微生物实验指导书-教材

微⽣物实验指导书-教材
微⽣物学实验指导书
⽬录
实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术 (3)
实验⼆培养基的配制 (8)
实验三从⼟壤中分离微⽣物及纯化 (11)
实验四微⽣物的接种技术 (14)
试验五细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察 (17)
实验六细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊ (20)
实验七⼤肠杆菌⽣长曲线的测定 (23)
实验⼋实验室环境和⼈体表⾯微⽣物的检查 (25)
实验九乳酸菌的检测 (28)
实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术
【⽬的要求】
1. 学习并掌握棉塞制作的⽬的、原理及⽅法；
2. 学习并掌握玻璃器⽫清洗及包扎⽅法；
3.掌握⾼压蒸汽灭菌的基本原理及操作⽅法。

4.了解其它常⽤消毒灭菌技术原理及技术
【基本原理】
棉塞的作⽤有⼆：⼀是防⽌杂菌污染，⼆是保证通⽓良好。

因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较⼤的影响。

微⽣物学实验所⽤的器⽫，⼤多数要进⾏清洗、消毒、灭菌，才能⽤来培养微⽣物。

玻璃器⽫的包扎⽅法正确合理，在使⽤过程中才能有效防⽌杂菌的污染。

玻璃器⽫包扎好后，⼀般⽤⾼压蒸⽓灭菌法进⾏灭菌。

⾼压蒸⽓灭菌是将待灭菌的物品放在⼀个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的⽔沸腾⽽产⽣蒸⽓。

待⽔蒸⽓急剧地将锅内的冷空⽓从排⽓阀中驱尽，然后关闭排⽓阀，继续加热，此时由于蒸⽓不能溢出，⽽增加了灭菌锅内的压⼒，从⽽使沸点增⾼，得到100℃以上的⾼温，导致菌体蛋⽩质凝固变性⽽达到灭菌的⽬的。

