麻芩消咳颗粒平喘抗炎作用研究

麻苓消咳颗粒平喘抗炎作用研究
潘怡惟，邓雪阳，马世平，傅强
(中国药科大学中药学院，江苏南京211198)
摘要：目的探讨麻苓消咳颗粒的平喘抗炎作用。

方法SD大鼠随机分为6组，分别为肺宁颗粒2.5g-kg-1组、麻苓消咳颗粒(l、2、4g・kg-1)组、模型组和溶剂对照组。

第0、7天皮下注射卵蛋白混悬液致敏。

第15天开始给药并用1%的OVA溶液激发哮喘，每天给药1次，连续给药4周。

给药结束后检测大鼠肺泡盥洗液中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素17(IL-17)含量及血清中免疫球蛋白E(IgE)、白细胞介素4(IL-4)水平，观察肺组织病理学变化，Western blot检测肺组织中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的表达水平。

结果麻苓消咳颗粒2g-kg-1能够降低大鼠肺泡盥洗液中白细胞介素6、白细胞介素17含量及血清中免疫球蛋白E、白细胞介素4水平，降低PI3K、ATK磷酸化水平。

结论麻苓消咳颗粒对卵蛋白诱发的大鼠过敏性哮喘模型有显著的平喘抗炎作用，与PI3K/ AKT调节的炎症信号通路有关o
关键词：麻苓消咳颗粒；卵蛋白；过敏性哮喘；炎症因子
中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号：2095-5375(2021)02-0074-005
doi：10.13506/ki.jpr.2021.02.002
The anti-asthmatic and anti-inflammatory effects of Maqin Xiaoke Granules
PAN Yiwei, DENG Xueyang,MA Shiping,FU Qiang
(College of Chinese Medicine,China Pharmaceutical University,Nanjing211198,China)
Abstract:Objective To investigate the anti-asthmatic and anti-inflammatory effects of Maqin Xiaoke Granules. Methods SD rats were randomly divided into6groups:Feining Granules2.5g-kg-1group,Maqin Xiaoke Granules(1, 2,4g-kg-1)group,model group and solvent control group.Rats were sensitized on day0and7by subcutaneously injection with OVA.On day15,Rats were challenged with1%OVA and given the drug,once a day for4weeks.After the administra­tion,the levels of IL-6and IL-17in BALF and the levels of IgE and IL-4in serum of the rats were measured,and the his­topathologic changes of the lung tissues were examined,the expression of PI3K,p-PI3K,AKT,and p-AKT in the lung tissue were evaluated by western blot.Results Maqin Xiaoke Granules at dose of2g-kg-1could reduce the levels of IL-6,IL-17in the BALF and IgE,IL-4in serum of rats,and it reduced the phosphorylation levels of PI3K and AKT.Conclu-sion Maqin Xiaoke Granules have significant anti-asthmatic and anti-inflammatory effects on the rat model of allergic asthma induced by egg protein, which is related to the inflammation signal pathway regulated by PI3K/AKT.
Key words:Maqin Xiaoke Granules;Ovalbumin;Allergic asthma;Inflammatory factors
哮喘，又称支气管哮喘,是一种异质性疾病。

哮喘常以慢性气道炎症为特征，并与气道高反应性相关,导致反复发作的喘息、气急、胸闷、咳嗽。

特别是在夜间或清晨发作或加剧，这些发作通常与肺内气流阻塞相关，通常可以自发地或通过治疗逆转[l]o 以哮喘为代表的慢性呼吸系统疾病具有发病率高,病程长，治疗费用高等特点对患者、家庭、社会带来沉重负担。

临床对于哮喘的治疗，主要使用的西药有:糖皮质激素、茶碱类、抗IgE抗体、白三烯调节剂等药物[1，3]o
麻苓消咳颗粒来源于安徽省老中医的临床经验方，以“麻杏石甘汤”为基础加减而得，由麻黄(密炙)、桑白皮、金银花、黄苓等多种中药组成，具有清肺化痰、止咳平喘的功效。

