分子生物学实验2015ppt课件
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分子生物学PPT课件
04 蛋白质的结构与功能
蛋白质的化学组成与结构
蛋白质的基本组成单 位
氨基酸，具有氨基和羧
基的有机化合物。
氨基酸的种类
20种常见氨基酸，根据 侧链R基的不同进行分 类。
蛋白质的一级结构
氨基酸的线性排列顺序 ，包括肽键和二硫键的 连接。
蛋白质的高级结构
二级结构（α-螺旋、β折叠等）、三级结构和 四级结构。
01
其他RNA
如miRNA、snRNA等，在基因表达调控、 RNA加工等方面发挥作用。
04
03
RNA的合成与加工
01
02
03
转录
以DNA为模板，通过RNA 聚合酶的作用，合成RNA 的过程。
加工
新合成的RNA需要经过一 系列加工过程，如剪接、 修饰等，才能成为成熟的 RNA分子。
转录后调控
通过RNA干扰、RNA编辑 等方式对RNA进行转录后 水平的调控，影响基因的 表达。
03
DNA连接酶的种类和应用
04
重组DNA分子的构建和筛选
PCR技术及其应用
01
PCR技术的原理及步骤
02
03
04
引物的设计与优化
PCR反应体系的组成及优化
PCR技术的应用举例
基因克隆与基因工程
基因克隆的定义和原理 基因表达载体的构建和选择
基因工程的基本步骤 基因工程的应用举例
分子生物学在医学、农业等领域的应用
医学领域的应用
基因诊断、基因治疗、药物研 发等
工业领域的应用
酶工程、发酵工程、生物制药 等
农业领域的应用
转基因作物、基因编辑育种、 农业生物技术等
环境领域的应用
环境监测、污染治理、生态修 复等
分子生物学实验 ppt课件
分 子 生 物 学 实 验下
ppt课件
1
实验流程一
ppt课件
2
实验安排
准备材料：重组工程菌目标蛋白的表达 第1次 菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装 离子交换柱 第2次 测酶活、定蛋白、 离子交换层析 第3次 亲和柱层析，并对收集样 品进行测活、定蛋白等 第4次 对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析 第5次 Western blotting， 绘出分离纯化表 ppt 绘制包涵体复性曲线 课件
ppt课件 23
B瓶 1N NaCl 100ml
A瓶 0N NaCl 100ml
ppt课件
24
操作要点
1)在梯度洗脱仪中的洗脱瓶A（混合器）和洗脱瓶B（贮存器）
内各装入100毫升缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ（注意加溶液的方法），
注意液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内的气泡 2) 开动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以 混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜 3) 将洗脱瓶A、洗脱瓶B与层析柱上端连接管道打开，同时将
O
对硝基苯酚磷酸酯 p-NPP
O O
-
-
Na+ Na+
碱性磷酸酶
O
- P
OH 对硝基苯酚
p-NP
NO2
NO2
以对硝基酚磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对 硝基酚量测定酶活力。在37℃、pH10.0条件下，每分钟转 化产生1μ mol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位
ppt课件 6
每10秒记一个数（0、10、20、……120） 将时间及其对应的A405导入EXCEL文档中， 做时间t—A405曲线，得到斜率，
ppt课件 20
层析操作一般过程
装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、合并样品 上样前后样品活性测定---当天测定 上样前后蛋白浓度测定---最后一天测定
ppt课件
1
实验流程一
ppt课件
2
实验安排
准备材料：重组工程菌目标蛋白的表达 第1次 菌体超声破壁、离心、包涵体复性、装 离子交换柱 第2次 测酶活、定蛋白、 离子交换层析 第3次 亲和柱层析，并对收集样 品进行测活、定蛋白等 第4次 对分离纯化各样品进行蛋白电泳分析 第5次 Western blotting， 绘出分离纯化表 ppt 绘制包涵体复性曲线 课件
ppt课件 23
B瓶 1N NaCl 100ml
A瓶 0N NaCl 100ml
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24
操作要点
1)在梯度洗脱仪中的洗脱瓶A（混合器）和洗脱瓶B（贮存器）
内各装入100毫升缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ（注意加溶液的方法），
注意液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内的气泡 2) 开动梯度洗脱仪中的电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以 混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜 3) 将洗脱瓶A、洗脱瓶B与层析柱上端连接管道打开，同时将
O
对硝基苯酚磷酸酯 p-NPP
O O
-
-
Na+ Na+
碱性磷酸酶
O
- P
OH 对硝基苯酚
p-NP
NO2
NO2
以对硝基酚磷酸二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对 硝基酚量测定酶活力。在37℃、pH10.0条件下，每分钟转 化产生1μ mol/L对硝基酚的酶量为1个酶单位
ppt课件 6
每10秒记一个数（0、10、20、……120） 将时间及其对应的A405导入EXCEL文档中， 做时间t—A405曲线，得到斜率，
ppt课件 20
层析操作一般过程
装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、合并样品 上样前后样品活性测定---当天测定 上样前后蛋白浓度测定---最后一天测定
医学分子生物学实验ppt课件
3）在电泳中形成肉眼可见的指示带，可判断DNA电泳的速度
和位置
精选编辑ppt
50
荧光染料 (如SYBR Green I)
