一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201610073412.7
(22)申请日 2016.02.03
C12N 5/0775(2010.01)
C12Q 1/02(2006.01)
C12Q 1/68(2006.01)
G01N 15/14(2006.01)
(71)申请人广西大学
地址530004 广西壮族自治区南宁市西乡塘
区大学东路100号广西大学动物科学
技术学院
(72)发明人杨素芳 韩杰 李海洋 邓彦飞
石德顺 朱鹏 杨海燕 韦精卫
李湘萍 黄奔
(54)发明名称
一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法
(57)摘要
本发明公开了一种猪脂肪干细胞分离培养及
鉴定的方法，包括以下步骤，1)脂肪干细胞的分
离培养和纯化；2)脂肪干细胞的传代培养；按照
本发明方法所得到的脂肪干细胞遗传稳定性好，
体外连续培养到15代仍然保持遗传稳定性；干性
好，体外培养传代到第18代仍具有间充质干细胞
表面抗原特性；多向分化性能好，具有向成骨细
胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化的能力。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书12页 附图5页CN 105602896 A 2016.05.25
C N 105602896
A
1.一种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：
1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤，细胞筛过滤后进行梯度离心，所述的细胞筛过滤和梯度离心重复两次，然后进行细胞培养，
所述消化采用Liberase TL进行，所述消化的温度为37℃，时间为1～3h；所述的Liberase TL的浓度为15～25μg/mL，Liberase TL与脂肪组织的体积比为0.5～1∶1；
2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的脂肪组织消化前还包括以下步骤：
采集猪脂肪组织；
将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液为含有0.45～0.5g/L 青霉素和0.6～1.0g/L链霉素的PBS溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪组织消化后还包括终止消化，所述终止消化具体为：
使用含体积分数为7.5～15％FBS的低糖DMEM培养液终止消化，所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞筛过滤按照时间顺序包括第一细胞筛过滤和第二细胞筛过滤；
所述第一细胞筛过滤中细胞筛的孔径为100μm，所述第二细胞筛过滤中细胞筛的孔径为70μm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的梯度离心按照时间顺序包括第一离心和第二离心；
所述第一离心的转速为1000～1400rpm，所述第一离心的时间为8～12min；
所述第二离心的转速为8000～1200rpm，所述第二离心的时间为8～12min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传代培养采用的培养液为含有体积分数为
7.5～15％％FBS的低糖DMEM培养液，所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

7.一种猪脂肪干细胞的鉴定方法，包括以下步骤：
将猪脂肪干细胞进行生物学特性鉴定、表面抗原检测和诱导分化检测。

8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于所述生物学特性鉴定包括测定生长曲线、测定细胞集落和分析细胞核型。

9.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于：所述脂肪干细胞表面抗原检测前还包括：
将所述脂肪干细胞依次进行预消化和消化；
所述预消化采用Liberase TL进行，所述Liberase TL的浓度为15～25μg/mL，所述预消化的时间为1～3min，所述预消化的温度为37℃，所述预消化的环境中的CO2的体积比例为5％，所述预消化的环境中的湿度为饱和湿度；所述消化采用胰蛋白酶和EDTA进行，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.25％，所述EDTA的质量浓度为0.03～0.05％，所述消化的温度为37℃，CO2饱和湿度为5％，所述消化的时间为1～3min。

10.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，所述的脂肪干细胞诱导分化检测，包
括以下步骤：
培养猪脂肪干细胞，当细胞汇合度达到80％-90％时，加入成脂诱导液、成骨诱导液和成软骨诱导液进行为期2～4周的成脂、成骨和成软骨细胞诱导；
将诱导培养到期的细胞分别进行油红O、茜素红和阿尔新蓝染色；
将诱导培养到期的细胞进行成脂特异性基因Ppar-2、成骨特异性基因Osteocalcin和成软骨特异性基因Collagen II检测；
所述的油红O、茜素红和阿尔新蓝染色和所述的成脂特异性基因Ppar-2、成骨特异性基因Osteocalcin和成软骨特异性基因Collagen II检测之间无时间顺序限定。

