实验三细菌的分离培养及移植
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➢ ⑥将干燥皿边缘涂一层凡士林油，并盖盖密封，轻轻摇动 干燥皿，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中，将干燥皿 放入温箱培养，经2～3d，即可看到细菌生长。
➢ 美蓝指示剂可显示干燥器中的厌氧程度，美蓝在有氧时呈 氧化型（蓝色），无氧时呈还原型（无色）。
➢ （2）李伏夫法
➢ 此法系用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应，以 吸收空气中的氧气，其反应式如下：
➢ 方法：
➢ ①取一个干燥器，用水量出其体积。
➢ ②按体积计算并称量出焦性没食子酸和10％氢氧化钠的用 量。
➢ ③将氢氧化钠溶液倒入干燥皿的底部，将焦性没食子酸用 纸包好，用青霉素小瓶将焦性没食子酸支撑于氢氧化钠溶 液上方，两种药品勿接触。
➢ ④放上隔板，将接种好的培养皿放在隔板上。
➢ ⑤放入一支美蓝指示剂管。
谢谢欣赏
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nana22ss22oo44na22coco33na22soso44na22sosoco22该法与焦性没食子酸法操作基本相同只该法与焦性没食子酸法操作基本相同只是用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应来吸收罐是用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应来吸收罐中的oo22按1000cm1000cm33空间用连二亚硫酸钠空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各及碳酸钠各3g3g称取药品在纸上混匀后称取药品在纸上混匀后加水少许使混合物潮湿立即放入干燥器加水少许使混合物潮湿立即放入干燥器底部上放隔板及培养皿密封培养
，接种后将平皿用石蜡密封，倒扣置37℃恒温箱 中培养2～3d后，即可观察到需氧菌和厌氧菌先 后生长的现象。
➢ 2、化学方法
利用还原作用强的化学物质，将环境或培养 基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降 低氧化-还原电势。
➢ （1）焦性没食子酸法
原理：
焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大量 氧气 ，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食 子橙。每100cm3空间用焦性没食子酸1g及 10％氢氧化钠10ml。
➢ 3、物理学方法
➢ 利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱 除或隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成 厌氧状态，有利于厌氧菌的生长发育。
Байду номын сангаас
➢ （1）厌氧罐法
➢ 将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中
，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通 电，使罐中残存的氧与氢经铂或钯的催化而 化合成水，使罐内氧气全部消失。将整个厌 氧罐放入温箱培养。本法适用大量的厌氧菌 培养。
➢ 3、倾注培养法
取3支融化后冷却至55℃左右的琼脂培 养基，用接种环取一环培养物至第1管内， 摇匀。从第1管取一接种环至第2管，混匀。 再由第2管取一接种环至第3管，混匀。将3 管含有培养物的琼脂培养基分别倒入3个灭 菌培养皿内做成平板，凝固后倒放于37℃恒 温箱内培养，24h后观察结果。第1管的平板 菌数甚多，而第2、第3管之平板则渐渐减少
➢ 1、平板划线法
此法为最常用的分离培养法。即将被检 材料或混杂的材料在平板培养基上连续划 线，从而使细菌分散开，以求培养后获得 单个菌落，进行纯培养。平板划线的方法 有多种，可按各人的习惯选择应用。
➢ 划线时须注意以下几点： ①左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈 20度左右的角度(角度越小越好，以免空气中的细菌污 染培养基)。 ②右手持接种环，蘸取少许材料涂布于培养基边缘(量不 易多，越少越好)，然后将接种环上多余的材料烧掉， 待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开 始划线。 ③划线时接种环与培养基之间角度要小，划线用力要均 匀、轻巧，以免划破培养基。 ④划线中线的疏密要合适，太密容易形成菌苔，过疏不 能充分利用平板的表面积，也不易得到单个菌落。同 时不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。
