喜树及其相关生物技术

材料：喜树悬浮细胞系为笔者潘学武的研究小组
从喜树诱导培养而来的一个普通细胞系。
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方法：在悬浮细胞系培养建立与优化后，用不同
的剂量的Cu2+或不同的时间加入Cu2+为变量分 别进行处理（其中Cu2+以过滤除菌的硫酸铜溶液 的形式在细胞接种后加入）细胞培养到第21天时 收获，测定生长速率和喜树碱含量。
正是由于这一 次的抗癌活性的测 试计划，喜树以不 同于景观树的角色 进入了我们的视野。
目录
一、关于喜树
喜树原名旱莲，始 记载于《植物名实图 考》木类，现在的别 名有水桐树、天梓树、 野芭蕉、旱莲木、水 漠子、南京梧桐、水 栗子、水冬瓜、秋青 树、圆木、土八角、 千丈树等。为山茱萸 目，蓝果树科喜树属 落叶乔木。
蓝果树科植物喜 树的果实或根及根皮 均是中药材。
喜树果
采收和储藏：果实于 10-11月成熟时采收， 晒干。根及根皮全年可 采，但以秋季采剥为好， 除去外层粗皮，晒干或 烘干。
喜树根
喜树果
果实披针形，长2～2.5cm，宽5～7mm，先 端尖，有柱头残基；基部变狭，可见着生在花 盘上的椭圆形凹点痕，两边有翅。表面棕色至 棕黑色，微有光泽，有纵皱纹，有时可见数条 角棱和黑色斑点。质韧，不易折断，断面纤维 性，内有种子1粒，干缩成细条状。味苦。
喜树是一种暖地速生树 种。花期7月，果熟期11月， 喜光，不耐严寒干燥。需 土层深厚，湿润而肥沃的 土壤，在干旱瘠薄地种植， 生长痩长，发育不良。深 根性，萌芽率强。较耐水 湿，在酸性、中性、微碱 性土壤均能生长，在石灰 岩风化土及冲积土生长良 好。
喜树亦可作庭荫树、 行道树，主干通直，树冠 宽展，本种生长迅速，为 优良的庭园树和行道树， 可作为绿化城市和庭园的 优良树种。且其为我国特 有。分布于长江以南、海 拔1000m以下的林边和溪 边。是【国家Ⅱ级重点保 护野生植物】：（国务院 1999年8月4日批准）
利用所构建的根癌农杆菌菌株转化喜树细胞，获得经 PCR检测的转基因愈伤组织；
半定量RT-PCR测定喜树愈伤组织中aoe基因的表达；
对获得的转基因愈伤组织中喜树碱含量进行HPLC测定 筛选喜树碱含量显著提高的转基因喜树愈伤组织。
Cu2+诱导刺激对喜树悬浮培养细胞喜 树碱生物合成的影响
研究人员：董妍玲，潘学武
【化学成分】：含喜树碱、喜树次碱、10-羟基 喜树碱、10-甲氧基喜树碱、白桦脂酸、长春甙 内酰胺等。 【性味】：性寒，味苦、 涩；有毒。 【功能主治】：抗癌，散 结，破血化瘀用于多种肿 瘤，如胃癌、肠癌、绒毛 膜上皮癌、淋巴肉瘤等。
二、喜树碱
其来自于珙桐科植物喜树的 果实、叶。喜树碱 (Camptothecin，CPT)，是一种 细胞毒性喹啉类生物碱，能抑制 DNA拓扑异构酶(TOPO I)。 1966年由M.E. Wall和M.C. Wani 通过有系统的筛选天然物质，也 是继紫杉醇之后的另一种天然植 物来源的最重要的抗癌药物，其 疗效显著、毒副作用小，已经成 为世界范围内的研究热点。
从上表可以看出，经过秋水仙素处理的喜树种 子萌发后形成的植物具有明显的多倍体特征，而对 于多倍体，由染色体上基因调控的有效化学成分含 量往往比正常二倍体高。
转基因提高喜树愈伤组织中喜树碱含量
专利申请公布号：CN 101831456 A
发明人：孙小芬，皮妍，蒋科技，唐克轩 技术领域：生物技术领域，涉及一种提高
ห้องสมุดไป่ตู้
经秋水仙素溶液处理过的顶芽， 部分顶芽不展开，外表变为黑色， 呈现死亡的状态，部分顶芽已展 开的叶片产生弯曲现象，叶片较 肥厚，叶缘不规则，生长速度慢。
对叶片进行切片观察，发现经过秋水仙素溶液处 理过的叶片叶脉增多，撅取叶片下表皮在显微镜下观 察，可见单位面积内的气孔数目减少，但每个气孔的 直径增大。
被砍的喜树
喜树的多倍体诱导研究
研究人员：王跃华，胡水君，张海强，韩海洋，
尹国胜
材料：喜树枝条和种子采于成都大学校园内栽
种的喜树。选取生长健康、无病虫害的喜树枝条 和种子为供试外植体。
方法：不同浓度的秋水仙素溶液处理喜树顶芽及
种子。
结果与分析：
得到最适于用来处理喜树枝条与种子的秋水仙 素溶液浓度及处理时间：根据经处理过的枝条与 种子的存活率和诱导率。 如：
临床应用： 用于恶性肿瘤，银屑病，
治疣，急慢性白血病以及血吸虫病引起 的肝脾肿大等。