此外，常见灭菌⽅法还有⼲热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。

对空间灭菌常使⽤甲醛加⾼锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌⽅法。

【实验⽤品】
棉花，试管，培养⽫，纱布，三⾓瓶，棉线，量筒，⽜⽪纸（或旧报纸），LDZX-50KBS ⽴式⾼压蒸⽓灭菌锅，常⽤灭菌⽤具、药剂等等。

【⽅法步骤】
⼀、棉塞的制作
正确的棉塞要求形状，⼤⼩，松紧与试管⼝（或三⾓瓶⼝）完全适合，过紧妨碍空⽓流通，操作不便；过松则达不到滤菌的⽬的。

制作过程见图1，包括取棉花、整理、折⾓、卷紧、成形、塞试管等步骤。

塞上棉塞时，应使棉塞长度的1/3在试管⼝外，2/3在试管⼝内。

A. 内部框架
B. 带盖外筒图3 培养⽫⾦属灭菌筒图1 棉塞制作过程
做棉塞的棉花要选纤维较长的，⼀般不⽤脱脂棉做棉塞，因为它容易吸⽔变湿，造成污染，⽽且价格昂贵。

此外，在微⽣物实验和科研中，往往要⽤到通⽓塞，即⽤⼏层纱布（⼀般8层）相互重叠⽽成，或是在两层纱布间均匀铺⼀层棉花⽽成。

这种通⽓塞通常加在装有液体培养基的三⾓烧瓶⼝上。

经接种后，放在摇床上进⾏振荡培养，以获得良好的通⽓促使菌体的⽣长或发酵，通⽓塞的形状如图2。

A. 配制时纱布塞法；
B. 灭菌时包⽜⽪纸；
C. 培养时纱布翻出
图2通⽓塞
⼆、玻璃器⽫的清洗
1. 不能⽤有腐蚀性的化学试剂，也不能使⽤⽐玻璃硬度⼤的物品来擦拭玻璃器⽫；新的玻璃器⽫应⽤2%的盐酸溶液浸泡数⼩时，⽤⽔充分洗⼲净。

2. ⽤过的器⽫应⽴即洗涤。

3. 强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废液缸内。

4. 含有琼脂培养基的器⽫可先将培养基刮去，或⽤⽔蒸煮，⾄培养基融化后倒出，然后再⽤洗洁精清洗。

凡遇有传染性材料的器⽫，应经⾼压蒸汽灭菌后再进⾏清洗。

5. ⼀般的器⽫可以⽤去污粉、肥皂或洗洁精清洗，油脂很重的器⽫应先将油脂擦去。

沾有煤膏、焦油及树脂⼀类物质，可⽤浓硫酸或40%氢氧化钠或⽤洗液浸泡；沾有蜡或有油漆物，可加热使之熔融后揩去，或⽤有机溶剂（苯、⼆甲苯、汽油、丙酮等）揩去。

6. 载玻⽚或盖玻⽚，先擦去油垢再清洗⼲净，然
后在稀的洗液⾥浸泡2 ⼩时，⽤清⽔冲净，最后⽤蒸
馏⽔冲洗，⼲后浸于95%酒精中保存备⽤。

7. 洗涤后的器⽫应达到玻璃壁能被⽔均匀润湿
⽽⽆条纹和⽔珠。

三、玻璃器⽫的包装
1. 培养⽫的包装
培养⽫常⽤旧报纸紧紧包裹，⼀包7～10套，包好后
⼲热或湿热灭菌。

如果将培养⽫放⼊⾦属筒内进⾏⼲
热或湿热灭菌，则不必⽤纸包，⾦属筒有⼀圆筒形的
带盖外筒，⾥⾯放⼀装培养⽫的带底框架（图3），此
图5 LDZX-50KBS 灭菌锅
图6 LDZX-50KBS 灭菌锅及控制⾯板
框架可⾃圆筒内提出，以便装取培养⽫。

2. 移液管的包装
准备好⼲燥的移液管，在距其粗头顶端约0.5 cm 处，塞约1.5 cm 长的棉花，以免使⽤时将杂菌吹⼊其中，或不慎将微⽣物吸出管外。

棉花要松紧适当（过紧，吹吸液体太费⼒；过松，吹⽓时棉花会下滑），接着按图4⽅法包扎，后将移液管集中在⼀起，⽤⼀张⼤报纸包好，进⾏⼲热或湿热灭菌。

图4 移液管的包扎⽅法与步骤
3. 试管和三⾓瓶的包扎
试管管⼝和三⾓瓶瓶⼝塞上棉花塞或硅胶塞后，再⽤双层报纸包扎好（如有⽜⽪纸，效果更好），进⾏⼲热或湿热灭菌。

试管较多时，⼀般7个或10个⼀组，再⽤双层报纸包扎。

四、灭菌及净化设备操作技术
（⼀）⾼压灭菌锅的使⽤
利⽤⾼压⽔蒸汽⾼强度穿透细胞杀灭⼀切微⽣物及细胞。

主要灭菌原理是⾼温度⽔蒸⽓（⼀般为121℃）作⽤于细胞⼀定时间（⼀般为20-30分钟）使细胞蛋⽩质凝固变性，⽽造成⼀切微⽣物变性死亡，是最为彻底的灭菌⽅法之⼀。

主要操作技术见教材及实验操作步骤部分。

（⼆）超净⼯作台的使⽤
1）依次打开电源开关及⼯作开关，紫外灯照射20 min ，开启⿎风机运转10 min ，⽅可进⾏实验操作。

2）将紫外灯切换到照明灯（⿎风机保持运转），打开玻璃门（玻璃门开启幅度不能过⾼，以不超过下巴为宜），⼿臂进⼊操作台前先点燃酒精灯，再⽤75%
的酒精棉球擦净⼯作
图7 摆斜⾯
图9 电热⼲燥箱外观和结构
图8微孔滤膜过滤器装置构⾯，并对
⼿进⾏消毒。

3）操作时，应在⼯作台中央⽆菌区域进⾏（尽量
不要讲话）。

4）操作完毕后熄灭酒精灯，清理⼯作台。

离开前，
关闭⼯作台⼯作开关及电源开关，将所有物品归位，并带
⾛废弃物。

（三）其他常⽤灭菌⼯具
五、实验具体操作步骤
1. 器⽫清洗：将试管、三⾓瓶、培养⽫等玻璃器具清洗⼲净；
2. 烘⼲：将经清洗⼲净的试管、三⾓瓶、培养⽫等玻璃器⽫放⼊烘箱中，并相互之间保持适当间距，以保证烘⼲效果；打开烘箱电源，设置适当温度（可根据具体情况⽽定）与时间，进⾏烘⼲处理；
3. 制作棉塞：按照选取棉花、棉花整理、折⾓、卷紧、成形、试塞、调整⼤⼩等步骤，制作合适棉塞，应使棉塞长度的1/3在试管⼝外，2/3在试管（或三⾓瓶）⼝内。

另⽤量筒或吸管取适量⾃来⽔于三⾓瓶和试管中，包扎好以制备⽆菌⽔。

4. 包扎：⽤⽜⽪纸或旧报纸，⼀次包扎7～10套培养⽫，按照裁剪⽜⽪纸、放置培养⽫等玻璃器⽫、卷紧、折边、包扎等步骤，包扎好后空培养⽫、移液管等，做到美观⼤⽅、放置不到、包扎紧密，严防玻璃器⽫等露出。

