第五章 DNA的复制

这样既保证了两条链的合成方向都是 5’-3’方向，又保证了滞后链核心酶的 移动方向能够与复制叉移动的方向保 持一致。 核心酶二聚体在全酶中的不对称排列 可能是这个机制的基础。 在聚合酶完成一个片段并准备开始下 一个片段合成前，这个单链模板必须 被延伸至少一个岗崎片段的长度。

当岗崎片段合成到前一个岗崎片段的5’ 端时，这一大段环就被释放出来。 而前导链的合成又将另一部分滞后链 的模板置换出来，并在适当的位点由 引发体合成新的引物，进行新的岗崎 片段的合成。 前导链和滞后链的协同合成对于生存 是必要的。

Φχ174的复制中，引发体在一个特定的 引发体组装位点组装，这也是Φχ174互 补链合成的起始位点。 Φχ174的引物合成位点，即岗崎片段的 起点却有多个。表明引发体或它的部分 组分可沿着单链DNA移动到其他位点， 引发复制的起始。 目前还不能完全理解Φχ174和oriC起点 的差别，但在每个体系中DnaB都是岗崎 片段前进和引发所需要的关键组分。

所有已知的DNA分子都在复制起点处起始 一轮复制。 DNA复制是在起始阶段进行控制的，复制 子增殖依赖于起始过程中在起点处发生的 相互作用。一旦起始后，它就会进行到底， 直到整个基因组都复制完成。 一个细胞周期中，每个复制子只启动一次。
DNA复制起始有两种方式：
从头起始（de novo initiation） DNA链的合成从头开始 共价延伸（covalent extension） 新链从原有的亲链上开始合成，滚 环复制就是通过共价延伸起始的。

四、复制体的组装
引物RNA合成以后，DNA聚合酶组装到 引发的DNA上，完成复制体（replisome） 的组装，开始DNA合成。 DNA聚合酶组装过程包括γ复合物催化β 二聚体结合A；随后γ复合物脱离β二 聚体；聚合酶Ⅲ与β亚基结合完成全酶的 组装。 在复制体中，全酶的τ亚基还能结合DnaB 螺旋酶，这种结合可以提高DNA的合成 速度。

三、全酶的循环
PolⅢ全酶催化的DNA合成是一个由多 步高效有序的反应所组成的复杂过程。 前导链和滞后链的合成是不同的，前 导链的聚合酶只需连续地钳住DNA， 而滞后链上完成一个岗崎片段合成后， 聚合酶必须通过一种特殊机制快速循 环，转移到新的引发位点上，进行下 一个岗崎片段的合成。


第三节 复制的起始
一、预引发体的形成 二、复制复合物的改型 三、引发体的形成 四、复制体的组装
第四节 延伸过程
一、滞后链合成的起始 二、前导链和滞后链的协同合成 三、全酶的循环 四、岗崎片段的连接
第五节 复制的终止
一、大肠杆菌ter/Tus复合物 二、抑制机制 三、复制终止体系的生物学功能 四、线性DNA的末端复制

DNA双螺旋复制的从头起始包括 以下连续的步骤(大肠杆菌)：
预引发体的形成 复制复合物的改型 引发体的形成 复制体的组装
一、预引发体的形成
预引发体的组分包括： ① 起始蛋白: 专一性识别起点序列的 蛋白质 ② 参与组装过程的蛋白质: 这些蛋白质在随后的DNA合成中往 往不发挥作用，如装载因子和改型 因子等。 ③ 复制机器的组分: 如DNA螺旋酶
前导链和滞后链协同复制的机制
当全酶随着复制叉沿前导链的合成方 向移动时，滞后链的模板被甩出来， 产生一个环。 随着复制叉的移动，这一环不断扩大， 并向复制叉前进的方向回折。 新合成的岗崎片段也向相同的方向 （复制叉前进的方向）甩出，这相当 于滞后链的核心酶相对滞后链向与复 制叉前进相反的方向移动。

四、岗崎片段的连接
DNA聚合酶遇到前一个岗崎片段的 RNA引物时，将停止DNA的合成。 DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’外切核酸酶活性 切除RNA引物，并在DNA上产生一个 缺口。这个缺口被DNA聚合酶Ⅰ填充。 最后由DNA连接酶把相邻的岗崎片段 连接到一起。

