1GUO Li-Chuan*12ZHENG Wei1,WU Zhong-Hua1YING Qing-Jie2Abstract A quick assay of detecting H5N1avian influenza virus was established through reverse transcription recombinase-aided amplification assay(RT-RAA).H5N1avian influenza virus RNA was transcribed into the cDNA by a reverse-transcription reaction,which served as template for RAA amplification.We design universal primer and probe according to the conserved nucleic acid sequence of H5N1virus.Then constructed plasmid and clinical samples were used to evaluate the specificity and sensitivity of the method.The results showed that nucleic acids of H5N1could be well amplified with specific primer and probe,while nucleic acids of other viruses had negative amplification results.The whole reaction was completed within30minutes under constant temperature of 39°C.The study indicates that the RT-RAA method is very sensitive and able to detect10copies.The established RT-RAA assay had high sensitivity and specificity,ready-to-hand for rapid detection of H5N1avian influenza virus.Keywords H5N1avian influenza virus；reverse transcription recombinase-aided amplification(RT-RAA)；molecular detectio n基金项目:海关总署科研项目(2019HK139)通讯作者：郑伟(1979-),男，汉族，杭州人，博士，主任医师.主要从事口岸病原体检测工作，E-mail：*************** 1•杭州国际旅行卫生保健中心(杭州海关口岸门诊部)杭州3100122.江苏奇天基因生物科技有限公司无锡2141351.Hangzhou Intemationai Travel Healthcare Center(Hangzhou Customs Port Outpatient Departments),Hangzhou3100122.Jiangsu Qitian Gene Bio-Sci&Tech Co.Ltd,Wuxi2141354中国口岸科学技术禽流感病毒可通过空气传播，引起急性呼吸道感染高致病性禽流感H5N1曾在亚洲、欧洲和非洲引起大量家禽的流感暴发野生鸟类包括海鸟、海鸥和家鸭被认为是病毒的天然宿主。
《禽流感病毒ELISA抗体检测技术规范》标准文本
禽流感病毒ELISA抗体检测技术规范前言本标准按GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。
本标准的附录A为规范性附录。
本标准起草单位：贵州省动物疫病预防控制中心。
本标准由贵州省动物疫病预防控制中心提出并归口。
本标准主要起草人：刘霞、王慧、李照伟、孙鹃、倪兴维、张霞、蒲同灿、汪忠荣。
禽流感病毒ELISA抗体检测技术规范1 范围本标准规定了禽流感病毒H5亚型、H7亚型抗体的竞争ELISA检测方法。
本标准适用于检测免疫的鸡、鸭、鹅等禽类血清中H5亚型或H7亚型禽流感病毒的抗体水平。
2 缩略语下列缩略语适用于本文件。
ELISA 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent test）OD4500nm值 450纳米波长处的吸光值3实验原理本标准采用竞争酶联免疫吸附法（竞争ELISA），该方法利用抗原抗体反应具有特异性的特点，将特异性的H7亚型（或H5亚型）禽流感病毒血凝抑制试验抗原吸附到固相载体的表面，将待检血清和特异性酶标单抗同时加入包被板孔。
待检血清中的抗体与酶标单抗竞争与包被抗原结合，因此，待检血清中抗体越多结合在包被抗原上的酶标单抗就越少，阳性血清反应呈色浅于阴性血清。
4 材料准备4.1 试剂见附录A。
4.2 仪器与器材酶标检测仪、台式低温高速离心机、37℃恒温培养箱、冰箱、微量移液器及配套洗头等。
4.3 样品动物血清或动物全血（待血液充分凝固后，4000r/min离心10分钟，收集上清），要求血清清亮，无溶血。
5 实验方法5.1 包被用包被液将包被抗原稀释至工作浓度（2μg/ml）加至抗原包被板中100μl/孔，置37℃下温育45分钟（或2℃～8℃包被15小时）。
5.2 封闭弃去包被液，每孔加入封闭液200μl，置37℃ 2小时；拍干，再置37℃干燥2小时。