5. 灭菌处理：1）打开电源与开关，检查⽔位显⽰灯，视⽔位显⽰灯状况，不加或添加适量⽔（⾼⽔位：不必加⽔；低⽔位：视情况⽽定；缺⽔：必加⽔；⽆显⽰：视情况⽽定）。

2）加灭菌物品（注意：物品不能过于密集，否则会影响灭菌效果）。

3）将锅盖旋到灭菌锅正上⽅密封处（注意：锅盖⽤⼿提着缓慢旋⾄正上⽅，不要触及密封圈，造成密封圈破损，也不要将锅盖旋得太⾼，否则锅盖⽆法归位⾄正上⽅）。

4）按待灭菌物品的要求，设定温度和时间。

5）进⼊⼯作状态后，查看排⽓（⽔）阀，将阀门旋⾄排⽓处。

6）待有⼤量⽩⾊蒸汽产⽣时，关闭排⽓阀，关闭后温度持续上升
（注意：在使⽤⾼压
蒸⽓灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空⽓的排除是否完全极为重要）。

7）灭菌结束，压⼒降⾄“0”时，打开排⽓阀，⽓体排尽后，⽅可开盖，利⽤锅内温度烤⼲棉塞和纱布后再取物。

（注意：压⼒⼀定要降到"0"时，才能打开排⽓阀，开盖取物，否则就会因锅内压⼒突然下降，使容器内的培养基由于内外压⼒不平衡⽽冲出烧瓶⼝或试管⼝，造成棉塞沾染培养基⽽发⽣污染，甚⾄灼伤操作者）。

3、其他常见灭菌⽅式
【实验结果】
记录⾃⼰制作的实验⽤品（含⽆菌⽔）的名称、规格与数量。

【注意事项】
1. 实验前，熟悉实验室布局，了解实验仪器⽤品摆放规律及⽤途；
2. 制备⽆菌⽔时，试管装⽔量⼀般控制在试管⾼度的1/5~3/5，三⾓瓶装⽔量不宜超过规格
容量的1/2（装量过多，灭菌过程中易喷出或润湿棉塞）；
3. 灭菌锅的操作安全。

【实验思考题】
1. ⾼压蒸⽓灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空⽓排尽？
2. 灭菌完毕后，为什么待压⼒降低⾄“0”时，才能打开排⽓阀，开盖取物？
3. 在使⽤⾼压蒸⽓灭菌锅灭菌时，怎样杜绝⼀切不安全的因素？
4. 灭菌在微⽣物实验操作中有何重要意义？
实验⼆培养基的配制
【⽬的要求】
1. 掌握培养基的配制原理；
2. 通过对⼏种培养基的配制，掌握配制培养基的⼀般⽅法和步骤。

【基本原理】
培养基是⼈⼯配制的适合微⽣物⽣长繁殖或积累代谢产物的营养基质，⽤以培养、分离、鉴定、保存各种微⽣物或积累代谢产物。

培养基的原材料可分为碳源、氮源、能源、⽆机盐、⽣长因素和⽔。

本实验通过配制适⽤于⼀般细菌、放线菌和真菌的三种培养基来了解和掌握配制培养基的基本原理和⽅法。

培养细菌⼀般⽤⽜⾁膏蛋⽩胨培养基，它是⼀种应⽤⼗分⼴泛的天然培养基，其中的⽜⾁膏为微⽣物提供碳源、能源、磷酸盐和维⽣素，蛋⽩胨主要提供氮源和维⽣素，⽽NaCl 则提供⽆机盐。

⾼⽒Ⅰ号培养基是⽤来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基，此合成培养基含有多种化学成分已知的⽆机盐，这些⽆机盐可能相互作⽤⽽产⽣沉淀，因此，在混合各成分时，⼀般按配⽅要求的顺序依次溶解各成分；此外，合成培养基有的还要补充微量元素，如⾼⽒Ⅰ号培养基中的FeSO4·7H2O的⽤量仅为0.001%，在制备培养基时需预先配成⾼浓度的微量元素贮备液，然后再按⼀定的量加到培养基中。

