人教版高中生物选修一专题五《DNA和蛋白质技术》知识点归纳

专题五ＤＮＡ和蛋白质技术
课题一ＤＮＡ粗提取及鉴定
一、提取DNA溶解性原理包括哪些方面？
1.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。

①DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？要使DNA
溶解，需要使用什么浓度？要使DNA析出，又需要使用什么浓度？
在0.14mol/L时溶解度最小；较高浓度可使DNA溶解；0.14mol/L
可使DNA析出。

②在溶解细胞中DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；将
DNA分子析出方法是向溶有DNANaCl溶液中缓慢注入蒸馏水，以
稀释NaCl溶液。

酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于
酒精（特别是95％冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。

2.从理论上分析，预冷乙醇溶液具有以下优点。

一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；
二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；
三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。

3.采用DNA不溶于酒精原理，可以达到什么目？
将DNA和蛋白质进一步分离。

4.提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂耐受性原理。

利用该原理时，应选用怎样酶和怎样温度值？
蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。

温度值为60～80℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。

补充：DNA变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR技术中DNA变性温度在95℃。

5.洗涤剂在提取DNA中有何作用？
洗涤剂将细胞膜上蛋白质，从而瓦解细胞膜。

6.当鉴定提取出物质是否是DNA时，需要使用什么指示剂进行鉴定？在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色。

原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA及蛋白质分离开来，达到提纯目；最后利用二苯胺试剂鉴定提取物质是否是DNA。

二、实验材料选取
不同生物组织中DNA含量不同。

在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取原则。

本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。

一是因为鸡血细胞核DNA含量丰富，材料易得；
二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。

鸡血细胞破碎以后释放出DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA 损失，最好使用塑料烧杯和试管盛放鸡血细胞液。

三、破碎细胞，获取含DNA滤液
1、若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA滤液？
在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一
定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。

2.为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌机械作用，就加速了鸡血细胞破裂(细胞膜和核膜破裂)，从而释放出DNA。

3．在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。

血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进行过滤。

4.在处理植物组织时需要进行研磨，其目是什么？研磨不充分产生什么结果？
破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使DNA提取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

具体做法。

10mL鸡血＋20mL蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液
三、去除滤液中杂质
1.为什么反复地溶解及析出DNA，能够去除杂质？
用高盐浓度溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中杂质。

因此，通过反复溶解及析出DNA，就能够除去及DNA溶解度不同多种杂质。

最初获得DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。

方案一原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三原理是蛋白质和DNA变性温度不同。

方案二及方案三原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取DNA及蛋白质分开；方案三利用是DNA和蛋白质对高温耐受性不同，从而使蛋白质变性，及DNA分离。

四、析出及鉴定
1.在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到DNA呈何颜色？
滤液及等体积冷却酒精混合均匀，静置2～3分钟，析出白色丝状物就是DNA。

DNA呈白色。

2.怎样鉴定析出白色丝状物就是DNA呢？
具体做法。

试管2支，编号甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放
入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均匀→沸水浴5min
→观察颜色变化
五、实验操作
制备鸡血细胞液…………加柠檬酸钠，静置或离心
↓
破碎细胞，释放DNA…加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌
↓→过滤，除去细胞壁、细胞膜等。

溶解核内DNA…………加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅拌
↓
DNA析出………………加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中
↓→除去细胞质中大部分物质。

DNA初步纯化…………及等体积95％冷却酒精混合，析出白色丝状物
↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鉴定………………二苯胺，沸水浴，呈现蓝色
注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。

课题二多聚酶链式反应扩增DNA片段
基础知识
PCR技术扩增DNA过程，及细胞内DNA复制过程类似：
1．细胞内DNA复制条件分析：
条件组分作用
模板DNA两条单链提供复制模板
原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链原料
酶解旋酶
DNA聚合酶
打开DNA双螺旋
催化合成DNA子链
能量ATP 为解螺旋和合成子链供能
引物RNA 为DNA聚合酶提供合成3’端起点
2．细胞内DNA复制过程解析：
解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端及DNA反向配对结合。