荧光染料SYBR Green I嵌入DNA的碱基平 面后，本身无荧光的DNA在紫外光激发下 发出荧光，且荧光强度与DNA含量呈正比。
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SYBR Green I
51
DNA 分子标准物 (DNA Marker)
用大量程的移液器移取小体积的液体 装配吸头时气密性不好，吸头不匹配 吸液速度和放液速度太快
自我检测漏气：吸取液体，垂直静置5秒，
观察是否有液滴流出；
规范操作，损坏赔偿！
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21
实验报告要求
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22
实验报告按下列要求书写
❖ 1. 实验题目——当次实验
❖ 2. 实验原理——简明扼要，有针对性
精选编辑ppt
43
1
2
3
4
5
6
精选编辑ppt
44
精选编辑ppt
45
琼 脂 糖 凝 胶 电 精选编辑ppt 泳 系 统
46
紫外投射分析仪：
精选编辑ppt
47
凝胶成像系统
精选编辑ppt
48
琼脂糖凝胶电泳操作步骤
❖ 样品：PCR产物 10 µl ❖ 加上样缓冲液2 µl，加荧光染料如Sybr Green I
注意点：缓慢转动，记录时间
❖ 停止（转速按钮回零，时间按钮回零，完全停止后 轻轻取出离心管）
精选编辑ppt
6
使用注意事项
❖ 1. 样品需对称放置； ❖ 2. 先调节离心时间，离心开始缓慢提高转速
至设定值； ❖ 3. 离心结束需等转子完全停止后才能打开离
分子生物学课件(共51张PPT)
二级结构
蛋白质局部主链的空间结构， 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象，揭示生命现象的分子基
础，是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入，为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶， 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程
蛋白质局部主链的空间结构， 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象，揭示生命现象的分子基
础，是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入，为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶， 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程
《分子生物学全套》ppt课件
分子生物学定义
分子生物学是一门从子水平研究生 物大分子的结构和功能的科学，主要 关注DNA、RNA和蛋白质等生物大 分子的复制、转录、翻译和调控等过 程。
分子生物学特点
以分子为研究对象，阐明生命现象的 本质；与多学科交叉融合，推动生命 科学的发展；实验技术手段不断更新 ，提高研究效率和准确性。
分子生物学发展历程
分子生物学研究内容及方法
研究内容
包括基因和基因组的结构与功能、DNA损伤与修复、基因表达的调控、蛋白质 组学的研究以及疾病产生的分子基础等。
研究方法
包括基因克隆与表达、蛋白质分离与纯化、PCR技术、基因敲除与敲入、高通 量测序技术、生物信息学分析等。这些方法的应用使得分子生物学研究更加深 入和广泛。
阔前景。
下一代测序技术在分子生物学中应用
下一代测序技术原理
基于大规模并行测序的原理，一次可对数百万至数十亿个DNA分 子进行测序。
测序数据分析
包括序列比对、变异检测、基因表达量分析等，以揭示基因组的结 构和功能。
下一代测序技术的应用
在疾病诊断、个性化医疗、物种鉴定和进化生物学等领域发挥重要 作用。
非编码RNA与疾病关系
非编码RNA异常表达与多种疾病相关，如肿瘤、心血管疾 病等，可作为疾病诊断和治疗的新靶点。
非编码RNA研究前景
随着高通量测序技术和生物信息学发展，非编码RNA研究 将更加深入，为疾病防治提供新思路和新方法。
合成生物学在分子生物学中应用前景
合成生物学概念及研究范畴
合成生物学是一门新兴交叉学科，旨在通过设计和构造新的生物部件、系统和机器来理解 和操控自然生物系统。
RNA产物。
影响因素
包括DNA模板的序列和 结构、RNA聚合酶的活 性和选择性、转录因子
分子生物学是一门从子水平研究生 物大分子的结构和功能的科学，主要 关注DNA、RNA和蛋白质等生物大 分子的复制、转录、翻译和调控等过 程。
分子生物学特点
以分子为研究对象，阐明生命现象的 本质；与多学科交叉融合，推动生命 科学的发展；实验技术手段不断更新 ，提高研究效率和准确性。
分子生物学发展历程
分子生物学研究内容及方法
研究内容
包括基因和基因组的结构与功能、DNA损伤与修复、基因表达的调控、蛋白质 组学的研究以及疾病产生的分子基础等。
研究方法
包括基因克隆与表达、蛋白质分离与纯化、PCR技术、基因敲除与敲入、高通 量测序技术、生物信息学分析等。这些方法的应用使得分子生物学研究更加深 入和广泛。
阔前景。
下一代测序技术在分子生物学中应用
下一代测序技术原理
基于大规模并行测序的原理，一次可对数百万至数十亿个DNA分 子进行测序。
测序数据分析
包括序列比对、变异检测、基因表达量分析等，以揭示基因组的结 构和功能。
下一代测序技术的应用
在疾病诊断、个性化医疗、物种鉴定和进化生物学等领域发挥重要 作用。
非编码RNA与疾病关系
非编码RNA异常表达与多种疾病相关，如肿瘤、心血管疾 病等，可作为疾病诊断和治疗的新靶点。
非编码RNA研究前景
随着高通量测序技术和生物信息学发展，非编码RNA研究 将更加深入，为疾病防治提供新思路和新方法。
合成生物学在分子生物学中应用前景
合成生物学概念及研究范畴
合成生物学是一门新兴交叉学科，旨在通过设计和构造新的生物部件、系统和机器来理解 和操控自然生物系统。
RNA产物。
影响因素
包括DNA模板的序列和 结构、RNA聚合酶的活 性和选择性、转录因子
分子生物学(全套课件396P)pptx
DNA修复机制包括直接修复、 切除修复、重组修复和SOS修 复等，用于维护DNA分子的完 整性和稳定性。
PART 03
RNA结构与功能
REPORTING
RNA种类及特点
mRNA（信使RNA）
携带遗传信息，指导蛋白质合成。
rRNA（核糖体RNA）
与蛋白质结合形成核糖体，是蛋白质合成的 场所。
tRNA（转运RNA）
分子生物学(全套课件 396P)pptx