一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法
技术领域
[0001]本发明涉及动物细胞培养领域，尤其涉及一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法。

背景技术
[0002]胚胎干细胞的研究遇到伦理、法律的瓶颈之后，成体干细胞日益成为研究的热点。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于脐带血、骨髓、肌肉、皮肤和脂肪等组织中的一类成体干细胞，MSCs来源可靠，具有自我更新，且具有向多种组织分化潜能，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。

脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，脂肪干细胞)是近年来从脂肪组织中分离得到的一类成体间充质干细胞，具有自我更新及向分化潜能。

脂肪干细胞由于具有安全、易获得、可迅速扩增和多向分化能力等特点使其成为现有干细胞生物工程研究的最理想来源。

目前临床上已利用这种细胞进行基因治疗、干细胞治疗及骨组织工程的修复等，在再生医学领域具有广泛的应用前景。

[0003]2006年，国际细胞治疗协会(间充质干细胞委员会)(Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy)认为人类的MSCs的必须满足以下三个条件：(1)在标准的细胞培养条件下，MSCs必须具备可贴壁性生长；(2)MSCs应该高表达CD73、CD90、CD105；而应低表达或不表达CD14、CD45、CD11b、CD34、CD79、CD19以及人白细胞抗原(HLA-DR)。

(3)在特定的诱导液培养下，MSCs必须具有向骨、脂肪和软骨分化的能力。

由于目前脂肪干细胞并没有特定的表面标志，因此对它们的鉴定主要采用流式细胞仪检测细胞表面标志和将脂肪干细胞进行成脂、成骨和成软骨的诱导分化来确定它们是否为脂肪干细胞。

这是目前公认的间充质干细胞鉴定方法。

[0004]在现有技术中，猪脂肪干细胞在体外连续培养后，容易老化，核型发生改变、表面抗原发生变化、且多向分化能力仅局限于向成骨或成骨和成脂肪细胞方向分化(Zhang et al.(2014).PLoS ONE 9(1)：e85089.doi：10.1371/journal.pone.0085089；Huang et al.Stem Cell Research&Therapy(2015)6：77)，没有向成软骨细胞方向诱导成功的报道。

脂肪干细胞的老化限制了其在脂肪组织工程及其他组织工程中研究和应用。

发明内容
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种遗传稳定性好，干性好，多向分化性能好的脂肪干细胞培养的方法。

[0006]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007]一种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：
[0008]1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤，细胞筛过滤后进行梯度离心，所述的细胞筛过滤和梯度离心重复两次，然后进行细胞培养，
[0009]所述消化采用Liberase TL进行，所述消化的温度为37℃，时间为1～3h；所述的
Liberase TL的浓度为15～25μg/mL，Liberase TL与脂肪组织的体积比为0.5～1∶1；[0010]2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。

[0011]优选的，步骤1)中所述的脂肪组织消化前还包括以下步骤：
[0012]采集猪脂肪组织；
[0013]将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液为含有0.45～0.5g/L青霉素和0.6～1.0g/L链霉素的PBS溶液。

[0014]优选的，所述的脂肪组织消化后还包括终止消化，所述终止消化具体为：[0015]使用含体积分数为7.5～15％FBS的低糖DMEM培养液终止消化，所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

[0016]优选的，所述的细胞筛过滤按照时间顺序包括第一细胞筛过滤和第二细胞筛过滤；
[0017]所述第一细胞筛过滤中细胞筛的孔径为100μm，所述第二细胞筛过滤中细胞筛的孔径为70μm。

[0018]优选的，所述的梯度离心按照时间顺序包括第一离心和第二离心；
[0019]所述第一离心的转速为1000～1400rpm，所述第一离心的时间为8～12min；[0020]所述第二离心的转速为8000～1200rpm，所述第二离心的时间为8～12min。

[0021]优选的，所述传代培养采用的培养液为含有体积分数为7.5～15％％FBS的低糖DMEM培养液，所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