临床上常用于痰热所致之咳
作者简介:潘怡惟，女，研究方向：中药药理学,E-mail：panyiwei_cpu@
通信作者:傅强，男，博士研究生，副教授，研究方向：中药药理学,Tel：138****6679,E-mail：fuqiang0114@
嗽、喘息、痰黄稠厚等症。

为验证麻苓消咳颗粒对大鼠哮喘模型的药效作用,本研究建立了卵蛋白致敏的大鼠哮喘模型，探究麻苓消咳颗粒的平喘抗炎作用及其机制，为该产品临床扩大适用症提供科学依据。

1材料与方法
1.1动物SPF级雄性SD大鼠，体重180~200g,购自浙江省医学科学院实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK（浙）2019-0002。

动物使用许可证号:SYXK（苏）2018-0019。

自由摄食和饮水，室温（25±2）T,相对湿度50%~60%,昼夜12h交替。

适应性喂养一周后用于实验。

1.2药物及试剂麻苓消咳颗粒（亿帆制药,国药准字:Z20040092,批号:190602）；肺宁颗粒（修正药业集团股份有限公司，批号：180365）；卵蛋白（Sigma公司，货号:A5253）；大鼠IL-6ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号:E-EL-R0015c）；大鼠IL-17ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号:E-EL-R0566c）；大鼠IgE ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,货号:E -EL-R0517c）；大鼠IL-4ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号:E-EL-R0014c）；PI3K一抗（Cell Signaling Technology,批号:4255）；P-PI3K—抗（Affinity Biosciences,批号：AF3241）；AKT 一抗（Cell Signaling Technology，批号:4691）；P-A KT 一抗（Cell Signaling Technology，批号:4060）；兔二抗（Bioworld公司,批号:AA01201）。

1.3仪器超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，型号：402B）；-80弋超低温冰箱（美国Thermo公司）；SN3001全波长多功能酶标仪（美国Thermo公司）；全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）；EPS600电泳仪（上海天能科技有限公司）。

1.4动物分组给药大鼠根据体重随机分为6组，分别为肺宁颗粒
2.5g-kg-1组、麻苓消咳颗粒1、2、4g-kg-1组、模型组和溶剂对照组。

1.5模型制备分别于第0、7天，模型组及各给药组大鼠皮下多点注射卵蛋白混悬液致敏。

空白组皮下注射等体积生理盐水作为对照。

第15天开始，模型组及各给药组用1%的OVA生理盐水溶液雾化激发哮喘。

从激发第一天开始给药，共计给药4周，空白和模型组给予等体积生理盐水。

末次激发后处死大鼠,收集组织样本，于-80T冰箱保存。

1.6指标检测
1.6.1ELISA测定肺泡灌洗液中炎症因子每组取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，分离颈部肌肉进行气管插管，用PBS盥洗肺组织，共盥洗3次。

合并肺泡盥洗液（BALF）,取盥洗液1mL, 3000r•min-1离心5min,取上清。

按ELISA试剂盒说明书，测定其中IL-6、IL-17含量。

1.6.2ELISA测定血清中IgE、IL-4含量每组取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，经腹主动脉米血。

静置30min后，3000r•min-1离心15 min,取上清。

按ELISA试剂盒说明书操作,测定其中IgE、IL-4含量。

1.6.3肺组织的病理学观察-HE染色固定大鼠肺组织，制作石蜡切片，进行HE染色。

显微镜下观察肺组织病理学变化，观察肺泡上皮细胞的损伤程度以及气管壁增厚程度。

1.6.4Western blot检测相关蛋白表达收集大鼠肺组织，-80弋保存。

肺组织按重量体积比（1:50）加入含有1%PMSF的RIPA Buffer。

于冰上研磨匀浆，裂解30min。

4,12000r•min-1,离心30 min。

吸上清加入体积为1/4的5x SDS-PAGE Loading Buffer混匀，煮沸10min。

于-20弋冰箱保存,Western blot检测肺组织中PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT的表达水平。

1.7统计学分析所有实验数据均采用“±s表示，采用GraphPad Prism5软件进行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析和Tukey's test进行分析，当P<0.05时认为有显著性差异。