REPORTING
• 分子生物学绪论 • DNA结构与功能 • RNA结构与功能 • 蛋白质合成与功能 • 基因表达调控机制 • DNA损伤修复与重组技术
目录
PART 01
分子生物学绪论
REPORTING
分子生物学定义与发展
分子生物学的定义
在分子水平上研究生物大分子的结 构和功能，究生物大分子的结构和功能方面有很多交 叉，但分子生物学更侧重于在分子水平上揭示生命现象的本质。
与细胞生物学的关系
分子生物学与细胞生物学在研究细胞的结构和功能方面密切相关，但 分子生物学更侧重于研究细胞内的分子机制和信号传导。
与医学的关系
分子生物学在医学领域有着广泛的应用，如基因诊断、基因治疗和药 物研发等，为医学的发展提供了重要的理论和技术支持。
THANKS
感谢观看
REPORTING
识别并携带氨基酸，参与蛋白质合成。
其他非编码RNA
如microRNA、siRNA等，参与基因表达调 控。
RNA转录后加工与修饰
01
02
03
04
5'端加帽
在mRNA的5'端加上甲基鸟嘌 呤帽子结构，保护mRNA不被
降解。
3'端加尾
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A260/A280=1.8，DNA纯度高。 A260/A280<1.7，有蛋白质的污染。 A260/A280>1.9,有RNA的污染或者降解。 A260/A230在2.0—2.5，DNA纯度高。 A260/A230<2.0,有糖类，盐类或者有机溶
剂污染。
注意事项
（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2）植物组织充分匀浆。 （3）DNA的二级结构和双链易受多种因素的影
分子生物学实验
华中师范大学生命科学学院
实验目录
实验 一 植物基因组DNA提取及纯化 实验 二 PCR克隆目的基因 实验 三 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 实验 四 PCR产物凝胶回收 实验 五 目的基因片段与载体连接 实验 六 E.coli DH5α和 DE3感受态细胞制备 实验 七 连接产物转化转化大肠杆菌 实验 八 阳性单菌落筛选 实验 九 重组质粒DNA提取 实验 十 重组质粒及表达载体pET酶切分析与电泳 实验十一 目的片段回收及与表达载体连接 实验十二 连接产物转化DH5α,质粒提取 实验十三 阳性质粒转化表达菌株BL21 实验十四 蛋白质的诱导表达及蛋白质样品制备 实验十五 SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白质
6. DNA的检测方法
（1）紫外分光光度法
（2）电泳检测DNA的质量
仪器、材料和试剂
仪器及耗材： 研钵、微量移液器及吸头、EP 管、台式离心机。
材 料： 拟南芥小苗
试 剂： DNA Extract Buffer (0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5); 70%乙醇； 酚；氯仿；异丙醇;RNase
实验步骤
• 1. 取一定量的拟南芥组织; • 2. 加入600 μl抽提缓冲液（0.2M NaCl, 25mM EDTA,
0.5% SDS, pH 7.5），室温下快速研磨; • 3. 把抽提液从研钵中移至1.5 ml 离心管中，混匀; • 4. 12,000 rpm, 离心10 min (RT)。取上清，加等体积的
• （1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而 破坏细胞膜。 （2）解聚细胞中的核蛋白。 （3）SDS 能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物， 使蛋白质变性而沉淀下来。 但是SDS能抑制核糖核酸 酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除 干净，防止在下一步操作中 （用RNase去除RNA时） 受到干扰。
• 3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水 溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋 酸。 所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用 pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH 至中性， 使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。 而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体 DNA、 RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者 是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚 合， 后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能 形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
醇，-20 ℃放置10min; • 13.12000rpm，4 ℃离心10min； • 14.去上清，70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm，4 ℃离心
5min;
• 15.去上清，沉淀干燥后，加入20 μl ddH2O溶解DNA；
• 16.分光光度计法检测DNA的浓度和纯度。
实验报告分析
A260=1时相当于50 μg的双链DNA。
实验一 植物基因组DNA提取
基本原理
1.基因等。 2.不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA 的提 取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其 细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。 3. 在提取某种特殊组织的DNA 时必须参照文献和经验 建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA 大分子。尤其 是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR 反应等 有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基 因组DNA 时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