查⽒培养基是⽤来分离和培养霉菌的合成培养基；麦⽒培养基是⽤来分离和培养酵母菌的半合成培养基。

培养基各成分添加完成后，⽤稀酸或稀碱将其pH值调⾄所需酸碱度，在配制固体培养基时，还要加⼊⼀定量的琼脂作为凝固剂。

培养基配制完成后，应⽴即进⾏灭菌。

【实验⽤品】
1. 药品、试剂⽜⾁膏，蛋⽩胨，NaCl，可溶性淀粉，KNO3，K2HPO4·3 H2O，MgSO4·7 H2O，
FeSO4·7 H2O，蔗糖，NaNO3，KCl，葡萄糖，KCl，酵母膏，醋酸钠，lmol/L NaOH，lmol/L HCl，琼脂
2. 仪器及其它⽤品试管，三⾓瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，⽜⾓匙，pH试纸，棉花，
⽜⽪纸，记号笔，线绳，纱布，漏⽃，漏⽃架，胶管等
【⽅法步骤】
⼀、⽜⾁膏蛋⽩胨培养基的配制
（⼀）配⽅：⽜⾁膏5g，蛋⽩胨10g，NaC1 5g，琼脂15~20g，⽔1000mL，pH7.4~7.6；（⼆）步骤：
1. 称量按配⽅计算实际⽤量后，称取各种药品放⼊烧杯中。

⽜⾁膏常⽤玻璃棒挑取，放
⼊⼩烧杯或表⾯⽫中称量，⽤热⽔溶化后倒⼊烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放⼊热⽔中，待⽜⾁膏与称量纸分离，⽴即取出纸⽚。

蛋⽩胨极易吸潮，故称量时要迅速。

2. 溶化在烧杯中加⼊少于所需要的⽔量，置放在电热套上，⼩⽕加热，并⽤玻棒搅拌，
待药品完全溶解后再补充⽔分⾄所需量。

若配制固体培养基，则将称好的琼脂放⼊⼰溶
图10 简易分装器图11 倒平板⽅法解的药品中，加热融化，最后补⾜所失的⽔分。

3. 调pH 检测培养基的pH ，若pH 偏酸，可滴加lmol/L NaOH ，边加边搅拌，并随时⽤pH 试纸检测，直⾄达到所需pH 范围。

若偏碱，则⽤lmol/L HCl 进⾏调节。

pH 的调节通常放在加琼脂之前。

应注意pH 值不要调过头，以免回调⽽影响培养基内各离⼦的浓度。

4. 过滤液体培养基可⽤滤纸过滤，固体培养基可⽤4层
纱布趁热过滤，以利培养的观察。

但是供⼀般使⽤的培养
基，这步可省略。

5. 分装按实验要求，可将配制的培养基分装⼊试管或三
⾓瓶内。

分装时可⽤漏⽃或分装器以免使培养基沾在管⼝
或瓶⼝上⽽造成污染。

分装量：固体培养基约为试管⾼度的l/5，灭菌后制成
斜⾯。

分装⼊三⾓瓶内以不超过其容积的⼀半为宜。

半固
体培养基以试管⾼度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

6. 加棉塞试管⼝和三⾓瓶⼝塞上⽤普通棉花（⾮
脱脂棉）制作的棉塞。

棉塞的形状，⼤⼩和松紧度要合适，
四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防⽌杂菌侵⼊和有利通⽓的作⽤。

有些微⽣物需要
更好的通⽓，则可⽤通⽓塞。

有时也可⽤硅胶塞、试管帽
或塑料塞代替棉塞。

7. 包扎加塞后，将三⾓瓶的棉塞外包⼀层⽜⽪纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝⽔沾湿棉塞。

若培养基分装于试管中，则应以5～7⽀在⼀起，再于棉塞外包⼀层⽜⽪纸，⽤绳扎好。

然后⽤记号笔注明，培养基名称，组别，⽇期。

8. 灭菌将上述培养基于121℃，湿热灭菌20min 。

如因特殊情况不能及时灭菌，应放⼊冰箱内暂存。

9. 倒平板摆斜⾯灭菌后，倒平板或制斜⾯。

如制斜⾯应趁灭菌后未冷却前摆放成斜⾯，
倒平板可放置到需要时，再加热溶化制作。

10. ⽆菌检查将灭菌的培养基放⼊37℃恒温培养箱
中培养24～48h ，⽆菌⽣长即可使⽤，或贮存于冰箱
或清洁的橱内，备⽤。

⼆、⾼⽒Ⅰ号培养基的配制
（⼀）配⽅：可溶性淀粉20g ，KNO3 1g ，NaCl 0.5g ，
K2HPO4·3H2O 0.5g ，MgSO4·7H2O 0.5g ，FeSO4·7H2O
0.01g ，琼脂15~20g ，⽔1000mL ，pH7.4~7.6。

（⼆）步骤：
l. 称量和溶解先计算后称量，按⽤量先称取可溶性
淀粉，放⼊⼩烧杯中，并⽤少量冷⽔将其调成糊状，
再加⾄少于所需⽔量的⽔，继续加热，边加热边搅拌，
⾄其完全溶解。