2结果
2.1麻苓消咳颗粒对过敏性哮喘大鼠肺泡灌洗液中炎症因子表达的影响与空白组相比，模型组大鼠BALF中IL-6、IL-17显著升高（P<0.01）。

与模型组相比,肺宁颗粒组能够降低IL-6水平,但不具有显著性差异，显著降低IL-17水平（P<0.05）。

麻苓消咳颗粒低、中、高剂量组能降低BALF中IL-6、IL-17水平（P<0.05、P<0.01）。

麻苓消咳颗粒各剂量组与肺宁颗粒组之间无统计学差异（P>0.05），结果见表1。

表1麻苓消咳颗粒对大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-17
含量的影响（x±s,n-6）
组别
剂量IL-6IL-17
/g-kg-1/pg•mL-1/pg•mL-1空白组-118.91±4.6431.56±1.24
模型组-139.59±6.04##38.39±7.07##
肺宁颗粒组 2.5126.84±5.3030.79±4.59*
1121.99±7.47*31.02±2.46*
麻苓消咳颗粒组2116.86±16.89
**28.52±2.24**
4114.67±10.86**29.25±2.30**注：与空白组相比，##P<0.01；与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01 2.2麻苓消咳颗粒对过敏性哮喘大鼠血清中IgE、IL-4含量的影响与空白组相比，模型组大鼠血清
中IgE 、IL-4显著升高(P <0.01、P <0.05)。

与模型 组相比，肺宁颗粒组能够显著降低IgE 、IL-4水平
(P <0.01、P <0.05)。

麻苓消咳颗粒中、高剂量组能
够显著降低血清中IgE 、IL-4水平(P <0.01、P <
0.05)。

麻苓消咳颗粒各剂量组与肺宁颗粒组之间
不具有统计学差异(P >0.05)，结果见表2。

含量的影响(x ±s ,” = 6)表2麻苓消咳颗粒对大鼠血清中IgE 、IL-4
组别
剂量/g - kg -1 )IgE
/ |xg • mL -1IL-4
/pg • mL -1空白组-17.15±0.8676.36±4.80模型组-20.84±1.64##86.67±5.48#肺宁颗粒组
2.518.30±0.44**75.94±5.63*117.33±1.07**77.77±5.83麻苓消咳颗粒组
217.36±1.09**77.14±4.28*4
17.81±1.38**
75.65±4.78**
2.3肺组织的病理学观察-苏木精-伊红染色空 白组大鼠肺组织支气管壁、肺泡结构完整且清晰,未
见明显炎性浸润现象。

相比于空白组，模型组大鼠
支气管壁明显增厚,可见大量炎细胞浸润,肺泡结构 破坏。

肺宁颗粒给药干预后，相比于模型支气管壁
厚度降低,炎性细胞数量降低。

麻苓消咳颗粒低、
中、高均能明显改善卵蛋白诱导的大鼠肺部组织支
气管壁增厚,炎性浸润现象，结果见图1。

2.4对肺组织PI3K/AKT 信号通路蛋白表达的影
响 模型组大鼠肺部组织p-PI3K/ PI3K 水平相比
于空白组大鼠显著升高(P <0.01)，肺宁颗粒及麻苓
消咳颗粒中剂量给药后，可显著降低p-PI3K/PI3K
水平(P <0.05、P <0.01)。

麻苓消咳颗粒各剂量组与
肺宁颗粒组无统计学差异(P >0.05)，结果见图2。

注：与空白组相比,*P <0.05,##P <0.01；与模型组相比，* P <
0.05, ** P <0.01
空白组
麻苓消咳颗粒4 g-kg 1
麻苓消咳颗粒1 g-kg-1麻苓消咳颗粒2 g-kg-1
图1肺组织HE 染色(X200,” = 3)
图2麻苓消咳颗粒对大鼠肺组织中p-PI3K/ PI3K 表达水平的影响(” =3)
3讨论
注 占空白组相比,## P <0.01 ；与模型组相比，* P <0.05, ** P <0.01
模型组大鼠肺部组织p-AKT/AKT 水平相比于
空白组大鼠显著升高(P <0.01),肺宁颗粒及麻苓消
咳颗粒中剂量给药后，可显著降低p-AKT/AKT 水
平(P <0.05,P <0.01)。