• 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力 作用而降解。
• EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核 酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅 基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反 应要求有较低的离子强度的环境。
酚/氯仿（1：1）混合液，上下颠倒混匀； • 5. 12,000 rpm, 5min (RT) ，取上清，加等体积的异丙醇，
上下颠倒混匀； • 6. 12,000 rpm, 10min (RT) ，弃上清，倒置于吸水纸上
待壁上液体流尽后加入1ml的70%乙醇洗沉淀； • 7. 12,000 rpm, 5 min (RT) ，弃上清，倒置于纸巾上待
其干燥； • 8 加20 μl ddH2O溶解沉淀;
• 9.在溶解DNA中加入3-5 μl RNase，37℃消化2-3h；
• 10.补充ddH2O至总体积400 μl ，加入等体积的酚/氯仿，
பைடு நூலகம்混匀；
• 11.12000rpm，5min（RT）， • 12.取上清，加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙
响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避 免使用变性的条件。 （4）抑制内外源DNase的活力。 （5）防止化学降解。 （6）防止物理因素降解。。
思考题
• .1在拟南芥基因组提取缓冲液中，EDTA和SDS的作用分别是什么？
• 1．溶液I—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细 胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作 用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
• 2．溶液II－NaOH－SDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的 溶液中，是稳定的。 但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间 氢键的解离而变性。 在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽 提液时，该系统的pH就高达12.6， 因而促使染色体DNA与质粒 DNA的变性。
• SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：
4.核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中 核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式 存在。核酸分为DNA和RNA，在真核生物中， 前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞 质和核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞 壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
5. 植物基因组DNA的提取程序：
（1）破碎组织 （2）破坏细胞膜 （3）去除杂质 （4）沉淀基因组DNA
剂污染。
注意事项
（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2）植物组织充分匀浆。 （3）DNA的二级结构和双链易受多种因素的影
分子生物学实验
华中师范大学生命科学学院
实验目录
实验 一 植物基因组DNA提取及纯化 实验 二 PCR克隆目的基因 实验 三 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 实验 四 PCR产物凝胶回收 实验 五 目的基因片段与载体连接 实验 六 E.coli DH5α和 DE3感受态细胞制备 实验 七 连接产物转化转化大肠杆菌 实验 八 阳性单菌落筛选 实验 九 重组质粒DNA提取 实验 十 重组质粒及表达载体pET酶切分析与电泳 实验十一 目的片段回收及与表达载体连接 实验十二 连接产物转化DH5α,质粒提取 实验十三 阳性质粒转化表达菌株BL21 实验十四 蛋白质的诱导表达及蛋白质样品制备 实验十五 SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白质
6. DNA的检测方法
（1）紫外分光光度法
（2）电泳检测DNA的质量
仪器、材料和试剂
仪器及耗材： 研钵、微量移液器及吸头、EP 管、台式离心机。
材 料： 拟南芥小苗
试 剂： DNA Extract Buffer (0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5); 70%乙醇； 酚；氯仿；异丙醇;RNase
实验步骤
• 1. 取一定量的拟南芥组织; • 2. 加入600 μl抽提缓冲液（0.2M NaCl, 25mM EDTA,
0.5% SDS, pH 7.5），室温下快速研磨; • 3. 把抽提液从研钵中移至1.5 ml 离心管中，混匀; • 4. 12,000 rpm, 离心10 min (RT)。取上清，加等体积的
• （1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而 破坏细胞膜。 （2）解聚细胞中的核蛋白。 （3）SDS 能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物， 使蛋白质变性而沉淀下来。 但是SDS能抑制核糖核酸 酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除 干净，防止在下一步操作中 （用RNase去除RNA时） 受到干扰。