5.3 1×洗涤液的配制使用前，将20倍浓缩洗涤液恢复至室温（15℃～25℃）并摇动使沉淀溶解（最好在37℃水浴锅中加热5～10分钟），然后用去离子水作20倍稀释（例如30ml 20倍浓缩洗涤液加上570ml去离子水），混匀，稀释好的洗涤液在2℃～8℃下存放7日。
禽流感病毒重组核蛋白抗原的纯化及在琼脂免疫扩散试验中的应用
中 国动 物 检 疫
２０ ０ ６年 第 ２ ３卷 第 ７期
一３ 一 ２
文 章 编 号 ：０ ５ ９ ４ ２ ０ ） ７ ０ ３ — ４ １０ — ４ Ｘ（ ０ ６ ０ — ０ ３ ０
禽流感病毒重组核 蛋 白抗原 的 纯化 及 在 琼 脂 免 疫 扩 散试 验 中 的应 用
试 剂盒相 符性 达 １０ ０ ％。实验 室和 现地 使 用证 明 ． 用纯化 的 重组 ＮＰ抗 原 所 建立 的方 法 简便 、 靠 、 利 可 易于标 准 化． 可为我 国禽 流感 的兽 医诊 断 、 流行病 学普 查和 出入境 检 验检 疫提供 有 力 的保 障。
关键 词 ：Ａ ｖ： Ｉ 核蛋 白： 琼脂免 疫 扩散试 验
国动物 及动 物产 品 出入境 必检 的项 胞 培 养 中获得 的抗 原 ．都 是病毒 抗 计一对 引物 Ｐ 、２ １Ｐ 。用 于扩增 Ｎ Ｐ基 原 和培养 物 的混合 物 ．不仅 制备 成 因 ．上游 引物引入 Ｋ ｎ 限制性 内切 ｐＩ
酶位 点 和起始 密码 子 Ａ Ｇ．下游 引 Ｔ 本病 自 １７ ８ ８年 首次 在 意 大 利 本 高 。 而且 很难 保证 其特 异性 。
乔 彩霞 张鹤 晓 高 志强 谷 强 吴 丹 蒲 静 郭晋 优 刘继 红 （ 京 出入 境检 验检 疫局 动检 中心 １ １ １ ） 北 ０ １３
摘 要 ：采 用 ＲＴ— Ｃ 扩 增我 国 Ｈ５ ＰＲ Ｎ１禽 流 感病 毒 ＮＰ基 因 。 克 隆 于含 有组 氨 酸 标 签 的原 核 表 达栽 体 亚 中 ，在 大肠杆 菌 中高效表 达 。所表 达 的蛋 白经 Ｎｉ 亲和 色谱 法 纯化 ，ＤＳ Ｐ Ｇ 电泳分 析其 纯度 达 ９ ％ｒ ， Ｓ —Ａ Ｅ ５ ２上 Ｗ ｅｔ Ｂｏｔ ｇ鉴 定具有 良好 的免 疫反 应 活性 。利 用纯化 蛋 白作 为诊 断 用抗 原 ， ｓ ｍ— ｌｔｎ ｅ ｉ 建立 了禽流 感 的琼脂 扩散 诊 断方 法。所 建 立的诊 断 方法在 对禽 流感 强 阳性 和 弱 阳性 血 清 的检 测 中 ， 出现 了致 密而 清晰 的沉 淀线 ， 沉 淀 均 且 线 的 亮度与 所加入 的重组 抗原 的量 成正 比 ： 而对鸡 新城 疫 、 鸡传 染性 法式 囊等 ８种 禽疫 病 阳性 血 清和 Ｓ Ｆ鸡血 Ｐ 清 的检 测 中 ． 无沉 淀线 出现 且没 有 交叉反 应 ： 用该方 法对 ３ 利 ０份进 出 口送检 样 品进 行检 测 ， 结果 与 国 内 同类 其
浅析研究禽流感病毒检测方法相关进展
浅析研究禽流感病毒检测方法相关进展禽流感是一种高度传染性的疾病，对禽类产业造成了巨大的损失，同时对人类健康也带来了极大的威胁。
因此，准确、快速地检测禽流感病毒对于防控禽流感具有重要意义。
本文将对禽流感病毒检测方法相关进展进行浅析。
一、传统检测方法1. 细胞培养法细胞培养法是一种常用的传统禽流感病毒检测方法。
该方法将病毒接种到特定的细胞培养物中并进行培养，观察细胞的形态变化、病毒感染区域出现的细胞变形、塑像等特征来判断样本中是否存在禽流感病毒。
该方法具有操作简单、成本较低等优点，但需要一定时间进行细胞培养以便检测，且检测结果需要通过显微镜观察，此法的数据精度相对较低，不能对病毒毒株作差异分析。
此外，细胞培养法只能检测能够感染特定细胞系的禽流感病毒株，不能检测全部毒株。
2. 血清学方法血清学方法是利用血清学技术，检测血清中是否存在禽流感病毒特异性抗体或抗原的方法。
血清学方法具有操作方便、标本保存期长等优点，同时可对不同毒株作差异分析，且可以作为定量方法来测定病毒的抗体或抗原含量。
但是该方法的灵敏度相对较低，不能检测到病毒感染初期的病例；同时抗体响应不稳定，因此不能用于诊断急性感染，只能用于长期的流行病学监测。
二、分子生物学检测法随着现代分子生物学技术的不断发展，在禽流感病毒检测方面也出现了一系列基于分子生物学技术的新型检测方法，如PCR法、实时荧光定量PCR法（RT-PCR法）、LAMP法、核酸微芯片法等。
1. PCR法PCR法是指用聚合酶链反应技术，通过扩增目标病毒基因片段使其呈指数倍增长从而检测样本中的禽流感病毒。
PCR法具有闭管式系统、扩增特异性高、灵敏度高、快速检测等优点，但PCR法检测中存在假阳性、假阴性等误差，并且PCR扩增后的目的产物需要进行凝胶电泳分析，需要一定实验经验，操作相对较复杂。
RT-PCR法是在传统PCR法基础上，通过引入逆转录过程得到RNA模板进行扩增，从而实现对RNA病毒如禽流感病毒检测。
ELISA 技术在禽流感诊断研究中的应用
ELISA 技术在禽流感诊断研究中的应用摘要：禽流感（AI）是目前禽类流行的主要疫病之一，给养禽业和人类健康带来了巨大危害。
由于禽流感病毒血清型众多，致病疫情多样，因此，适时的检测和早期快速诊断是预防和控制禽流感的前提条件。
ELISA 方法以其特异、灵敏、快速、简便，可迅速检测大量样品，使用仪器设备少，利于基层操作等优点成为AI 流行病学普查及早期快速诊断的最实用和有效的方法。
关键词：禽流感ELISA 诊断禽流感（Avian Influenza，AI）是由A 型流感病毒所引起禽类的感染和/或疾病综合征，1878 年首次发生于意大利，目前已在全世界广泛流行，被国际兽疫局确定为A 类传染病。