[0022]本发明还提供了一种猪脂肪干细胞的鉴定方法，包括以下步骤：
[0023]将猪脂肪干细胞进行生物学特性鉴定、表面抗原检测和诱导分化检测。

[0024]优选的，所述生物学特性鉴定包括测定生长曲线、测定细胞集落和分析细胞核型。

[0025]优选的，所述脂肪干细胞表面抗原检测前还包括：将所述脂肪干细胞依次进行预消化和消化；
[0026]所述预消化采用Liberase TL进行，所述Liberase TL的浓度为15～25μg/mL，所述预消化的温度为37℃，所述预消化的时间为1～3min，
[0027]所述预消化的环境中的CO2的体积比例为5％，所述预消化的环境中的湿度为饱和湿度；
[0028]所述消化采用胰蛋白酶和EDTA进行，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.25％，所述EDTA的质量浓度为0.03～0.05％，所述消化的温度为37℃，CO2饱和湿度为5％，所述消化的时间为1～3min。

[0029]优选的，所述的脂肪干细胞诱导分化检测，包括以下步骤：
[0030]培养猪脂肪干细胞，当细胞汇合度达到80％-90％时，加入成脂诱导液、成骨诱导液和成软骨诱导液进行为期2～4周的成脂、成骨和成软骨细胞诱导；
[0031]将诱导培养到期的细胞分别进行油红O、茜素红和阿尔新蓝染色；
[0032]将诱导培养到期的细胞进行成脂特异性基因P p a r-2、成骨特异性基因Osteocalcin和成软骨特异性基因Collagen II检测；
[0033]所述的油红O、茜素红和阿尔新蓝染色和所述的成脂特异性基因Ppar-2、成骨特异性基因Osteocalcin和成软骨特异性基因Collagen II检测之间无时间顺序限定。

[0034]本发明的有益效果：本发明提供方法所得到的脂肪干细胞体外连续培养到15代，
细胞增殖力强，仍然保持遗传稳定性；所得到的脂肪干细胞干性好，体外培养传代到第18代仍具有间充质干细胞表面抗原特性(CD90+、CD44+、CD29+、CD105+、CD31-、CD45-和HLA-DR-)；尤其是不表达HLA-DR，说明脂肪干细胞无免疫排斥反应；所得到的脂肪干细胞的多向分化性能好，具有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化的能力。

本发明的方法操作简单、方便实用、可重复性强，建立了一套规范标准的猪脂肪干细胞的分离、培养和鉴定的方法，为今后利用脂肪干细胞建立模式动物，研究人类疾病、器官移植、家畜常见疾病，以及在提高优良家畜繁殖力，定向改造家畜遗传性状等研究奠定了基础。

附图说明
[0035]图1为本发明实施例2广西巴马小型猪脂肪干细胞P3、P5、P10和P15不同代数下的生长曲线；
[0036]图2为广西巴马小型猪P3脂肪干细胞在21天时吉姆萨染液染色后得到的细胞集落图；其中A，B和C分别表示常光、显微镜40×和100×的示意图；
[0037]图3为广西巴马小型猪脂肪干细胞的核型分析图(2n＝28)；
[0038]图4为猪脂肪干细胞向成脂、成骨和成软骨方向分化图；
[0039]图5为广西巴马小型猪脂肪干细胞特异性基因检测结果；其中，M1、M2、M3为DL500Marker，2、5、8为阳性对照GAPDH(230bp)，3、6、9为空白对照；1：PPAR-2(238bp)，4：Osteocalcin(205bp)，7：Collage II(240bp)；
[0040]图6为广西巴马小型猪脂肪干细胞P6代的表面抗原的流式检测结果图；
[0041]图7为广西巴马小型猪脂肪干细胞P12代的表面抗原的流式检测结果图；[0042]图8为广西巴马小型猪脂肪干细胞P18代的表面抗原的流式检测结果图。

具体实施方式
[0043]本发明提供了一种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：
[0044]1)将猪脂肪组织消化、离心后进行细胞培养；
[0045]2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。

[0046]本发明对所述猪的种类没有特殊的限定，优选的为广西巴马小型猪，广西巴马小型猪是广西地方品种猪，其体型小，解剖结构、组织、生理等方面与人类相似，是较好的实验动物模型。