麻苓消咳颗粒各剂量组与肺
宁颗粒组无统计学差异(P >0.05)，结果见图3。

哮喘发病率逐年升高，其发病因素、机制复杂。

发病因素包括遗传因素，环境因素如病毒、细菌、粉
尘、药物、花粉、食物、寒冷、劳累等［4］。

哮喘其发病 与多种因素相关，目前机制尚不明确［5-6］。

由此，
防
图3麻苓消咳颗粒对大鼠肺组织中
p-AKT/AKT表达水平的影响(n=3)
注:与空白组相比严P<0.01；与模型组相比J P<0.05,沁P<0.01
治哮喘药物的开发显得尤为重要。

炎症在许多呼吸系统疾病的发病中起着关键作用,例如哮喘、急性肺损伤和慢性阻塞性肺疾病等L7-8J O其中,气道免疫-炎症机制认为由Th2细胞活化并产生的细胞因子IL-4,在哮喘发生过程中起到关键作用。

IL-4对IgE的产生、诱导肥大细胞具有影响。

IgE可结合嗜酸性粒细胞和肥大细胞，与其表面的高亲和力IgE受体结合，形成致敏状态L9-11J0当机体再次接触到过敏原,肥大细胞内会发生一系列的信号转导，发生脱颗粒并释放大量炎性介质,导致气道平滑肌痉挛,发生过敏性哮喘的临床症状。

本研究结果发现，对比空白组大鼠,哮喘模型组大鼠血清中IL-4、IgE含量显著升高。

相比于模型组大鼠,麻苓消咳颗粒可以显著降低血清中IL -4、IgE水平，并能显著降低BALF中IL-6、IL-17水平。

提示麻苓消咳颗粒的平喘作用可能与其降低IL-4、IgE、IL-6、IL-17水平，抑制气道免疫-炎症反应有关。

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路在炎症和肿瘤等病理状态的产生、发展过程中均具有重要的影响作用L12J。

其能够通过多种渠道对炎症的发生起到调控的作用，从而影响炎症的发生和发展，并且参与到细胞的生长、增殖、分化调节的信号转导通路L13-14J。

本研究结果发现,模型组大鼠存在PI3K/AKT通路的异常激活，相比于模型组大鼠，麻苓消咳颗粒能够显著降低大鼠肺部PI3K 及AKT磷酸化水平。

提示麻苓消咳颗粒平喘抗炎的分子机制可能有其调节PI3K/AKT信号通路有关。

综上所述,本研究证实麻苓消咳颗粒对OVA诱导的过敏性哮喘大鼠具有显著的平喘抗炎作用，能够改善OVA诱导的大鼠肺部组织损伤，气管腔狭小,炎性浸润。

其作用机制可能与PI3K/AKT信号有关,为麻苓消咳颗粒临床应用拓展提供依据。

本研究初步探究了麻苓消咳颗粒药效及潜在机制。

但哮喘发病机制复杂，后续仍需进一步的机制探究。

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)
批次的官桂样品也出现来源不一的现象，再结合表4中的内容，可见中药官桂在实际应用中同名异物、不同标准来源的药材相互混用的现象很普遍。

通过考证,本研究进一步说明临床用中药“官桂”与商品中药材“官桂”在实际应用中并不完全相同,这就给官桂的临床合理、安全、有效用药带来了很大隐患，有必要加以辨别澄清。

笔者为此考证了官桂的药效，其药效与肉桂是基本相同的,也即在临床上官桂和肉桂是很少区分的。

因此笔者建议中成药处方中在用到官桂时,应追溯其来源，并将其来源在该中成药标准正文后进行标注。

综上，笔者认为不同省份的地方标准关于官桂的来源记载相差较大,在该药材实际生产中，各个省 份的相关企业应该严格按照本地区的地方标准进行采集加工，正本清源,而不应不加区别和其他不同标准地区的药材混用;另外，笔者也认为应当对不同地方标准规定的不同来源的官桂药材进行临床药效一致性的研究与评价，以在临床疗效上进一步规范官桂的应用，进而以推动中药官桂统一标准的制定，为实现中药官桂现代化发展奠定基础。

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