喜树碱的衍生物10-羟 基喜树碱的抗癌活性超过喜 树碱，对肝癌和头颈部癌也 有明显疗效 ，而且副作用较 少。它主要作用于S期，对 G1期、G2期、M期细胞有 轻微的杀伤力，对G0期细 胞无作用。通过抑制DNA拓 扑异构酶I（TopoI）而阻碍 DNA复制，使DNA链不可逆 破坏，从而导致细胞死亡。
喜树及其相关的生物技术
生物与制药工程学院
中国死亡率排行榜首八大疾病
根据最新的调查结果，显示如下： 1、脑血管病 22.63% 2、恶性肿瘤 22.17% 3、心脏病 16.77% 4、呼吸系统疾病 14.09% 5、损伤、中毒 6.18% 6、消化系统疾病 3.10% 7、内分泌 , 营养代谢系统 2.66% 8、泌尿、生殖系病 1.49% 其中在我国城市前五位死亡原因依次是：恶性肿瘤、 脑血管病、心脏病、呼吸系统疾病、损伤和中毒；农村 依次是：脑血管病、恶性肿瘤、呼吸系统疾病、心脏病、 损伤和中毒。
喜树碱生物合成途径及其代谢调控、 相关酶等的研究进展
四、展望
进入21世纪以来，癌症已经成了人类健康的 一大隐患，严重威胁着人类的健康。传统的抗癌 药物紫杉醇、长春碱等．由于价格昂贵、产量低， 难以满足医药卫生事业的需求，寻找新型抗癌药 物势在必行。喜树碱及其衍生物具有高效的抗癌 作用，并且来源相对紫杉醇和长春碱更广，产量 也大大超过前两者．是一类非常有开发前景的抗 肿瘤药物。可以相信，通过生物化工研究工作者 的努力，随着生物技术的广泛应用和研究的深入， 喜树碱大量生产有效途径必将寻得，喜树资源将 得以充分利用和可持续发展。
能影响喜树碱含量的物质还有：黑 曲霉真菌诱导子、壳聚糖诱导子、一 种双关键酶基因共转化、真菌诱导子 和抗褐变剂等。 促进羟喜树碱合成的 多种生物技术
不同化学因子对喜树细胞悬浮培养 生长效应的研究
这些化学因子有：NAA单因子、6-BA单因 子、KT单因子、2，4-D单因子、NAA与KT组 合、NAA与6-BA组合等。
从成活率看，Al、A2的成活 率最高，成活率为100％， A6的成活率最低为0％；从 诱导率的角度看，A1、A6的 诱导率最低为o％，A5的诱 导率最高为100％．
得到经过多倍体诱导的枝条或各种形式的嵌 合体植株。
未经秋水仙素溶液处理的顶芽 已经完全展开，颜色鲜绿，叶片 伸直，叶缘正常，生长速度快；
分子式: C20H16N2O4 相对分 子质量： 348.34 理化性质： 浅黄色针状结晶(甲 醇-乙腈) ，分解点：264℃～ 267℃，[α]25D +31.3。(氯仿-甲 醇) 。在紫外光下表现强烈的蓝色 荧光，和酸不能生成稳定的盐。
喜树碱
药理作用： 抗肿瘤，免疫抑制，抗
病毒，抗早孕，改变皮肤表皮的角化过 程。
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三、与喜树相关的生物技术
在我国，喜树的野生资源已经 处于濒危状态，在某些地方已经绝 迹，现存的少量野生资源也存在灭 绝的危险。现今全世界喜树碱的生 产能力仅为600kg，远远不能满足市 场的需要，而且喜树碱仍不能化学 合成，所以喜树资源仍是喜树碱及 其类似物的唯一来源。因此，喜树 资源的严重不足已经引起供求之间 的严重矛盾。目前，人们利用一些 生物技术，在扩大喜树资源研究方 面已经有了一些成果。
喜树愈伤组织中喜树碱含量的方法，特别是 一种采用转化丙二稀氧化物环化酶基因 （allene oxide cyclase,aoe）提高喜树愈伤 组织中喜树碱含量的方法。
步骤：
采用基因克隆的方法获得喜树关键酶基因aoc； 把aoc基因可操作性地连于表达调控序列，形 成含aoc基因的植物表达载体； 将含aoc基因的植物表达载体转化根癌农杆菌， 获得用于转化喜树的含aoc基因植物表达载体的根 癌农杆菌菌株；
结果与分析：
不同剂量的 Cu2+对喜树 悬浮培养细胞 生长及其喜树 碱含量和产量 的影响极大。
0．5μmoL／L的 最终Cu2+浓度在第 8天加入时可使细胞 干重达到最大值， 同时也诱导喜树碱 的积累，而 40．0μmol／L的最 终Cu2+浓度在第18 天加入时可获得喜 树碱的最大产量。
高浓度的Cu2+主要作 为诱导子而起作用，而 且在培养的中后期，即 次生代谢产物开始大量 合成的时期加入最有效。 通过不同细胞生长时间 段的重复刺激，即早期 添加Cu2+主要作为营 养因子，中后期添加 Cu2+主要作为诱导子， 这样既可以显著地促进 喜树碱的积累，又可以 不影响细胞的生长。