[0047]本发明将猪脂肪组织进行消化，优选在消化前进行如下步骤：
[0048]采集猪脂肪组织；
[0049]将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液为含有0.45～0.5g/L青霉素和0.6～1.0g/L链霉素的PBS溶液。

[0050]本发明优选的首先采集猪脂肪组织，所述采集优选具体为：
[0051]用体积分数为75％酒精消毒广西巴马小型猪的腹部，然后从腹部采集脂肪组织。

[0052]采集到猪脂肪组织后，本发明将所述采集到的猪脂肪组织清晰后剪碎。

在本发明中，所述清洗用清洗液优选为含有0.45～0.5g/L青霉素和0.6～1.0g/L链霉素的PBS溶液，所述的PBS溶液的pH值优选为7.2～7.4，更优选的为7.3；所述清洗的次数优选为2～4次；[0053]本发明将清洗干净后的脂肪组织优选剪碎成1×1×(1～3)mm的小块。

[0054]得到小块脂肪组织后，本发明优选将所述小块脂肪组织放于含有0.45～0.5g/L青霉素和0.6～1.0g/L链霉素的高抗PBS中。

[0055]本发明在上述的处理好的脂肪组织进行消化。

在本发明中，所述消化优选采用Liberase TL进行。

在本发明中，所述的Liberase TL是一种高纯度研究级别酶混合物，由中性蛋白酶(非梭菌蛋白酶)和高纯度Collagenase I+Collagenase II混合组成，采用Liberase可以增加细胞产率、细胞活性和细胞功能性。

在本发明中，所述脂肪组织与Liberase TL的体积比优选为1∶(1～1.2)；所述Liberase TL的浓度优选的为15～25μg/mL，更优选的为20μg/mL。

在本发明中，所述脂肪组织消化的温度为37℃；所述的组织消化时间优选的为1～3h，更优选的为2h。

[0056]在本发明中，所述的脂肪组织消化优选在恒温水浴摇床中进行，所述恒温水浴摇床的转速优选的为80～120rpm，更优选的为100rpm。

[0057]在脂肪组织消化后，本发明优选进行脂肪组织消化的终止。

在本发明中，[0058]所述消化终止的终止液优选为含体积分数为7.5～15％FBS的低糖DMEM，更优选的为含体积分数为10％FBS的低糖DMEM培养液，所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

[0059]脂肪组织消化结束后，本发明对消化后的脂肪组织进行过滤和离心，去除未消化的脂肪组织。

在本发明中，所述过滤和离心优选具体为：
[0060]将所述消化后的脂肪组织进行第一细胞筛过滤、第一离心、第二细胞筛过滤和第二离心。

[0061]在本发明中，所述第一过滤使用的细胞筛孔径为100μm；
[0062]第一过滤后，本发明收集滤液，将所述滤液进行第一离心。

在本发明中，所述第一离心的转速优选的为1000～1400rpm，更优选的为1100～1300rpm，最优选为1200rpm；所述第一离心的时间优选的为8～12min，更优选的10min；
[0063]第一离心后，本发明收集细胞沉淀，将所述细胞沉淀进行第二细胞筛过滤。

本发明在进行所述第二细胞筛过滤前，优选使用含体积分数为7.5～15％的FBS的低糖DMEM重悬沉淀细胞，所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

在本发明中，所述第二过滤使用的细胞筛孔径为70μm；
[0064]第二过滤后收集滤液，本发明将所述滤液进行第二离心。

在本发明中，所述第二离心的转速优选的为800～1200rpm，更优选的为900～1100rpm，最优选为1000rpm；所述第二离心的时间优选的为8～12min，更优选的为10min；
[0065]第二离心后收集沉淀细胞，本发明优选向所述沉淀细胞中加入体积分数为7.5～15％FBS低糖DMEM细胞培养液重悬细胞，所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/ L的DMEM培养液。

[0066]所述过滤和离心后，本发明将所述离心得到的细胞进行传代培养。

本发明优选将上述收集到的细胞进行计数，并接种于T25的培养瓶里，置于CO2培养箱中培养，24h后更换新的培养液并除去未贴壁的细胞，之后每隔2～4d更换一次新的培养液。

