乳酸菌的分类鉴定综述
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
3.扩增片段长度多态技术(AFLP) 优缺点:重复性好,分辨率高,在亚种和菌株水 平上对菌株进行鉴定;对操作和设备要求高; 4.基因组简单重复序列PCR标记(Re-PCR) 优缺点:重复性好,可在亚种和菌株水平上对菌 株进行快速而准确的分类和鉴定;
5.变性梯度凝胶电泳/温度梯度电泳(DGGE/TGGE) 优缺点:DNA用量小,重复性好,但通常只能检 测微生物群落中数量大于一定值得优势种群。
分离株(球菌) ↙ ↘
链状
↙ 同型发酵 ↘ 异型发酵
四联
↙ 过氧化氢酶 ↘ 过氧化氢酶
↓
Streptococuus Enterococcus Lactococcus Streptococcus
↓
Leuconostoc
(+)
(-)
↓
Pediococcus
↓
非乳酸菌
以明串珠菌属为例,介绍种的鉴定
异性发酵乳酸链状球菌 Leuconostoc
↙ 发酵蔗糖产酸(+) ↓ 发酵蔗糖产葡聚糖 ↙ ↘ 发酵阿拉伯糖 发酵阿拉伯糖 ↙ ↘ ↙ ↘ 群3 群4 群5 发酵海藻糖 ↙ ↘ (+ ) (- ) 群6 群7
↘ 发酵蔗糖产酸(-) ↓ pH4.8生长试验;发酵果糖 ↙ ↘ (+ ) (- ) ↓ ↓ 群1 群2
群1:Leuc.oenos 群2:Leuc. mesenteroides subsp.cremoris 群3: Leuc. mesenteroides subsp.mesenteroides 群4: Leuc. mesenteroides subsp.dextranicum 群5: Leuc. paramesenteroides Leuc. mesenteroides subsp.mesenteroides 群6: Leuc. paramesenteroides Leuc. mesenteroides subsp.cremoris 群7:Leuc. lactis
一、生化鉴定:两歧法
鉴定对象株 ↓共通项目:共16项 实验结果记录 ↓ 属间鉴定项目(定属) ↓ 种间鉴定项目 ↙ ↘ 判定种 不能判定种
不能判定种 ↓ 重复种的鉴定(n1) ↓ 追加试验项目(耐盐性试验、精氨酸产气、肽聚糖类型) ↓ 判定种
↘
重复种的鉴定(n2,n1>n2) ↓ 肽聚糖类型、GC%测定 ↓ 判定种
(二)基于rRNA序列的分子标记技术
原核生物rRNA有3种类型:23srRNA、 16srRNA 、5srRNA,对应约含有2900、 1540、120个碱基。rRNA 结构既具保守性 又具高变性。保守性反映生物物种的亲缘 关系, 高变性则揭示生物物种的特征核酸序 列, 是属种鉴定的分子基础。
1.16srDNA
(三)种间特异性PCR
鉴定:快速准确地在种和亚种甚至菌株水平 鉴定乳酸菌; 优缺点:引物设计较为复杂,只有在对鉴定 菌株完全了解的情况下才实用;
注: 方框框起来的是用一般生理生化试验区分比 较困难的,需进一步做分子水平的鉴定;
二、分子水平的鉴定
基于PCR的DNA指纹图谱技术 基于rRNA序列的分子标记技术
种间特异性PCR
(一)基于PCR的DNA指纹图谱技术
1.限制性片段长度多态性分析(RFLP) 优缺点: 种内水平,在亚种水平的鉴定优16srRNA; 2.随机扩增多态性DNA分析(RAPD) 优缺点: 简单、检测速度快,不需要知道基因组DNA的任 何序列信息即可分析;对反应条件敏感,重复性 差,难以达到种的水平;
标准菌株: 各种生化特性已研究清楚的标准菌株,可 用于检测试验的准确性和可靠性。
乳酸菌的分属
分离菌株(G+杆菌) ↙ ↘ 过氧化氢酶(-) 过氧化氢酶(+) ↙ ↘ ↓ 芽孢(+) 芽孢(-) 非乳酸菌 ↓ ↙ ↘ Sporolactobacillus 同型发酵 异型发酵 ↓ ↓
Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Carnobacterium
乳酸菌鉴定方法
有表型鉴定法(经典方法)和分子标记鉴定法。 表型鉴定法操作方便、成本低,但不能反应乳酸 菌的遗传性信息; 分子标记法快速,但成本相对较高,而且测定的 结果与前两者有不一致的现象。 所以不能只用一种方法对乳酸菌进行鉴定与分类, 几种方法结合起来综合判断可能更加准确。
一、表型鉴定:两歧法 二、分子水平: 基于PCR的DNA指纹图谱技术 基于rRNA序列的分子标记技术 种间特异性PCR
↘
重复种的鉴定 ↓ DNA同源性 ↓ 判定种
共通项目(16项):
1.生长状态观察 2.革兰氏染色 3.细胞的形态观察 4.H2O2酶试验 5.硝酸盐还原试验 6.石蕊牛乳试验 7.明胶液化试验 8.运动性试验 9.葡萄糖产气试验 10.pH生长试验 11.温度生长试验 12.糖发酵试验 13.发酵蔗糖产葡聚糖 14.发酵类型 15.乳酸旋光性 16.细胞壁中肽聚糖类型 17.精氨酸产气 18.耐盐性、好盐性试验
通过用特定引物进行PCR扩增,测序后 获得16srDNA的部分或全部序列,再与数 据库中序列数据进行比对,分析其在发育 树中的位置; 400~600碱基的序列足以对环境中微生 物的多样性和种群分类进行初步的估计, 但 这样短的序列通常不能用于新物种鉴定和 探针设计。
鉴定:属种水平,不能鉴定种内;
引物:
通用引物(肠道细菌及其相关细菌) F:ccgaattcgtcgacaac R:agagtttgatcatggctcac 全长引物(扩增产物约为1500bp) F:agagtttgatcctggctcag R:aaggaggtgatccagcc
2.16~23srDNA
不同菌株16~23srDNA基因间隔区有相当好 的保守性,同时比16srDNA具有更强变异 性; 鉴定:可用于种以下水平的分类鉴定,弥 补了16srRNA不能鉴别同源性高菌株的缺 陷;
乳酸菌的分类鉴定
时间:2013年乳杆菌属(Lactobacillus )、 链球菌属(Streptococeus)、 明串珠菌属(Leuconostoc)、 双歧杆菌属(Bifidobacterium)、 片球菌属(Pediococcus) 等在内的至少 23 个属。 每个属下面又发现若干个菌种,菌种下面还有若 干亚种,属于革兰氏阳性菌