禽流感病毒感染后引起的临床症状和病理变化，因感染禽的种类、年龄、免疫状况、继发或混合感染状况、病程长短及感染毒株的毒力等不同而异，易与多种禽类疫病相混淆。
因此，诸多高致病性禽流感病毒感染致人死亡的事件使禽流感的防制工作提升到前所未有的公共卫生学高度。
禽流感疫情的多样性和公共卫生学意义，使得禽流感的早期、快速诊断对于疫病的控制尤为重要，传统的鸡胚分离、琼脂扩散试验、血凝抑制试验（HI）等检测禽流感的方法，由于敏感性不高或检验时间较长，不能满足基层检疫和疫病防制的需要，因此禽流感的确诊必需依赖实验室诊断。
ELISA 检测技术以其高敏感性、高特异性、经济、简便的特点，在畜禽疫病诊断和监测中发挥了重要作用。
1 间接ELISA1.1 基于全病毒的间接ELISA黄金海等[1]应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的禽流感病毒（H9N2 亚型AIV）经处理后作为ELISA 检测方法的包被抗原。
并以不同的含量进行包被，建立了定量检测禽流感抗体水平的间接ELISA 方法。
该试验建立的ELISA 方法不仅可检测出血清中禽流感抗体的P/N 值，还可用回归方程算出ELISA 效价，实现定量测定，这为检测鸡群的抗体水平，制定合理的免疫程序提供了科学的依据。
应用C—ELISA检测禽流感病毒核蛋白抗体
应用C—EL ISA检测禽流感病毒核蛋白抗体E1M Zhou等著 艾武 黄兵译 张秀美校 摘要 应用杆状病毒表达的重组核蛋白及单抗建立了竞争EL ISA(C—EL ISA),用于抗A型禽流感病毒核蛋白抗体的检测。
试验检测了756只鸡,1123只火鸡,707只鸸鹋和1261只鸵鸟的共3847个血清样品。
与琼脂扩散试验(A G I D)对比,C—EL ISA方法对上述四种血样的敏感性均为100%;而与血凝抑制试验(H I)相比,则其敏感性在鸡、火鸡和鸸鹋为100%。
鸵鸟为9612%。
经A G I D检测为阴性而C—EL ISA阳性的样品中有90%以上通过H I试验至少一种血清亚型呈阳性反应。
试验发现C—EL ISA和A G I D方法的特异符合率在8515%—9918%之间。
这些结果表明, C—EL ISA和H I一样都比A G I D更敏感、更特异。
因此,C—I L ISA有可能取代A G I D,用于禽类(包括平胸鸟)A型流感病毒血清学监测。
关键词 禽流感病毒 C—EL ISA 免疫试验 血清学诊断 核蛋白 抗核蛋白抗体流感病毒属正粘病毒科,按抗原性分为A、B和C三型,同型的所有毒株具有相同的非糖基化核蛋白(N P)和基质蛋白抗原,按照特异的血凝素(H)和神经氨酸酶(N)表面糖蛋白,又可进一步将流感病毒分为不同亚型。
禽流感病毒(A I V)属于A型流感病毒,已发现有15个H亚型和9个N亚型。
致病性的A I V传染在全球范围内给鸡和火鸡养殖业造成了巨大的经济损失。
流感病毒亦感染平胸鸟,如鸵鸟、鸸鹋和rheas等,很少知道A G I D和H I等传统的血清学方法是否适用于此类样品的监测,通常认为对这些种类的血清诊断与家禽一样。
最近随着国际贸易上平胸鸟类的增加,才发现传统的血清学监测方法是无效的。
当前,检测禽流感病毒抗体最常用的方法有A G I D和H I试验。
A G I D试验需要大量的抗原和抗体才出沉淀线,且需等待至少24h才出结果。
H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其AC-ELISA检测方法的建立的开题报告
H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其AC-ELISA检测方法的建立的开题报告一、选题背景禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，严重危害家禽养殖业的健康和经济发展。
H9亚型禽流感病毒是近年来病毒流行的主要类型之一，也是全球范围内最常见的亚型之一。
目前，接种疫苗是预防H9亚型禽流感的主要手段，但由于疫苗存在免疫力时效性等问题，因此需要及时进行有效的监测和诊断。
单克隆抗体技术是一种能够高度特异地识别病原体的生物技术手段，已经被广泛应用于临床诊断、病毒学研究和生物工程等领域。
本研究旨在制备可识别H9亚型禽流感病毒的单克隆抗体，并建立一种基于抗体的ELISA检测方法，以期为快速、准确地检测H9亚型禽流感病毒提供有力支持。
二、研究内容1.制备H9亚型禽流感病毒的免疫原：选择H9亚型禽流感病毒作为免疫原，制备并纯化病毒颗粒，用于后续免疫小鼠制备单克隆抗体。
2.免疫小鼠制备单克隆抗体：将制备的免疫原注射于小鼠体内，筛选出单克隆抗体细胞株，用于后续抗体的纯化和表征。
3.单克隆抗体的纯化：以酰胺树脂为亲和层析材料，对细胞株中分泌的单克隆抗体进行纯化，获得高纯度的抗体样品。
4.单克隆抗体的表征：采用Western blot、ELISA等方法对纯化后的单克隆抗体进行鉴定，确定抗体的特异性和活性。
5.建立基于单克隆抗体的ELISA检测方法：以制备好的单克隆抗体为核心材料，建立AC-ELISA检测方法，用于检测H9亚型禽流感病毒抗原，验证方法的准确性和灵敏度。
三、研究意义本研究通过制备H9亚型禽流感病毒的单克隆抗体，建立基于抗体的AC-ELISA检测方法，为快速、准确地检测H9亚型禽流感病毒提供了新的先进技术手段。
该方法具有特异性高、灵敏度好、实施简便等优势，可广泛应用于禽类养殖场，有效遏制禽流感病毒的传播。
同时，本研究的开展还能够促进单克隆抗体技术的发展和应用，推进生物医药和农业生产等领域的发展。
禽流感病毒np蛋白单克隆抗体的研制与鉴定
电泳蛋白条带反应，说明不是针对线性表位的．而可能是针对空间表位的单抗，其具体表位还需进一步鉴定。