第五节 复制的终止

复制不是通过复制叉的相遇而简单终 止的。不同生物体的终止体系是不同 的。

二、前导链和滞后链的协同合成
半不连续复制的显著特点是：新合成 的两条DNA链是沿相反方向生长的， 两个生长点之间在DNA上相隔一段距 离。 复制叉附近必然有两个催化DNA合成 的复合物，分别催化前导链和滞后链 的协同合成（coordinating synthesis）。




PolⅢ全酶含有两个DNA聚合酶亚基，因此复 制叉处前导链和滞后链的合成可由同一个 PolⅢ全酶分子催化进行。两个聚合酶亚基的 协同作用合成双螺旋DNA的两条链。 聚合酶二聚体的不对称结构是双链协同作用的 基础，两个聚合酶亚基可能相互接近并通过变 构效应进行通讯。 PolⅢ并不是单独起作用，而是与引发体、螺 旋酶等构成蛋白质复合体—复制体。由于复制 体的存在，前导链和滞后链得以同时复制。
超螺旋所造成的DNA过度缠绕，这 必须由II型拓扑异构酶gyrase引入负 超螺旋来解决。
在体内正常的环境下，解旋、包被、
复制反应是串联进行的。
一、滞后链合成的起始
人们是利用单链DNA噬菌体Φχ174的 复制作为模型来研究滞后链岗崎片段 的引发机制的。 Φχ174引发体与oriC引发体具有相同 的基本成分，表明噬菌体Φχ174的引 发与大肠杆菌DNA滞后链岗崎片段的 起始过程类似。
DnaB是一个六聚体蛋白质，与6个 DnaC蛋白结合形成DnaB/DnaC复合 体。这个复合物与oriC结合形成预引 发体，从而形成一个双向的复制叉。
DnaC是DnaB的装载因子，伴随 DnaB六聚体结合复制叉组装位点， 此外，它还使螺旋酶保持无活性的 状态。

总之，起始因子与单链DNA的相互作 用，以及DnaB/DnaC复合物与起始 蛋白DnaA的相互作用对复制叉的组 装都是必要的。


① ②
尽管起始因子结合起点对复制起始 是关键的，但这种结合并不足以引 发复制的起始。 首先，起始因子的DNA结合位点并 不是实际的复制起点。 其次，当DnaA结合起点时，起点 是不活化的。 因此，起始蛋白结合起点并不是复 制起始的决定步骤。



DnaA蛋白作用于oriC左侧的3个13bp的串联 重复序列，使3个13bp重复序列的DNA链熔 解。 DnaA是ATP结合蛋白，ATP对DNA结合并 不是必须的，因为ADP-DnaA蛋白也可以形 成起始复合物，但不能打开oriC处的DNA 双螺旋。 DnaA除了专一性地识别DNA双链结合位点 之外，还能与单链区域的一条链发生专一 性的相互作用，作为单链DNA结合蛋白发 挥作用。
第六节 其他原核生物的复制体系
一、噬菌体DNA的复制
第七节 其他形式的复制
一、线粒体的D环复制 1. H链复制的起始 2. 在OH形成稳定的RNA-DNA杂交结构 3. 引物RNA的加工 4. H链合成的终止 5. L链的复制 6. DNA聚合酶和辅助蛋白 二、滚环复制
第三节 复制的起始


第一节 DNA的复制概况
一、DNA的复制机制 二、DNA复制的起点、方向和方式 三、DNA聚合酶与DNA聚合反应 四、复制的基本过程 五、DNA复制的半不连续性
第二节 DNA的复制体系
一、复制体系的鉴定 二、DNA聚合酶 1. 大肠杆菌的DNA聚合酶 2. DNA复制的忠实性 3. 其他生物的聚合酶 4. DNA聚合酶的引物 5. DNA聚合酶催化的分子机制 三、 DNA连接酶 四、螺旋酶 五、DNA拓扑异构酶 六、单链结合蛋白

