第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 中文说明书

第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit中文说明书2013-12-07 13:20:16
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379012001b)04896866001c************
1
红色
Transcriptor
Reverse
Transcriptase（逆转录酶）
a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)
b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)
c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)
•储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.2
2
无色
Transcriptor RT
Reaction Buffer(5×)
（逆转录缓冲液）
a) 1瓶，1 ml
b) 1瓶，1 ml
c) 2瓶，各1 ml
• 5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)
3
无色
Protector
RNase Inhibitor
（RNase抑制剂）
a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)
b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)
c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)
•储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)
4
黄色/
紫色
Deoxynuc-leo-tide
Mix
（dNTP）
a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)
b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)
c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)
• dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM
5
蓝色
Anchored-oligo(dT)18
Primer
（锚定oligo(dT)18引物）
a) 1瓶，100 μl(50 μM)
b) 1瓶，200 μl(50 μM)
c) 2瓶，各200 μl(50 μM)
6
Random Hexamer
a) 1瓶，100 μl(600 μM)
蓝色
Primer（随机引物）
b) 1瓶，200 μl(600 μM)
c) 2瓶，各200 μl(600 μM)
7
绿色
Control RNA
（对照RNA）
a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)
•包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA片段稳定溶液
8
绿色
Control Primer Mix PBGD
（对照基因引物）
a) 1瓶，40 μl
•5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物
9(b和c为瓶7)
无色
Water, PCR-grade
a) 1瓶，1 ml
b) 2瓶，各1 ml
c) 3瓶，各1 ml
注意：货号为***********和***********的产品不含有control试剂(瓶7和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。

储存条件及其稳定性
请将该产品存放于-15~-25°C条件中，并于产品标签上的有效期之前使用。

注意：Control RNA(货号***********的瓶7)应储存于-70°C条件。

请避免将产品反复冻融！
2 产品使用方法
2.1 实验前准备
样本材料
RNA模板：分离的总RNA，mRNA，病毒RNA或体外转录的RNA。

注意：想要得到较好的RT结果，使用高质量完整的RNA(不含基因组DNA残留、RNA酶、抑制剂)是必要的。

请根据以下预防措施进行操作，避免使RNA在分离过程中受到RNA酶的污染(从细胞裂解开始)：
- 使用RNA酶抑制剂(如Protector RNase Inhibitor)或在使RNA酶失活的分离条件下进行操作。

- 如果有必要，用凝胶电泳分析过程中不同步骤(裂解、分离)以确保样本中不含有RNA酶。

- 请记住RNA酶也可能出现在受到污染的玻璃容器中。

为了准备总RNA或mRNA，我们建议您使用罗氏应用科学部的试剂。

为了筛选出能够产生高质量的适用于RT-PCR的完整RNA模板，请参考第3部分。

补充信息：想了解订货信息或查看相关核酸分离纯化指南，请访问/napure.想了解关于使用MagNA Pure LC System或MagNA Pure Compact System进行核酸自动分离的更多信息，请访问.
引物
•六聚物随机引物
在常规的RT反应中，使用5μg的总RNA模板，可采用60μM的随机引物终浓度。

使用5μg总RNA并增加随机引物浓度，将增加短片段PCR产物（的产率，但是相应地，长片段PCR产物及全长转录子的产率会降低。

在非特异引物的反转录方法中，随机引物法是最多使用的一种方法，其特异性的扩增产物只能通过后续的PCR反应中使用特异的PCR引物获得。

•锚定oligo(dT)18引物
锚定oligo(dT)18引物特异性地结合在带有poly(A)+的RNA片段上，这类片段通常只占总RNA 的1-2%，因此用锚定oligo(dT)18引物进行反转录所获得的cDNA产率大大低于随机引物方法。