➢ （2）真空干燥器法
将欲培养的平皿或试管放入真空干燥器中
，开动抽气机，抽至高度真空后，替代以 氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放 进温箱培养。
➢ （3）高层琼脂法
加热融化高层琼脂，冷至45℃左右接种厌 氧菌，迅速混合均匀。冷凝后37℃培养， 厌氧菌在近管底处生长。
三、二氧化碳培养法
➢ 少数细菌如布氏杆菌（牛型）等，培养时， 需5％～10％ CO2环境，方能生长。常用的 方法是置于CO2培养箱中进行培养；最简单 的CO2培养法是在盛放培养物的干燥器内， 燃点蜡烛，当火焰熄灭时，该缸的大气中， 就约增加了5％～10％的CO2。
➢ 1、生物学方法
①厌氧肝汤培养法 培养基中含动物组织（肝 块），表面盖有液体石蜡，肝块中的可氧化物质 氧化而消耗氧气，液体石蜡隔绝空气，从而形成 厌氧环境。
②厌氧菌与需氧菌共同培养 是利用需氧菌的 生长消耗氧气，造成厌氧环境，培养厌氧菌的方 法。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力 强的需氧菌（如枯草杆菌），另一半接种厌氧菌
疑菌落纯培养。
5、要严格地进行无菌操作。 6、做好标记。
➢ [实验材料] 1、菌种：大肠杆菌、大肠杆菌与金黄色 葡萄球菌混合培养物。 2、器械：剪刀、记号笔、酒精灯、接种 环。 3、培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、 普通琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板 （或麦康凯琼脂平板）。
➢ [方法与步骤]
一、需氧菌的分离培养法
Na2S2O4 + Na2CO3 + O → Na2SO4 + Na2SO3 + CO2
➢ 该法与焦性没食子酸法操作基本相同，只 是用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应来吸收罐 中的O2，按1000cm3空间用连二亚硫酸钠 及碳酸钠各3g称取药品，在纸上混匀后， 加水少许使混合物潮湿，立即放入干燥器 底部，上放隔板及培养皿，密封培养。
➢ 6、穿刺培养
半固体移植用穿刺法接种。方法基本上与 纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取 菌落，垂直刺入培养基内。要从培养基表 面的中部一直刺入管底，然后按原方向退 出即可。
二、厌氧菌的分离培养法
➢ 厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离O2存在， 游离O2可造成细菌的死亡，所以在培养厌 氧菌时，要创造一个厌氧环境。现有的厌 氧培养法有生物学、化学和物理学3种方法， 可根据各实验室的具体情况选用。
，此法现在应用较少。
➢ 4、纯培养
将培养24h的平板从温箱取出，挑取单 个菌落的一部分，经染色镜检，证明不含 杂菌，此时用接种环挑取这个菌落剩余的 部分，移植于琼脂斜面培养，得到的培养 物，即为纯培养物。
➢ 5、细菌的移植 细菌移植操作法如下：
➢ 两试管斜面移植时，左手持菌种管和被接种琼脂 斜面管，使管口并齐，管底部放在拇指和食指之 间，松动棉塞，以便接种时容易拔出。右手持接 种环，在火焰上灭菌后，用右手小指和无名指同 时拔出两支管的棉塞，将管口进行火焰灭菌，使 其靠近火焰。将接种环伸入菌种管内，冷却后挑 取少许细菌，拉出接种环立即伸入另一管斜面培 养基上，从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶 端为止，管口通过火焰灭菌，将棉塞塞好。接种 完毕，在试管壁上注明菌名、日期和接种者，置 37℃温箱中培养。
⑤接种完，在皿底做好标记，平皿倒扣，置37℃培养。
➢ 2、稀释涂布分离法
首先将待分离的材料做10×的连续稀释， 如10-1、10-2、10-3…等，然后选择几个合 适的稀释度，分别从中吸取一定量的稀释 液（0.1ml），加到不同的平板培养基表面， 再用灭菌玻璃推棒将液体推匀，做好标记， 置37℃培养。经培养后即可出现单个菌落。
实验三 细菌的分离 培养及移植
➢ [目的要求] 1、掌握细菌分离培养的基本要领和方法。 2、掌握厌氧菌培养的原理及其方法。
➢ [细菌分离培养和移植的一般原则] 在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一