[0067]本发明在上述细胞培养过程中，当细胞汇合程度达到80～90％时，进行传代培养。

在所述传代培养前，本发明优选的对细胞进行传代培养预处理，传代培养预处理包括清洗、消化、消化的终止步骤；所述的清洗具体的为使用PBS溶液清洗细胞1～3次，更优选的清洗2
次；所述的消化步骤优选的为加入细胞体积0.25％的胰蛋白酶，消化温度为37℃，消化时间优选的为1～3min，更优选的为2min；所述的消化终止步骤优选的为消化后加入体积分数为7.5～15％FBS低糖DMEM细胞培养液终止消化，将终止消化后的细胞离心收集细胞沉淀，所述离心的转速优选的为1000～1400rpm，更优选的为1200rpm，离心时间优选的为2～4min，更优选的为3min。

[0068]本发明所述的传代培养具体的为向上述细胞沉淀中加入体积分数为
[0069]7.5～15％FBS低糖DMEM细胞培养液重悬沉淀，优选的按(4～6)×104个细胞/cm2的密度进行传代，更优选的密度为5×104个细胞/cm2，传代培养优选的每隔2～4d更换一次新的培养液，更优选的为每3d更换一次新的培养液。

[0070]本发明在对猪脂肪干细胞进行传代培养后，优选的对培养的猪脂肪干细胞进行冻存，所述的猪脂肪干细胞冻存优选的包括以下步骤：重悬细胞、分装细胞和冻存细胞。

[0071]本发明中所述的重悬细胞具体的为使用细胞冷冻液重悬细胞至单细胞状态，调整细胞密度优选的为2～3×105/mL，更优选的为2.5×105/mL，所述的细胞冷冻液为血清和二甲基亚砜以8∶2的体积比混合得到的；所述的分装细胞具体的为将上述重悬细胞进行分装，分装体积优选的为1～3mL，更优选的为2mL；所述的冻存细胞具体的为对分装好的细胞进行标记，将其放入-80℃冰箱，20～28h后移至液氮中长期保存。

[0072]本发明在需要使用猪脂肪干细胞时，对冻存的猪脂肪干细胞进行复苏。

在本发明中，所述的复苏优选为：
[0073]将冻存的猪脂肪干细胞置于水浴中解冻；
[0074]将所述解冻后的猪脂肪干细胞离心后培养。

[0075]在本发明中，所述解冻温度优选的为35～40℃，更优选的为37℃。

待细胞悬液完全溶解时，将细胞悬液移至含有培养液的离心管中离心，收集细胞沉淀，用细胞培养液重悬细胞并接种于T25的细胞培养瓶中，放置于培养箱中培养。

[0076]本发明还提供了一种猪脂肪干细胞的鉴定方法，包括猪脂肪干细胞的生物学特性鉴定，猪脂肪干细胞表面抗原检测和猪脂肪干细胞诱导分化检测。

[0077]本发明中所述的猪脂肪干细胞的生物学特性鉴定包括生长曲线测定、细胞集落测定和细胞核型分析。

[0078]所述的生长曲线测定具体的为：
[0079]将不同代数生长状况良好的猪脂肪干细胞接种于96孔板中，进行细胞培养；[0080]测定培养后猪脂肪干细胞的吸光度值；
[0081]以培养时间为横坐标，以吸光度值为纵坐标，得到生长曲线。

[0082]本发明优选在每孔中接种1500～2500个细胞，更优选为2000个；
[0083]优选的每隔22～26h随机取4～6个孔，每个孔加入10μL的CCK-8，1～3h后用酶标仪测各个孔中细胞的吸光度值，以吸光度值(4～6孔的平均值，连续检测6～8d)为纵坐标，培养天数为横坐标，绘制生长曲线。

[0084]本发明所述的细胞集落测定具体包括猪脂肪干细胞的培养、培养细胞的吉姆萨染色和统计分析三个步骤。

[0085]本发明所述的猪脂肪干细胞的培养具体的为取P3代生长状态良好的猪脂[0086]肪干细胞，稀释至800～1200个细胞/mL，然后取50～150μL稀释后的细胞接种于直
径为10cm的培养皿中，然后将接种后的细胞放置于培养箱中培养，培养时间优选的为18～22d，更优选的为20d。