再加⼊其他成分依次溶解。

对微量成分FeSO 4·7H 2O 可先配成⾼浓度的贮备液后再加⼊，⽅法是先在1000mL ⽔中加⼊1g 的FeSO 4·7H 2O ，配成浓度为
0.01g/mL
的贮备液，再在1000mL培养基中加⼊以上贮备液1mL即可。

待所有药品完全溶解后，补充⽔分到所需的总体积。

如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同⽜⾁膏蛋⽩胨培养基配制。

2. pH调节，分装，包扎，灭菌及⽆菌检查同⽜⾁膏蛋⽩胨培养基配制。

三、PDA培养基的配制
（⼀）配⽅：马铃薯（去⽪）200克，葡萄糖20克，琼脂15~20g，⽔1000mL，pH⾃然（⼆）步骤：称取洗净去⽪马铃薯200g，切成⼩块，加⽔煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），⽤⼋层纱布过滤，取滤液，加热，再据实际实验需要加⼊琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加⼊葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补⾜⽔分⾄1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121℃灭菌20-30分钟左右后取出，试管摆斜⾯或者摇匀，冷却后贮存备⽤。

【实验结果】
记录本实验配制培养基的名称，数量，并说明⽆菌检查结果，培养基状况及可否使⽤等。

【注意事项】
1. 称药品⽤的⽜⾓匙不要混⽤，称完药品应及时盖紧瓶盖。

2. 培养基配制加热过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出。

3. 灭菌锅操作安全及摆斜⾯要求。

【实验思考题】
1. 培养基配制完成后，为什么必须⽴即灭菌，若不能及时灭菌应如何处理。

2. 已灭菌的培养基应如何进⾏⽆菌检查。

3. 试设计实验对饮料进⾏⽆菌检查。

图12 ⼟壤梯度稀释操作过程图13平板涂布操作图
实验三从⼟壤中分离微⽣物及纯化
【⽬的要求】
1. 了解学习分离、纯化技术的概念。

2. 学习掌握涂布、划线等稀释分离微⽣物技术。

分离就是把成群的菌体⼀个⼀个地分开；纯化就是进⼀步分离，把菌种绝底分成单个菌体的技术。

要想从含有多种多样、多姿多态微⽣物的⾃然界中获得我们所需的菌（菌株），就要通过各种⼿段⽅法把⼀个⼀个微⽣物分离开，然后从中挑选出我们所需要的菌株应⽤于研究或⽣产之中。

分离技术有许多种，下⾯着重介绍从⼟壤中通过划线法分离细菌、放线菌、霉菌的技术。

【实验⽤品】
1. 药品及试剂⽜⾁膏蛋⽩胨平板、⾼⽒1号平板（含1%酚液5~6滴/L ）、PDA 平板（含80%红酸1mL/L ），⼟壤样品，⽆菌⽔等。

2. 仪器及其它⽤品接种环，酒精灯，超净⼯作台等。

【⽅法步骤】
取⼟壤少许，加⼊⼀定量的⽆菌⽔，制成系列⼟壤菌悬液。

1、涂布法： 1）取⼟样取
表层以下5～10 cm 处的⼟壤，放⼊取样袋中，置于4℃冰箱中暂存。

2）⼟样处理取⼟样10 g ，迅速倒⼊带玻璃珠的90 mL ⽆菌⽔瓶中（玻璃珠⽤量以充满瓶底为宜），振荡15～25 min ，使⼟样充分打散。

3）梯度稀释⽤1 mL 的⽆菌移液管，从中吸取1 mL 的⼟壤悬液加⼊盛有9 mL ⽆菌⽔的试管中，充分混匀，然后⽤⽆菌移液管从此试管中吸取1 mL 加⼊另⼀盛有9 mL ⽆菌⽔的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2.、10-3、10-4、10-5等不同梯度的⼟壤溶液
（操作时移液管尖不能接触液⾯，每⼀个稀释度换⽤⼀⽀移液管，每次吸⼊⼟液后，要将
图14平板划线法操作图
图15 平板划线法操作图移液管插⼊液⾯，吹吸3次，每次吸上的液⾯要⾼于前⼀次，以减少稀释中的误差）。

4）涂布取平板，⽫底分别⽤记号笔写上稀释度，然后⽤⽆菌移液管分别从10-6. 10-5. 10-4三管⼟壤稀释液中各吸取0.1 mL 对号放⼊已写好稀释度的平板中（从低浓度到⾼浓度依次取，不⽤更换移液管），⽤⽆菌玻璃涂布棒按图13，在培养基表⾯轻轻涂布均匀，室温下静置5～10 min ，使菌液吸附进培养基。