环。分离培养的目的是在含多种细菌的病料或培 养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意以 下事项：
1、选择适合于所分离细菌生长的培养基。 2、确定合适的培养温度。 3、根据细菌的生长要求决定培养的气体条件。 4、初次分离发现有多种细菌时，应进一步选择可
➢ 美蓝指示剂可显示干燥器中的厌氧程度，美蓝在有氧时呈 氧化型（蓝色），无氧时呈还原型（无色）。
➢ （2）李伏夫法
➢ 此法系用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应，以 吸收空气中的氧气，其反应式如下：
➢ 方法：
➢ ①取一个干燥器，用水量出其体积。
➢ ②按体积计算并称量出焦性没食子酸和10％氢氧化钠的用 量。
➢ ③将氢氧化钠溶液倒入干燥皿的底部，将焦性没食子酸用 纸包好，用青霉素小瓶将焦性没食子酸支撑于氢氧化钠溶 液上方，两种药品勿接触。
➢ ④放上隔板，将接种好的培养皿放在隔板上。
➢ ⑤放入一支美蓝指示剂管。
谢谢欣赏
THANK YOU FOR WATCHING
nana22ss22oo44na22coco33na22soso44na22sosoco22该法与焦性没食子酸法操作基本相同只该法与焦性没食子酸法操作基本相同只是用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应来吸收罐是用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应来吸收罐中的oo22按1000cm1000cm33空间用连二亚硫酸钠空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各及碳酸钠各3g3g称取药品在纸上混匀后称取药品在纸上混匀后加水少许使混合物潮湿立即放入干燥器加水少许使混合物潮湿立即放入干燥器底部上放隔板及培养皿密封培养
，接种后将平皿用石蜡密封，倒扣置37℃恒温箱 中培养2～3d后，即可观察到需氧菌和厌氧菌先 后生长的现象。
➢ 2、化学方法
利用还原作用强的化学物质，将环境或培养 基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降 低氧化-还原电势。
➢ （1）焦性没食子酸法
原理：
焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大量 氧气 ，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食 子橙。每100cm3空间用焦性没食子酸1g及 10％氢氧化钠10ml。
➢ 3、物理学方法
➢ 利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱 除或隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成 厌氧状态，有利于厌氧菌的生长发育。
Байду номын сангаас
➢ （1）厌氧罐法
➢ 将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中
，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通 电，使罐中残存的氧与氢经铂或钯的催化而 化合成水，使罐内氧气全部消失。将整个厌 氧罐放入温箱培养。本法适用大量的厌氧菌 培养。
➢ 3、倾注培养法
取3支融化后冷却至55℃左右的琼脂培 养基，用接种环取一环培养物至第1管内， 摇匀。从第1管取一接种环至第2管，混匀。 再由第2管取一接种环至第3管，混匀。将3 管含有培养物的琼脂培养基分别倒入3个灭 菌培养皿内做成平板，凝固后倒放于37℃恒 温箱内培养，24h后观察结果。第1管的平板 菌数甚多，而第2、第3管之平板则渐渐减少
➢ 1、平板划线法
此法为最常用的分离培养法。即将被检 材料或混杂的材料在平板培养基上连续划 线，从而使细菌分散开，以求培养后获得 单个菌落，进行纯培养。平板划线的方法 有多种，可按各人的习惯选择应用。
➢ 划线时须注意以下几点： ①左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈 20度左右的角度(角度越小越好，以免空气中的细菌污 染培养基)。 ②右手持接种环，蘸取少许材料涂布于培养基边缘(量不 易多，越少越好)，然后将接种环上多余的材料烧掉， 待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开 始划线。 ③划线时接种环与培养基之间角度要小，划线用力要均 匀、轻巧，以免划破培养基。 ④划线中线的疏密要合适，太密容易形成菌苔，过疏不 能充分利用平板的表面积，也不易得到单个菌落。同 时不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。