[0087]本发明所述的培养细胞的吉姆萨染色即为本领域所熟知的吉姆萨染色，染色后进行拍照，无其他特殊要求。

[0088]本发明所述的统计分析具体的为统计分析形成的细胞集落数，试验所得数据由SPSS(version17.0)软件进行ANOVA统计分析，试验每一次重复，均为同一批次试验，所有试验均重复3次，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

[0089]本发明所述的猪脂肪干细胞核型分析具体的包括以下步骤：猪脂肪干细胞的预处理，猪脂肪干细胞的制片，猪脂肪干细胞的核型统计分析。

[0090]本发明所述的猪脂肪干细胞的预处理包括选择不同代数的细胞，秋水仙素处理细胞，KCL低渗细胞；具体的为选取P5、P10和P15代生长状况良好的猪脂肪干细胞，当细胞生长汇合度达到70％-80％时，用秋水仙素的培养液处理细胞，所述的秋水仙素培养液的质量浓度优选的为0.1～0.3μg/mL，更优选的为0.2μg/mL，所述处理时间优选的为3-4h；所述的KCL 低渗细胞具体的为收集上述细胞，加入KCL溶液，吹打混匀后移入37℃恒温箱内进行低渗处理，所述的KCL溶液的体积为5mL，所述的KCL溶液优选的摩尔浓度为为0.075M，所述KCL溶液的温度优选的为35～40℃，更优选的为37℃，所述的KCL低渗细胞的时间优选的为20～40min，更优选的为30min。

[0091]本发明所述的猪脂肪干细胞的制片具体的包括预固定，固定和制片。

所述的预固定具体的为收集低渗处理后的细胞，向收集到的细胞中加入固定液进行预固定，所述预固定的时间优选的为1～3min，更优选的为2min，所述的固定液为醋酸-甲醇(体积比1∶3)，所述的固定液优选的为在4℃预冷5～10min的固定液，所述固定液的体积优选的为1～3mL，更优选的为2mL；所述的固定具体的为收集预固定后的细胞，向其中加入固定液，所述固定的温度为28℃，所述固定的时间优选的为20～40min，更优选的为30min；所述固定步骤优选的重复两次。

[0092]本发明所述的制片具体的为收集固定后的细胞，加入200～400μL固定液，吹打均匀；取细胞悬液进行制片。

[0093]本发明中所述的猪脂肪干细胞的核型统计分析具体的为：所述制片完成后用油镜观察细胞的染色体数目并拍照，对拍照的核型进行计数分析。

[0094]本发明对猪脂肪干细胞表面抗原进行检测，具体的包括消化分装和抗原检测两步。

本发明中所述的消化分装具体的为取培养的猪脂肪干细胞，当细胞汇合度达到80％-90％时，对其进行消化分装，所述的消化步骤具体的为先采用15～25μg/mL的Liberase TL 在37℃培养箱预消化细胞1～3min，预消化后加入细胞体积0.25％的胰蛋白酶和0.04％的EDTA继续消化2-3min，然后震荡细胞，使细胞从贴壁状态中游离出来，加入含体积分数为10％FBS的低糖
[0095]DMEM培养液终止消化，收集细胞，用PBS清洗2～3遍后，离心收集细胞，再加入PBS 混匀细胞，所述的分装步骤与上述猪脂肪干细胞冻存中的分装步骤相同；所述的抗原检测步骤具体的为：分别向分装后的猪脂肪干细胞中加入以下抗体CD29-AF647，CD44-FITC，CD31-FITC，CD45-FITC，HLA-DA-FITC，CD90-FITC，CD105-PE，IgG1-AF647，IgG1-FITC，IgG2a-FITC，IgG2a-PE和IgG2b-FITC，进行避光孵育，所述孵育的时间优选的为30min-
60min，更优选的为45min，所述孵育的温度优选的为25～30℃，更优选的为28℃；所述的孵育完成后使用PBS溶液清洗，所述的清洗的次数优选的为2～4次，更优选的为3次；所述的清洗完成后用多聚甲醛重悬固定细胞，所述的多聚甲醛的质量浓度优选的为0.5～1.5％，更优选的为1％；所述的固定细胞于4℃避光保存过夜后进行流式细胞检测。