这两株针对ＮＰ蛋白的单抗在禽流感病毒毒株的抗原分析、禽流感血清学诊断和流行病学调查等方面存在着潜在的应用价值。
关键词：禽流感单克隆抗体间接ＥＬＩＳＡＨＩ试验共同抗原ＭｏｎｏｅｉｏｎａｉＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮＰＰｒｏｔｅｉｎｏｆＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓＭ．Ｓ．Ｃａｎｄｉｄａｔｅ：ＨｕａｎｇＱｉｎｇｈｕａＡｄｖｉｓｏｒｓ：ｐｒｏｆ．ＬｉｕＸｉｕｆａ。
ｌｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆、ｂｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＹａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ２２５００９，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅ８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄｆｅｍａｌｅＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｗｉｔｈ２００ｕｇｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄＨ９Ｎ２ｓｕｂｔｙｐｅａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｍｕｌｓｉｆｉｅｄｉｎＦｒｅｕｎｄｌｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ．Ｔｗｏｗｅｅｋｓｌａｔｅｒ，ｔｈｅｓａｍｅａｎｔｉｇｅｎｅｍｕｌｓｉｆｉｅｄｉｎＦｒｅｔｍｄ’ｓｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａＵｙ．Ｆｏｕｒｗｅｅｋｓｌａｔｅｒ，ｔｈｅｓａｍｅａｎｔｉｇｅｎｗａｓａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙｗｉｔｈｏｕｔａｄｊｕｖａｎｔ，ａｎｄｔｈｒｅｅｄａｙｓａｆｔｅｒｆｉｎａｌｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ，ｓｐｌｅｅｎｃｅｌｌｓｆｒｏｍｉｍｍｕｎｉｚｅｄｍｉｃｅｗｅＤｇｆｕｓｅｄｗｉｔｈＳｐ２／Ｏ－Ａｇ－１４ｍｙｅｌｏｍａｃｅｌｌｓ．ＢｙｕｓｉｎｇｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡａｎｄＨＩｔｏｓｃｒｅｅｎｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｓ，ａｎｄｂｙｕｓｉｎｇｌｉｍｉｔｉｎｇｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｔｏｓｕｂｃｌｏｎｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓ，ｗｅａｃｑｕｉｒｅｄｔｈｒｅｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓ，ｄｅｎｏｍｉｎａｔｅｄＣ２ｃ５，ＤａＢｌｏａｎｄＣ２Ｈｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｔｉｔｅｒｓｏｆｔｈｅｉｒａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉｄｓｗｅｒｅ５×２１４．２１０ａｎｄ５×２住ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡ．ＴｈｅｙｗｅｒｅｏｆＩｇＧ２ａｓｕｂｔｙｐｅ．ＩｎＤｏｔ－ＥＬＩＳＡ，Ｃ２ＨｓａｎｄＤ３８１０ｃｏｕｌｄｒｅａｃｔｗｉｔｈＡＩＶＨｇＮ２ａｎｄＨｓＮ］，ｂｕｔｎｅｉｔｈｅｒｃｏｕｌｄｒｅａｃｔｗｉｔｈＮＤＶ，ＩＢＶ．ＩＢＤＶ，ＥＤＳＶ－７６，ｏｒｗｉｔｈＳＰＦｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏａｌｌａｎｔｏｉｃｆｌｕｉｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｔｗｏＭｃＡｂｓｗｅｒｅｐｒｏｂａｂｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒ电泳蛋白条带反应，说明不是针对线性表位的．而可能是针对空间表位的单抗，其具体表位还需进一步鉴定。
禽流感病毒NP基因的真核表达及抗体检测芯片的建立
赵玉辉，等. 禽流感病毒 NP 基因的真核表达及抗体检测芯片的建立
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的危害。低致病性 AIV 感染禽类后可导致家禽生产 性能下降。1878 年 AI 首次在意大利暴发，该病呈 世界性分布，并且已经有人类感染 AIV 的报道 。 [1-2] 因此，AI 的防制与检测直接关系到养禽业和公共卫 生事业的发展。
Key words: influenza virus; NP protein; eukaryotic expression; protein microarray