大肠杆菌的起始蛋白是DnaA蛋白， 它可以识别复制起点并与之结合，这 种结合是随后的起始事件的基础。

大肠杆菌的双向复制起点oriC包括
245bp的序列，由9 bp和13 bp重复序 列组成。两种重复序列都富含A、T， 这是起点发挥功能所需要的。
大肠杆菌的复制起点
单体
聚集, 集合,
位于oriC位点右侧的4个9bp的一致 序列提供了DnaA的起始结合位点。 一旦DnaA结合DNA，起始蛋白会 获得额外的功能： ① 促进DNA解旋或使邻近的DNA发 生扭曲使DNA解旋酶能够进入。 ② 帮助与复制叉组装和功能相关的其 他因子进入。
二、复制复合物的改型
起始因子在DNA复制起点的组装需要
起点结合复合物保持高度的稳定性， 但DNA复制却需要起始蛋白－DNA复 合物的组分保持自由状态以完成它们 的功能。 在复制起始过程中，需要这些复合物 改型或去组装以使稳定的起点结合复 合物转化为活动的复制机器。
大肠杆菌的DNA复制中，通过改变起始 复合物各组分的ATP结合状态来改变其组 成形式。其DnaC必须结合ATP才能与 DnaB相互作用并装载DnaB，当ATP水解 或释放时，DnaC会离开复合物。 起始过程最主要的改型步骤，导致了复 制叉处螺旋酶的活化。螺旋酶的活化可 能是装载复制叉其他组分的关键步骤。 一旦螺旋酶活化，它将连续熔解双螺旋 DNA。
在大肠杆菌复制叉相遇点两边各有一 个终止区域，各含有多个位点，分别 为terE、terD、terA和terF、terC、terB。 这些位点可以结合专一性的终止蛋白， 引起复制叉的制动。
这些因子共同作用控制复制叉组装
的时间和位点，它们还作为细胞周 期调控的靶子。 起始因子在原核生物、噬菌体、以 及真核生物中功能上是保守的。 大肠杆菌oriC的复制起始需要DnaA、 DnaB、DnaC、HU、gyrase（II 型拓 扑异构酶）和SSB的参与，它们形成 复合物协同作用使双螺旋上出现连 续的解旋。
DnaA结合起点DNA后，将促使参与 复制叉组装的其他因子的结合，这个 过程的主要目的是促使DnaB进入复 制叉的组装位点。 DnaB实际上是使DNA解链的螺旋酶。 它能识别复制叉处潜在的单链结构， 与DNA旋转酶协同作用，促使大范 围的解链。 同时，SSB蛋白稳定形成的单链DNA。



第四节 延伸过程
DNA聚合酶把新生链的第一个核苷酸
加到引物的3’羟基上，从而开始新生链 的延伸过程。 在复制叉前进的过程中，必须有DNA 螺旋酶解开两条缠绕的模板链。起螺 旋酶作用的可能仍是引发体中的DnaB 螺旋酶，另一个螺旋酶Rep蛋白也可能 参与这个过程。
螺旋酶并不能解决复制叉前进引入正
为了保证滞后链能够跟得上前导链合 成的速度，需要聚合酶能快速循环。 PolⅢ的再循环与聚合反应的高度进 行性发生了矛盾。 聚合酶之所以能够迅速循环到新的引 发位点，是因为全酶具有部分去组装 和再组装的能力，并能在不同的多亚 基结构之间快速转化。

每一个岗崎片段的合成都包括全酶部 分结构的去组装和再组装过程。这个 过程由ATP水解提供动力，并受专一 性蛋白质－蛋白质和蛋白质－DNA相 互作用控制。 尽管负责滞后链合成的聚合酶不断地 从完成的岗崎片段末端脱落，负责前 导链合成的聚合酶在染色体DNA复制 过程中却始终通过β钳紧紧地束缚着 DNA，保证了PolⅢ全酶始终结合在复 制叉上。

引发酶在模板DNA的特定位点起始 链合成。不同的引发酶识别不同的 序列，因此有许多位点可以起始引 物的合成。 大多数的引发酶可以使用核糖核苷 酸和脱氧核糖核苷酸作为底物，但 是因为细胞中有大量的核糖核苷酸， 所以引物通常是RNA。


DnaG引发酶与预引发复合物中的 DnaB螺旋酶结合形成可移动的复合 物，并合成RNA引物。

三、引发体的形成
高度解链的模板与蛋白质的复合体促 进引发酶（primase）加入来形成引 发体（primosome），合成引物RNA。 大肠杆菌引发酶是一个的单亚基多肽， 是dnaG基因的产物。 引发酶（RNA聚合酶）不同于参与 DNA复制的聚合酶，它能重新起始 一个新核苷酸链的合成。


DnaB螺旋酶和引发酶之间的蛋白质 接触对复制叉的功能是重要的，引发 酶的聚合酶活性通过与DnaB相互作 用而激活。
细菌中有两种合成RNA的酶，一种是 RNA聚合酶，另一种是引发酶。RNA聚 合酶对利福霉素敏感而引发酶则不敏感。 前导链的合成可以被利福霉素抑制，而 滞后链中岗崎片段的起始不被抑制。 表明前导链引物是由RNA聚合酶合成的； 而滞后链引物的是由引发酶合成。