2、划线分离法（在接种室或超净⼯作台内进⾏）
（1）直线划线法：左⼿拿平板平⽫，盖稍微打开，右⼿拿接种环，以⽆菌操作蘸⼀
环⼟壤菌悬液，在平板⼀边划第⼀道平⾏线2~3条，转动
培养⽫约70度⾓，⽤烧灼过的接种环，待冷却后，接种
环从第⼀道线划过做第⼆道平⾏线，同法划第三道平⾏
线，如此划第四道平⾏线（如图14、15）。

每种培养基划
线⼀套。

（2）曲线划线法：其它操作如同直线法，只是划线
是划成曲线。

每种培养基划线⼀套。

（3）划线完后，把平⽫倒置放在30℃下培养，细菌
分离要培养24~48h ，放线菌分离要培养5~7d ；霉菌分离
要培养3~5d 。

观察⽣长的菌落（图5-3），再作进⼀步的
分离纯化或直接挑取单个菌落接⼊斜⾯培养后保存备⽤。

3、挑取单菌落进⼀步划线或涂布纯化。

【实验结果】
记录本实验结束后有⽆微⽣物⽣长，微⽣物主要种类及菌落形态特征。

1、分离纯化操作全过程要在⽆菌室或超净⼯作台内进⾏。

2、划线时时，接种环要圆滑；接种环与平板成45°⾓，⽤⼿腕⼒轻巧地在平⾯上滑动，避免划破培养基；防⽌在空间划线。

【实验思考题】
1、⽐较细菌、放线菌、霉菌分离菌落的不同。

2、划线分离过程中，划完第⼀道线后再划第⼆道线时，为什么接种环要在⽕焰上烧灼冷却后再划线呢？
3、试设计从⽔果（如葡萄或雪梨）中分离酵母菌的实验。

实验四微⽣物的接种技术
【⽬的要求】
1. 了解学习⽆菌操作技术；
2. 掌握斜⾯接种技术。

【基本原理】
接种就是在灭菌条件下，⽤接种⼯具（针、环）（如
图18）从⼀⽀原菌种中挑取少许菌体，接⼊到另⼀⽀新的
培养基上进扩⼤培养的技术。

接种就是在灭菌条件下，⽤
接种⼯具（针、环）从⼀⽀原菌种中挑取少许菌体，
接⼊到另⼀⽀新的培养基上进扩⼤培养的技术。

我们要想得到⼤量的菌种，适应⽣产，科研和教
学要求，就要进⾏微⽣物的接种，扩⼤菌种数量。

接种因使⽤不同容器、不同的培养基，达到不同的⽬的，⽽有不同的接种⽅法，但是它们的基本要求是相同的。

通常接种都应在空⽓经过消毒灭菌过的“接种室”、或接种箱或超净⼯作台内进⾏。

【实验⽤品】
1. 实验材料苏云⾦杆菌斜⾯菌种，⽜⾁膏蛋⽩胨斜⾯培养基等。

2.实验试剂 75%酒精或1：50的新法尔天⽔溶液。

3.实验设备仪器超净⼯作台，接种针（环），接种⼯具、酒精灯等。

【⽅法步骤】
（⼀）准备⼯作
1．接种或接种室使⽤前半天先擦洗⼲净，然后每⽴⽅⽶体积⽤5~10毫升福尔马林盛在容器中加热熏蒸或者是⽤1/10的福尔马林重量的⾼锰酸钾加到盛有福尔马林的容器中，不⽤加热，亦可进⾏熏蒸；也可⽤5%的⽯炭酸喷务灭菌；⽤紫外灯照射
20~30min 。

也可达到灭菌的⽬的。

应注意，要把接种时要所需的⽤具（如接种针（环），酒精灯等）及培养基放⼊接种箱（室）⼀起灭菌消毒，但是菌种不能放⼊，以免死。

超净⼯作要预先通风，紫外线照射30min ⽅可使⽤。

2．进⼊接种室前先把⼿洗净，再⽤75%酒精或新洁尔灭擦两⼿，菌种试管表⾯同样要⽤酒精或新洁尔灭抹擦后才放⼊接种室（箱内）。

（⼆）接种技术
1、斜⾯菌种接种技术（从斜⾯培养基上的菌
种接种⾄另⼀新的斜⾯培养基上的⽅法）。

（1）准备⼯作就绪后，点然酒精灯。

图18
接种⼯具
（2）将菌种和斜⾯培养基的两⽀试管⽤⼤拇指和其他四指握在左⼿中，使中指拉于两试管之间的部分，斜⾯向上，并使它们拉于⽔平位置，也可将试管放在左⼿掌中，⽤⼿指托住试管。