禽流感(Avian influenza，AI)是由 A 型流感病毒 引起的一类可感染多种动物的传染病，禽类是该病
的主要易感宿主。高致病性禽流感病毒(AIV)因其在 禽类中传播速度快、病死率高，给养禽业带来一定
ZHAO Yu-hui1, WANG Fu-mei2, BAO Hong-mei1, SUN xiao-dong1, LU Bing1, XIONG Yong-zhong1, CHEN Hua-lan1, WANG Xiu-rong1*
(1. State Avian Influenza Reference Laboratory and State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001, China; 2. Zhejiang Apeloa Jiayuan Pharmaceutical Co. Ltd, Hangzhou 310000, China)
禽流感病毒快速检测技术及重组腺病毒禽流感疫苗研制的开题报告
禽流感病毒快速检测技术及重组腺病毒禽流感疫苗研制的开题报告一、研究背景禽流感是由禽流感病毒引起的一种传染病，在全球范围内广泛流行，其病原体为单株RNA病毒，具有高变异性和易降解性为其防控带来了较大的困难。
当前，对禽流感的快速检测技术和疫苗的研发已成为当前研究的热点方向。
禽流感病毒快速检测技术可以有效地进行疫情监测和病毒鉴定，为疫情防控提供有力的支持；而疫苗的研发则是预防与控制禽流感疫情的关键。
二、研究目的本研究旨在开发一种禽流感病毒的快速检测技术及重组腺病毒禽流感疫苗，提高禽流感的防控能力和实现对禽流感的有效预防和控制。
三、研究内容及方法（一）禽流感病毒快速检测技术1.病毒检测标准物质的制备以常见禽流感病毒为模板，运用PCR技术快速扩增目的基因，构建禽流感病毒检测标准物质，制备标准物质库。
2.基于PCR技术的快速检测技术的研发应用PCR技术验证制备的标准物质，探究不同引物和检测方法的可行性，建立一种基于PCR技术的禽流感病毒快速检测技术。
（二）重组腺病毒禽流感疫苗1.重组病毒载体的构建设计并合成病毒载体，构建重组腺病毒载体。
2.瞬时表达和稳定表达细胞系的筛选选取合适的细胞系对重组载体进行转染，筛选瞬时表达和稳定表达的细胞系。
3.疫苗效价的评估灌胃法或皮下注射法对疫苗进行动物实验，测定疫苗的效价，同时进行安全性评价。
四、预期研究结果本研究将开发出一种基于PCR技术的禽流感病毒快速检测技术，并成功构建重组腺病毒禽流感疫苗，为禽流感的防控提供新思路和新方法，提高禽业生产效益和禽类产品的质量安全。
禽呼肠孤病毒非结构蛋白的克隆表达及重组蛋白ELISA方法的建立的开题报告
禽呼肠孤病毒非结构蛋白的克隆表达及重组蛋白
ELISA方法的建立的开题报告
本次研究旨在克隆表达禽呼肠孤病毒（IBV）非结构蛋白（NSP）的重要组成部分，建立重组蛋白的酶联免疫吸附实验（ELISA）检测方法。
首先，根据已有文献对IBV NSP进行序列比对，设计引物进行PCR 扩增目标基因片段。
从IBV RNA模板中成功扩增出长约1.5 kb的NSP基因片段。
对PCR产物进行酶切和测序验证，结果显示目标基因片段的序列完全符合预期。
接下来，将NSP基因片段克隆至真核表达载体pPIC9K中，使用重组酵母表达系统Pichia pastoris进行表达。
经过筛选、鉴定和纯化，成功得到了高纯度的重组NSP蛋白。
进一步，将重组NSP蛋白用于建立ELISA检测方法。
首先选择适宜的抗原和抗体，在优化实验中确定最佳的抗原和抗体反应条件。
利用重组NSP蛋白作为抗原，经过优化浓度和反应时间等因素后，成功地建立了对IBV NSP蛋白的高灵敏度和高特异性的ELISA检测方法。
总之，本研究成功地克隆表达了IBV NSP基因片段，并建立了检测IBV NSP蛋白的重组蛋白ELISA检测方法，为进一步研究IBV的诊断和预防提供了有力的工具。
禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达
禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达乔传玲;张建林;贾永清;邓国华;姜永萍;王秀荣;孟庆文;于康震【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2003(024)001【摘要】为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达.首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIV HA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA+NP).将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞.根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及Western-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIV HA及NP两种蛋白.此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础.【总页数】3页(P81-83)【作者】乔传玲;张建林;贾永清;邓国华;姜永萍;王秀荣;孟庆文;于康震【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5【相关文献】1.H9亚型禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建 [J], 陈红英;黄青云;崔保安;李新生;赵丽;管倩2.