[0096]本发明的鉴定方法还包括猪脂肪干细胞诱导分化检测，包括猪脂肪干细胞成脂细胞诱导分化检测，成骨细胞诱导分化检测和成软骨细胞诱导分化检测。

[0097]本发明所述的猪脂肪干细胞成脂细胞诱导分化检测包括细胞接种和两步成脂诱导。

所述的细胞接种具体的为取P3代生长状态良好的猪脂肪干细胞，当细胞汇合度达到80％-90％时，按照(2.5～3.5)×104细胞/mL的接种量接种至48孔板中培养；所述的两步诱导具体的为当细胞生长汇合度达到85～95％时，加入成脂诱导液，所述的两步诱导优选的先使用IM诱导液诱导细胞1～3d后，再使用MM诱导液诱导1～3d，1～3换一次液体，如此操作重复12～16d后进行油红O染色和成脂特异性基因检测。

[0098]本发明中所述的成脂诱导液的为IM和MM，所述的IM为10％FBS，1％双抗，0.5mM IBMX，1μM地塞米松，100uM吲哚美辛，10μg/mL胰岛素，余量的DMEM；所述的MM为10％FBS，10μg/mL胰岛素，1％双抗，余量的DMEM。

[0099]本发明所述的猪脂肪干细胞向成骨细胞诱导分化检测包括细胞接种和成骨诱导，所述的细胞接种步骤与成脂细胞诱导分化中细胞接种的步骤相同；所述的成骨诱导具体的为当细胞生长汇合度达到90％时，加入成骨诱导液，每1～3d更换一次成骨诱导液，诱导18～24d后进行茜素红染色和成骨特异性基因检测。

[0100]本发明所述的成骨诱导液为10％FBS，1％双抗，10mMβ-甘油磷酸钠，0.1μM地塞米松，0.2mM抗坏血酸盐，余量的DMEM。

[0101]本发明所述的猪脂肪干细胞向成软骨细胞诱导分化检测包括细胞接种和成软骨诱导，所述的细胞接种步骤与成脂细胞诱导分化中细胞接种的步骤相同；所述的成软骨诱导具体的为：当细胞生长汇合度达到90％时，加入成软骨诱导液，每1～3d更换一次成软骨诱导液，诱导18～24d后进行阿尔新蓝染色和成软骨特异性基因检测。

[0102]本发明所述的成骨诱导液为10％FBS，10ng/mL TGFβ1，6.25μg/mL胰岛素，0.05mM 抗坏血酸盐，1％双抗，余量的DMEM。

[0103]下面结合实施例对本发明提供的猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0104]实施例1猪脂肪干细胞分离培养
[0105]选取出生24h内的一头死的广西巴马小型公猪腹股沟处脂肪组织块，经75％酒精消毒后随即用高抗的PBS清洗组织3次，再转移至含有培养液的无菌离心管(规格为50mL)中带回实验室。

在无菌超净台中将脂肪组织充分剪碎为大小约1mm×1mm×1mm小块并转移至50mL无菌离心管，脂肪体积约为5mL/管，每管加入1倍脂肪体积的20μg/mL Liberase TL，充分混匀，然后放入37℃恒温水浴摇床(100rpm/min)消化2h，之后取出离心管并加入20mL含10％FBS的低糖的DMEM终止消化，轻轻混匀消化混合物，使用100μm细胞筛过滤去除未消化的脂肪组织，1200rpm离心10min，弃上清；用含10％FBS的低糖DMEM培养液重悬沉淀后，再用使用70μm细胞筛过滤去除未消化的脂肪组织，1000rpm离心10min，弃上清。

取细胞悬液与混合(体比为1∶1)后进行血细胞计数板计数，以5×104细胞/cm2的密度接种于T25的培养瓶里，。