（3）先将棉塞⽤右⼿拧转松动，便以接种时
拔出。

（4）右⼿拿接种环（拿的⽅法就和拿钢笔⼀样），在⽕焰上将环的部分烧红灭菌。

环
以上凡是在接种时可能进⼊试管的部分，均应⽤⽕烧过（如图20）。

以下操作都要把试管⼝靠近⽕焰旁进⾏。

（5）⽤右⼿⼩指、⽆名指和⼿掌拔掉棉塞（如图20）。

（6）⽤⽕焰灼烧管⼝，灼烧时应不断转动试管⼝（靠⼿腕的动作，使试管⼝沾染的⼩量菌得以烧死）。

（如图20）。

（7）将烧过的接种针（环）触动没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的菌体，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种针（环）抽出试管（如图20）。

（8）迅速将接种针（环）在⽕焰旁⽆菌区伸进另⼀试管，在培养基斜⾯上轻轻划线，在上⾯接细菌，划线时要由底部划到顶部，由上⽽上，划线可划之字形，或划⼏条直线，但都不要把培养基划破，也不要使菌种沾污管壁（如图20）。

（9）将接种针（环）抽出，灼烧试管⼝，并在⽕焰旁将棉塞塞上。

塞棉塞时，不要⽤试管去迎棉塞，以免试管在运动时纳⼊不洁空⽓（如图20）。

（10）.把针（环）在⽕焰上再灼红灭菌，放下接种钟（环）后，再腾出⼿来将塞塞紧。

（如图20）。

（11）全部培养基接种完毕后，要将试管斜⾯培养基包扎好，并标明姓名、时间和菌种名称；整理好接种室（箱）的台⾯，搞好清洁卫⽣。

2、液体接种技术（由斜⾯菌接⼊液体培养基内或液体菌种接⼊液体培养基）
（1）准备⼯作和操作⽅法与前相同，但可使试管向上略斜，以免培养液流出。

（2）将取得菌种的接种环送⼊液体培养基时，可使环在液体表⾯与管壁接触的部分轻轻摩擦。

接种后塞棉塞，将试管在⼿掌中轻轻摇动，使菌体在培养基中分散开来。

（3）由液体菌种接种液体培养基时，接种⽤⽆菌滴管或移液管，接种量通常为培养液体积的1/10。

⽆菌操作的注意事项与前相同，只是移液管不同于接种针，系由玻璃做成，它不能在⽕焰上灼烧，接种前在⽕焰上迅速通过⼀两
次即可。

3、穿刺接种技术（深层柱形固体培养基的接种技术）
（如图21）
（1）取两⽀新鲜半固体⽜⾁膏蛋⽩胨深层柱状
培养基，做好标记（写上菌种名、接种⽇期和接种
⼈等）。

（2）接种的⽅法是，⽤接种针沾取少量待接菌
种，然后从柱状培养基的表⾯中⼼穿⼊其底部（但
不要穿透），然后沿原刺⼊路线抽出接种针，注意接
种针不要移动。

以上接好种的材料置于30℃下培养24~48h 。

【实验结果】
培养后取出试管，观察菌种⽣长情况，检查是否有杂菌⽣长，评价⽆菌操作的效果。

【注意事项】
1、菌种取出后，接种针（环）不要通过⽕焰、以免烧死菌体。

2、斜⾯接种时，不要使接种针（环）的碰到管壁；不要划破培养基，但也不能在试管空间划，⼀定要接触到斜⾯表⾯上划线接种。

3、接种前的准备和接种过程都要有⽆菌概念。

【实验思考题】
微⽣物接种时，通过哪些措施可防⽌杂菌污染？
试验五细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察
【⽬的要求】
1. 了解枯草芽孢杆菌、⼤肠杆菌、链霉菌、啤酒酵母及⽑霉(Mucor)、根霉(Rhizophs)?、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、⽊霉(Trichoderma)等常见微⽣物形态构造；
2.进⼀步巩固细菌、霉菌、酵母菌和放线菌
的代表种类的菌落特征；
3.了解细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的繁殖
⽅式及特点。