共表达禽流感病毒HA和NA基因的重组禽痘病毒在SPE鸡的免疫效力试验 [J], 乔传玲;姜永萍;于康震;田国斌;陈化兰3.共表达禽流感病毒HA和NA基因重组禽痘病毒的遗传稳定性 [J], 乔传玲;常洪涛;于康震;陈化兰4.表达H5亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶双基因重组禽痘病毒的构建 [J], 乔传玲;于康震;贾永清;刘明;孟庆文;田国彬;唐秀英5.共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力 [J], 陈素娟;石火英;孙蕾;刘秀梵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
表达禽流感病毒核蛋白重组噬菌体的构建
表达禽流感病毒核蛋白重组噬菌体的构建王新卫;毕英佐;马静云;曹永长;王宪文;詹爱军【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2007(015)004【摘要】利用PCR技术,扩增去除部分序列,长度为1 320 bp,编码440个氨基酸的禽流感病毒(AIV)核蛋白基因片段,将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C 末端获得重组质粒pR-np,以此重组载体转化大肠杆菌(Escherichia coli)2(E2),用溶菌酶缺陷噬菌体T4-z1感染重组E2菌,重组载体与缺陷噬菌体T4-z1基因发生同源重组,将np基因整合到噬菌体基因组中,用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-z1-np.经Western blot检测证实,T4-z1-np表达的NP融合蛋白具有免疫学活性.成功地构建了表达禽流感病毒核蛋白的重组噬菌体.【总页数】5页(P552-556)【作者】王新卫;毕英佐;马静云;曹永长;王宪文;詹爱军【作者单位】华南农业大学动物科学学院,广州,510642;河南农业大学牧医工程学院,郑州,450002;华南农业大学动物科学学院,广州,510642;华南农业大学动物科学学院,广州,510642;华南农业大学动物科学学院,广州,510642;华南农业大学动物科学学院,广州,510642;华南农业大学动物科学学院,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S188【相关文献】1.表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建及其免疫保护性研究 [J], 乔传玲;于康震;姜永萍;张建林;邓国华;孟庆文;田国斌;唐秀英2.含禽源启动子的禽流感病毒核蛋白表达载体的构建及其免疫原性的检测 [J], 王群;刘光亮;肖一红;童铁钢;白宇;张维军;徐树兰;吴东来3.禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达 [J], 乔传玲;张建林;贾永清;邓国华;姜永萍;王秀荣;孟庆文;于康震4.禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达 [J], 邓国华;马文军5.H5亚型禽流感病毒核蛋白基因重组质粒的构建及其在Hela细胞的瞬时表达 [J], 刘光亮;王群;童铁钢;肖一红;孟庆文;吴东来因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
用PT-PCR和PCR-ELISA检测A型禽流感
用PT-PCR和PCR-ELISA检测A型禽流感
李秉鸿
【期刊名称】《畜牧兽医科技信息》
【年(卷),期】2001(0)6
【摘要】丹麦学者M.Munch等采用一种单管RT-PCR方法可快速诊断A型禽流感(AI),这种快速鉴定病毒的方法具有重要的临床意义。
实验组AI参考毒株来自不同的宿主,包括鸟类、(NP)基因的218bp片段进行扩增,PCR产物再经PCR-ELISA 实验测定,PCR-ELISA是使用一种内部捕获探针来确定A型禽流感病毒核蛋白的来源,用它来检测PCR产物比琼脂糖凝胶电泳方法敏感100倍。
H5、H7亚型被证实对家禽有致病力,用H5的引物覆盖HA基因的裂体位点。
【总页数】1页(P11-11)
【关键词】PCR-ELISA;致病力;A型;禽流感病毒;PCR产物;H7亚型;核蛋白;参考毒株;临床意义;快速鉴定
【作者】李秉鸿
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】S854.4
【相关文献】
1.猪链球菌2型PCR-ELISA检测方法的建立与优化 [J], 方勤美;朱继昌;池洪树;林天龙
2.人季节性流感病毒H1、H3、B型PCR-ELISA分型检测方法的建立及应用 [J], 章倩云;刘丹丹;焦永军;祁贤;宋勇春
3.PCR-ELISA快速检测高致病性禽流感病毒方法的建立 [J], 亢文华;郝俊峰;张仲秋;宁宜宝;赵德明
4.H_9型禽流感毒株免疫对H_5型禽流感抗体检测的干扰试验 [J], 薛景山;徐海聂;潘文波;廖秀云;杨素;薄清如;冯家望
5.用RT-PCR和PCR-ELISA检测A型禽流感 [J], 李秉鸿