• 3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水 溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋 酸。 所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用 pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH 至中性， 使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。 而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体 DNA、 RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者 是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚 合， 后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能 形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
醇，-20 ℃放置10min; • 13.12000rpm，4 ℃离心10min； • 14.去上清，70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm，4 ℃离心
5min;
• 15.去上清，沉淀干燥后，加入20 μl ddH2O溶解DNA；
• 16.分光光度计法检测DNA的浓度和纯度。
实验报告分析
A260=1时相当于50 μg的双链DNA。
实验一 植物基因组DNA提取
基本原理
1.基因等。 2.不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA 的提 取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其 细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。 3. 在提取某种特殊组织的DNA 时必须参照文献和经验 建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA 大分子。尤其 是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR 反应等 有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基 因组DNA 时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
• 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力 作用而降解。
• EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核 酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅 基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反 应要求有较低的离子强度的环境。
酚/氯仿（1：1）混合液，上下颠倒混匀； • 5. 12,000 rpm, 5min (RT) ，取上清，加等体积的异丙醇，
上下颠倒混匀； • 6. 12,000 rpm, 10min (RT) ，弃上清，倒置于吸水纸上
待壁上液体流尽后加入1ml的70%乙醇洗沉淀； • 7. 12,000 rpm, 5 min (RT) ，弃上清，倒置于纸巾上待
其干燥； • 8 加20 μl ddH2O溶解沉淀;
• 9.在溶解DNA中加入3-5 μl RNase，37℃消化2-3h；
• 10.补充ddH2O至总体积400 μl ，加入等体积的酚/氯仿，
பைடு நூலகம்混匀；
• 11.12000rpm，5min（RT）， • 12.取上清，加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙
响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避 免使用变性的条件。 （4）抑制内外源DNase的活力。 （5）防止化学降解。 （6）防止物理因素降解。。
思考题
• .1在拟南芥基因组提取缓冲液中，EDTA和SDS的作用分别是什么？
• 1．溶液I—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细 胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作 用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
• 2．溶液II－NaOH－SDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的 溶液中，是稳定的。 但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间 氢键的解离而变性。 在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽 提液时，该系统的pH就高达12.6， 因而促使染色体DNA与质粒 DNA的变性。
• SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：
4.核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中 核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式 存在。核酸分为DNA和RNA，在真核生物中， 前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞 质和核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞 壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
5. 植物基因组DNA的提取程序：
（1）破碎组织 （2）破坏细胞膜 （3）去除杂质 （4）沉淀基因组DNA