【基本原理】
微⽣物的菌落特征是指微⽣物在平板上⽣
长，所表现出的群体形态特征。

每⼀种类微⽣
物菌落具有各⾃相对稳定的特征，例如菌落的
⼤⼩，菌落边缘形状、隆起形状、表⾯形态，
菌落透明或不透明等。

这些特征可⽤于快速识
别、鉴定微⽣物，在科研和⽣产实践中常被采
⽤。

细菌为单细胞微⽣物，⼤⼩仅为数毫⽶；
放线菌丝状，菌丝直径与细菌相接近；酵母菌为真核细胞；霉菌由菌丝组成，许多菌丝交织在⼀起形成菌丝体。

在固体培养基上长成绒⽑或棉絮状。

霉菌的繁殖⽅式多种多样，有⽆性和有性⽣殖⽅式。

因此各类微⽣物较容易区别。

【实验⽤品】
1. 实验材料枯草芽孢杆菌、⼤肠杆菌、链霉菌、啤酒酵母及⽑霉、根霉、曲霉、青霉、⽊霉等常见微⽣物菌落平板及永久固定装⽚；
2.实验试剂 75%酒精，95％酒精，乳酸⽯碳酸棉兰液，蒸馏⽔等；
3.实验设备仪器载玻⽚，盖玻⽚，解剖针，镊⼦，酒精灯，显微镜等。

【⽅法步骤】
⼀、观察并⽐较常见微⽣物菌落形态
依次观察各类微⽣物平板，注意并记录各种微⽣物菌落形态特征。

⼆、观察细菌形态结构
1.在洁净的载玻⽚上滴⼀滴蒸馏⽔，然后⽤⽆菌镊⼦镊取少量菌体于⽔滴中，⽤解剖针将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻⽚?(注意不要产⽣⽓泡，并不要移动载玻⽚)。

2.先⽤显微镜低倍镜观察，再转⾼倍镜及油镜观察。

注意观察细胞形状，各部分结构，以及是否有芽孢等。

三、观察放线菌菌丝体形态结构
1.在洁净的载玻⽚上滴⼀滴蒸馏⽔，然后⽤⽆菌镊⼦镊取少量菌丝于⽔滴中，⽤解剖针图22 微⽣物菌落的培养特征
将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻⽚?(注意不要产⽣⽓泡，并不要移动载玻⽚，以免弄乱菌丝)。

2.先⽤显微镜低倍镜观察，再转⾼倍镜观察菌丝及孢⼦器各部分的特征。

四、观察酵母菌形态结构
1.在洁净的载玻⽚上滴⼀滴蒸馏⽔，然后⽤⽆菌镊⼦镊取少量菌量于⽔滴中，⽤解剖针将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻⽚?。

2.先⽤显微镜低倍镜观察，再转⾼倍镜及油镜观察。

注意观察细胞形状，各部分结构，以及是否正在进⾏出芽⽣殖等。

五、观察霉菌菌丝体形态结构
1.在洁净的载玻⽚上滴⼀滴蒸馏⽔，然后⽤⽆菌镊⼦镊取少量菌丝于⽔滴中，⽤解剖针将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻⽚?(注意不要产⽣⽓泡，并不要移动载玻⽚，以免弄乱菌丝)。

2.先⽤显微镜低倍镜观察，再转⾼倍镜观察菌丝及孢⼦器各部分的特征。

附：若需长时间的观察霉菌的形态，可制成永久⽚，制作⽅法为：
1.在洁净载玻⽚上滴⼀滴乳酸⽯碳酸棉兰液，然后挑取要观察的菌丝少许于染⾊液中，⽤解剖针仔细将其分开，然后盖上盖玻⽚，放置1～2天。

2.在制取的⽚中⽤阿拉伯胶(或合成树脂、加拿⼤胶)将盖玻⽚四周封好，待凝固后即可进⾏观察，也可放置起来作为永久⽚保存。

五、观察常见微⽣物永久装⽚
观察枯草芽孢杆菌、⼤肠杆菌、链霉菌、啤酒酵母及⽑霉、根霉、曲霉、青霉、⽊霉等永久装⽚，尤其注意其是否正在进⾏分裂及⽆性孢⼦、有性孢⼦繁殖结构及特点。

附根霉接合孢⼦形成的观察：
1.取⿊根霉Rh＋和Rh－菌株分别划线接种于马铃薯培养基平板两侧，置30℃恒温箱培养4～7天。

2.?培养4天后，Rh(＋)和Rh(－)菌株互相邻近的两个菌丝各向对⽅⽣出极短的侧丝，逐渐互相接触，顶端各⾃膨⼤并形成横隔，即为配⼦囊。

3.配⼦囊接触后中间的隔膜消失，⼆者的细胞质和细胞核互相融合，同时外部形成厚壁，成为接合孢⼦。

4.⽤⽔浸⽚仔细观察接合孢⼦形成的各个阶段。

【实验结果】
1、填表⽐较四⼤微⽣物形态特征
项⽬细菌放线菌酵母菌霉菌
菌落。