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第22卷 第3期 中 国 预 防 兽 医 学 报 Vol.22, No.3 2000年5月 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine May 2000禽流感病毒重组核蛋白E LISA诊断技术的研究李海燕,于康震3,辛晓光,邓国华(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,哈尔滨 150001)摘要 用表达禽流感病毒(AI V)核蛋白基因的杆状病毒感染S f9昆虫细胞,以其表达产物制备抗原,建立了以杆状病毒系统表达的AI V核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术(rNP-E LIS A)。
其抗原最适包被量为0.6μg/孔,待检血清最适稀释度为1:200,酶标抗体使用浓度为1:1000。
根据对140份SPF鸡血清检测结果的统计分析,确定其判定标准为OD 值大于0.15的血清样品为阳性。
用rNP-E LIS A检测150份SPF鸡血清、194份非免疫鸡血清及30份其它15种鸡疫病阳性血清均为阴性;检测A型AI V15个不同亚型(H1～H15)毒株的特异性血清均为阳性;对人工接种AI V的SPF鸡第3天即能检出抗体,到第162天试验结束时检测仍为阳性。
其批内和批间重复试验的变异系数分别在2.9%～7.2%和3.4%～9.8%之间。
对3138份鸡血清进行监测,rNP-E LIS A与全病毒间接E LIS A(AI V-E LIS A)、琼脂扩散试验(AG P)及血凝抑制试验(HI)的符合率分别为99.9%、97.1%、98.8%;并能100%检出AG P阳性及疑似、HI阳性的血清样品。
试验证明,rNP-E LIS A是检测A型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快速、经济的血清学诊断技术。
关键词 禽流感; 重组核蛋白; E LIS A; 抗体检测中图分类号 S854.43; S852.65 文献标识码 A 文章编号 1008-0589(2000)03-0182-04An E nzyme-Linked Immunosorbent Assay Employing R ecombinant NucleoproteinFor Detection of Antibody to Avian I nfluenza Virus in ChickenLI Haiyan,Y U K angzhen3,XI N X iaoguang,DE NG G uohua(Animal In fluenza Research Center,Harbin Veterinary Research Institute of CAAS,Harbin150001) Abstract An enzyme-linked immunos orbent assay(E LIS A)employing recombinant nucleoprotein(rNP)expressed in baculovirus system was developed for detection of antibody against avian A in fluenza virus(AI V)in chicken sera.40-well polystyrene micro titration plate was coat2 ed with the rNP antigen(0.6μg/100μl/well)for15h at4℃.The w orking titer of enzyme-labeled anti-chicken Ig conjugate was1:1000and that of serum samples was1:200.The samples with optical dense(OD)greater than0.15were judged as positive based on the data from140 sera of specific-pathogen-free(SPF)chickens.The344serum samples from SPF chickens(150serum samples),non-immunized chickens(194 serum samples)and the chickens(30serum samples)in fected by other15in fectious pathogens than AI V were negative in the rNP-E LIS A.On the other hand,the rNP-E LIS A was able to reveal all serum samples against15(H1～H15)AI V subtypes,which were positive in agar gel pre2 cipitation(AG P)and hemagglutinatin-inhibition(HI)tests as well.Furtherm ore,the rNP-E LIS A was able to detect the serum antibody from chickens in fected with AI V strain A/Turkey/England/69(H3N2)on as early as3rd day post-inoculation(DPI)and the positive