➢ （2）真空干燥器法
将欲培养的平皿或试管放入真空干燥器中
，开动抽气机，抽至高度真空后，替代以 氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放 进温箱培养。
➢ （3）高层琼脂法
加热融化高层琼脂，冷至45℃左右接种厌 氧菌，迅速混合均匀。冷凝后37℃培养， 厌氧菌在近管底处生长。
三、二氧化碳培养法
➢ 少数细菌如布氏杆菌（牛型）等，培养时， 需5％～10％ CO2环境，方能生长。常用的 方法是置于CO2培养箱中进行培养；最简单 的CO2培养法是在盛放培养物的干燥器内， 燃点蜡烛，当火焰熄灭时，该缸的大气中， 就约增加了5％～10％的CO2。
➢ 1、生物学方法
①厌氧肝汤培养法 培养基中含动物组织（肝 块），表面盖有液体石蜡，肝块中的可氧化物质 氧化而消耗氧气，液体石蜡隔绝空气，从而形成 厌氧环境。
②厌氧菌与需氧菌共同培养 是利用需氧菌的 生长消耗氧气，造成厌氧环境，培养厌氧菌的方 法。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力 强的需氧菌（如枯草杆菌），另一半接种厌氧菌
疑菌落纯培养。
5、要严格地进行无菌操作。 6、做好标记。
➢ [实验材料] 1、菌种：大肠杆菌、大肠杆菌与金黄色 葡萄球菌混合培养物。 2、器械：剪刀、记号笔、酒精灯、接种 环。 3、培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、 普通琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板 （或麦康凯琼脂平板）。
➢ [方法与步骤]
一、需氧菌的分离培养法
Na2S2O4 + Na2CO3 + O → Na2SO4 + Na2SO3 + CO2
➢ 该法与焦性没食子酸法操作基本相同，只 是用连二亚硫酸钠和碳酸钠反应来吸收罐 中的O2，按1000cm3空间用连二亚硫酸钠 及碳酸钠各3g称取药品，在纸上混匀后， 加水少许使混合物潮湿，立即放入干燥器 底部，上放隔板及培养皿，密封培养。
➢ 6、穿刺培养
半固体移植用穿刺法接种。方法基本上与 纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取 菌落，垂直刺入培养基内。要从培养基表 面的中部一直刺入管底，然后按原方向退 出即可。
二、厌氧菌的分离培养法
➢ 厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离O2存在， 游离O2可造成细菌的死亡，所以在培养厌 氧菌时，要创造一个厌氧环境。现有的厌 氧培养法有生物学、化学和物理学3种方法， 可根据各实验室的具体情况选用。
，此法现在应用较少。
➢ 4、纯培养
将培养24h的平板从温箱取出，挑取单 个菌落的一部分，经染色镜检，证明不含 杂菌，此时用接种环挑取这个菌落剩余的 部分，移植于琼脂斜面培养，得到的培养 物，即为纯培养物。
➢ 5、细菌的移植 细菌移植操作法如下：
➢ 两试管斜面移植时，左手持菌种管和被接种琼脂 斜面管，使管口并齐，管底部放在拇指和食指之 间，松动棉塞，以便接种时容易拔出。右手持接 种环，在火焰上灭菌后，用右手小指和无名指同 时拔出两支管的棉塞，将管口进行火焰灭菌，使 其靠近火焰。将接种环伸入菌种管内，冷却后挑 取少许细菌，拉出接种环立即伸入另一管斜面培 养基上，从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶 端为止，管口通过火焰灭菌，将棉塞塞好。接种 完毕，在试管壁上注明菌名、日期和接种者，置 37℃温箱中培养。
⑤接种完，在皿底做好标记，平皿倒扣，置37℃培养。
➢ 2、稀释涂布分离法
首先将待分离的材料做10×的连续稀释， 如10-1、10-2、10-3…等，然后选择几个合 适的稀释度，分别从中吸取一定量的稀释 液（0.1ml），加到不同的平板培养基表面， 再用灭菌玻璃推棒将液体推匀，做好标记， 置37℃培养。经培养后即可出现单个菌落。
实验三 细菌的分离 培养及移植
➢ [目的要求] 1、掌握细菌分离培养的基本要领和方法。 2、掌握厌氧菌培养的原理及其方法。
➢ [细菌分离培养和移植的一般原则] 在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一
环。分离培养的目的是在含多种细菌的病料或培 养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意以 下事项：
1、选择适合于所分离细菌生长的培养基。 2、确定合适的培养温度。 3、根据细菌的生长要求决定培养的气体条件。 4、初次分离发现有多种细菌时，应进一步选择可