DNA聚合酶结合：DNA聚合酶及模板链结合，标志着单链合成开始。

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：D NA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处DNA单链，再由DNA连接酶将不连续DNA子链连接起来（半不连续合成。

先导链，滞后链）
3．DNA分子复制人工控制
实验操作步骤
照PCR反应体系配方配制反应液；
②将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；
③将微量离心管放到PCR仪中；
④设置PCR仪工作参数。

⑤DNA在PCR仪中大量扩增。

4．实验注意事项
（1）避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

（2）缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器枪头。

（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

总结、点评
课题三 血红蛋白提取和分离
一、实验原理
蛋白质物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．凝胶色谱法（分配色谱法）：
（1）原理：分子量大分子通过多孔凝胶颗粒间隙，路程短，流动快；分子量小分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子差速流动。

（4）作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质脱盐等。

2．缓冲溶液
（1）原理：由弱酸和相应强碱弱酸盐组成（如H 2CO 3－NaHCO 3， NaH 2PO4/Na 2HPO 4等），调节酸和盐用量，可配制不同pH 缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH 干扰而保持pH 稳定。

3．凝胶电泳法：
（1）原理：不同蛋白质带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中运动方向和运动速度不同。

（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

（3）分离过程：在一定pH 下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多SDS ，形成“蛋白质－SDS 复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

二、实验步骤
1．样品处理
红细胞洗涤
洗涤红细胞目是去除杂蛋白，采集血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明黄色血浆，将下层暗红色红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积多聚酶链式反应扩增DNA 片段 PCR 原理 DNA 的复制需要酶、原料、能量、引物 DNA 的变性和复性受温度影响 PCR 过程 变性 复性 延伸 操作步骤 配制PCR 反应体系 移入离心管 放入PCR 设置工作参数 DNA 扩增 测定含量 稀释 调零 测定并读数
计算
生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

②血红蛋白释放
在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

注：加入蒸馏水后红细胞液体积及原血液体积要相同。

加入甲苯目是溶解细胞膜，有利于血红蛋白释放和分离。

2．粗分离
①分离血红蛋白溶液
将搅拌好混合溶液离心后，试管中溶液分为4层。

第一层为无色透明甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白水溶液，第4层是其他杂质暗红色沉淀物。

将试管中液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层红色透明液体。

②透析
取1mL血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL物质量浓度为20mmol/L 磷酸缓冲液中，透析12h。

透析可以去除样品中分子量较小杂质，或用于更换样品缓冲液。

3．纯化
调节缓冲液面：打开色谱柱下端流出口，使柱内凝胶面上缓冲液缓慢下降到及凝
↓胶面平齐，关闭出口。

加入蛋白质样品：用吸管将透析后样品沿管壁环绕移动加到色谱柱顶端。

加样后，
∣打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，
↓关闭出口。

调节缓冲液面：加入20mmol/L磷酸缓冲液到适当高度
↓
洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。

↓
收集分装蛋白质：待红色蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。

4.纯度鉴定------SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）
三、注意事项
电泳技术
电泳技术就是在电场作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质差异，使带电分子产生不同迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯目。

2. 红细胞洗涤
如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白原因。

此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净红细胞，影响后续血红蛋白提取纯度。

3．如何检测凝胶色谱柱装填是否成功
由于凝胶是一种半透明介质，因此可以在凝胶柱旁放一支及凝胶柱垂直日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。

此外，还可以加入大分子有色物质，观察色带移动情况。

如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱性能良好。

如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

4．为什么凝胶装填要紧密、均匀？
如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效空隙，使本该进入凝胶内部样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液流动次序，影响分离效果。

5．沸水浴处理加入洗脱液湿凝胶目
不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有微生物和排除凝胶内空气。

6．G-75
“G”代表凝胶交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。

7．装填完后，立即用洗脱液洗脱目：使凝胶装填紧密
8．加入柠檬酸钠有何目？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？
防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

9．及其他真核细胞相比，红细胞特点及这一特点对进行蛋白质分离意义
哺乳动物及人成熟红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。

其含有血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。

这使血红蛋白分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

10．如何检测血红蛋白分离是否成功
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确话，能清楚地看到血红蛋白红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离效果不好，这及凝胶色谱柱装填有关。