detection could last162DPI.The rNP-E LIS A was found m ore sensitive than AG P and HI tests.The variant coefficients of the OD value within assay and be2 tween assays ranged from2.9to7.2%,and from3.4to9.8%respectively.The total of3138serum samples were evaluated by rNP-E LIS A, as well as whole virus antigen E LIS A(AI V-E LIS A),AG P and HI tests.The correspondence between rNP-E LIS A and AI V-E LIS A was99.9%, between rNP-E LIS A and AG P was97.1%and between rNP-E LIS A and HI was98.9%.The results above showed that the rNP-E LIS A was rapid,sensitive,economic and specific for serologically diagnosis of AI V in fection in chickens.K ey w ords Avian in fluenza; Nucleoprotein; E LIS A; Antibody detection 3C orresponding author 禽流感(AI)是由A型流感病毒(AI V)引起的一种禽类病毒性烈性传染病。
我国是世界第一养禽大 3通讯作者(Email:yukz@) 收稿日期:1999-09-23国,禽流感的防制直接关系到我国养禽业的持续、稳定发展和人民的身体健康,早期快速诊断和血清学监测是预防、控制禽流感的前提条件。
尽管AI V极易变异,但其核蛋白却高度保守,具有型特异性。
我们在禽流感全病毒酶联免疫吸附试验(E LIS A)[1]和斑点E LIS A[2]研究的基础上,以重组杆状病毒表达的禽流感病毒核蛋白(rNP)为包被抗原,建立了rNP-E LIS A诊断技术,可对禽流感进行快速诊断,具有高度特异性和敏感性,现报告如下。
1 材料和方法111 AI V毒株 A/Chicken/X injiang/1/96(X J/96, H15N5),由哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心分离、鉴定并保存,为禽流感病毒核蛋白基因的供体; A/Duck/Ukraine/1/63(UE/63,H3N8)和A/Turkey/ England/69(E D/69,H3N2)均由英国中心兽医实验室(C V L)惠赠,分别用于制备AI标准阳性血清及免疫接种SPF鸡的抗体监测。
112 禽流感全病毒抗原和酶标兔抗鸡Ig 由哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心研制[1],全病毒抗原蛋白含量2.96μg/μl,酶标兔抗鸡Ig工作浓度11000稀释(含50%甘油)。
113 禽流感AG P和HI抗原、AI各亚型血清及标准阳性血清 均由哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心研制[3、4]。
114 其它标准血清 鸡新城疫(ND)、鸡马立克氏病(M D)、鸡传染性支气管炎(I B)、鸡传染性法氏囊病(I BD)、鸡传染性贫血(CI A)、鸡白痢(PD)、鸡鼻炎(IC)、鸡腺病毒感染(ADV)、鸡减蛋综合征(E DS-76)、病毒性关节炎(VA)、禽霍乱(FC)、鸡传染性喉气管炎(I LT)、鸡白血病(A L)、鸡痘(AP)、鸡慢性呼吸道病(CRD)标准阳性血清均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所成果推广部,共30分(每种2份)。
115 待检血清 共计2523份,分别来自黑龙江哈尔滨260份、大庆68份,辽宁大连283份,河北204份,上海102,江苏常州1020份,北京204份,山东蓬莱204份,安微178份(1日龄44份、11日龄59份、26日龄75份)。
116 重组杆状病毒表达的AI V核蛋白抗原(rNP) 将X J/96毒株感染的鸡胚尿囊液纯化后提取病毒RNA,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增NP基因[5],并克隆到杆状病毒转移载体pV L1393中,与杆状病毒线性DNA(BAC-N-Blue DNA)共转染于S f9昆虫细胞中,获得重组病毒rB2[6],将其细胞表达产物经冻融、超声裂解等处理制备rNP,并测其蛋白含量。
117 E LIS A、AG P、血凝(H A)及HI试验 E LIS A按文献[7]程序进行,AG P、H A及HI试验均按常规方法进行[8]。
118 SPF鸡的免疫接种及抗体监测 用AI V E D/69感染的鸡胚尿囊液(H A价1128～1256)接种10只于负压隔离器中饲养的48周龄SPF鸡, 1.5～2.0ml/只,分别于接种后第0天、第3天、第5天、第7天、第11天、第15天翅静脉采血,以后每隔1周采血,分离血清,共206份;所有血清同时用重组核蛋白E LIS A(rNP-E LIS A)、全病毒E LIS A(AI V-E LIS A)、AG P和HI试验进行测定。