如果实验是为了获得新mRNA的RT-PCR产物，则推荐使用锚定oligo(dT)18引物。

使用该方法获得的RT-PCR产物具有较强的一致性。

•特异性序列引物
使用特异性序列引物，其终浓度推荐为2μM。

但是请注意，即使这些引物在以DNA作为模板的PCR反应中成功获得扩增产物，相同的引物序列却可能难以定位在cDNA片段上。

如果遇到此类情况，请使用锚定oligo(dT)18引物重新进行第一链合成反应。

2.2 实验流程
标准RT-PCR流程
在此提供两种不同的操作流程：
• A：反转录使用锚定oligo(dT)18引物或六聚物随机引物或特异性序列引物。

在大多数情况下，只选择其中的一种引物进行cDNA合成。

• B：反转录使用oligo(dT)18引物和六聚物随机引物的混合物。

这种方法可提高反应敏感度，但与使用单一oligo(dT)18引物比起来反应特异性会降低。

注意：根据您使用的引物类型，参考以下给出的流程A与B。

流程A：使用锚定oligo(dT)18引物或六聚物随机引物或特异性序列引物合成cDNA。

以下描述的条件适用于两步法RT-PCR的第一链cDNA合成。

图1为单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述。

单一反应
多重反应
RNA+引物+水
可选：变性
10min 65°C
冰上配置多重RT反应混合液(除RNA模板)并分装到各反应管
添加模板RNA到每个反应管中
置于冰上，添加缓冲液，RNase Inhibitor，dNTPs，Transcriptor RT
锚定oligo(dT)18引物/特异性序列引物
30min 55°C或1h 50°C
六聚物随机引物
10min 25°C
30min 55°C或1h 50°C
85°C失活5min
添加1-5 μl至PCR体系或RT-PCR体系
准备
cDNA合成
图1：单一反应和多重反应中cDNA合成流程概述
①
•使用前先将所有冷冻试剂解冻。

•开始实验前将所有试剂轻度离心。

•实验开始后保持将所有试剂置于冰上。

②
将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20 μl反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。

注意：进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。

模板-引物混合物(1次反应) 成分体积最终浓度
总RNA或
poly(A)+ mRNA
1 μg 总RNA或
10 ng poly(A)+ mRNA
引物- 以下任选其一：
Anchored-oligo(dT)18 Primer, 50 pmol/μl (瓶5)
1 μl
2.5 μM 或Random Hexamer Primer, 600 pmol/μl (瓶6)
2 μl
60 μM
或Sequence-Specific Primer
可变
0.5-2.5 μM
Water, PCR-grade (瓶7或9)
可变
使总体积为13 μl
总体积
13 μl
以上为初实验的建议浓度。

为了得到合适的模板浓度，需要使总RNA的量在10 ng到5 μg之间，使mRNA的量在1 ng到100ng之间。

注意：当RNA样本浓度较低(< 10 μg/ml)时，添加10 μg/ml MS2 RNA*以使RNA模板稳定。

③
可选步骤：
•在65°C条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性。

此步骤可确保RNA二级结构变性。

•立即将反应管置于冰上冷却。

④
在含有模板-引物混合物的反应管中加入下表中其余的RT反应液组分。

成分体积最终浓度
Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5×(瓶2)
4 μl
1×
(8 mM MgCl2)
Protector RNase Inhibitor,
40 U/μl(瓶3)
0.5 μl
20 U
Deoxynucleotide Mix,
每种dNTP各10 mM(瓶4)
2 μl
每种dNTP各1 mM
Transcriptor Reverse Transcriptase,
20 U/μl(瓶1)
0.5 μl
10 U
最终体积
20 μl
⑤
•在反应管中将试剂小心混匀。

注意：不要旋涡！
•将反应管轻度离心使样本收集于反应管底部。

•反应时使用带热盖的加热模块，防止反应管中的液体挥发。

⑥
根据您所使用的引物以及目标mRNA的长度，RT反应孵育时间参考下表：使用的引物目标mRNA的长度RT反应孵育时间
Anchored-oligo(dT)18 Primer, 50 pmol/μl 或Sequence-Specific Primer
不超过4 kb
55°C下30min
超过4 kb
50°C下60min
Random Hexamer Primer, 600 pmol/μl
不超过4 kb
25°C下10min，
之后55°C下30min
超过4 kb
25°C下10min，
之后50°C下60min
⑦
•加热至85°C维持5min使Transcriptor Reverse Transcriptase失活。

•将反应管置于冰上以终止反应。

•反应管在+2~+8°C下可保存1-2小时，在-15~-25°C下可保存更长时间。

⑧
此cDNA产物无需经过纯化即可用于PCR反应。

•一般来说，使用1-5 μl 第一链cDNA作为模板加入PCR体系中。

若是最初的实验，可尝试在50 μl PCR体系中使用2 μl cDNA作为模板。

•如果在LightCycler System上进行PCR，在20 μl 的反应体系中使用2-5 μl cDNA或cDNA 稀释液。

注意：逆转录反应工作液中MgCl2的最终浓度为8 mM，因此PCR反应混合液中每μl 的cDNA 反应液模板带入了8 nmol MgCl2,根据实际需要优化反应液中的MgCl2浓度。

Transcriptor Reverse Transcriptase具有RNaseH活性。

在cDNA合成结束后RNaseH可除去RNA模板，这使得PCR引物更容易与cDNA结合，在某些情况下，这会提高PCR反应的灵敏度。

流程B：使用锚定oligo(dT)18引物和六聚物随机引物合成cDNA。

以下描述的条件适用于两步法RT-PCR的第一链cDNA合成。

①
•使用前先将所有冷冻试剂解冻。

•开始实验前将所有试剂轻度离心。

•实验开始后保持将所有试剂置于冰上。

②
将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20 μl反应体系为例，按照以下组分准备模板-引物混合物。

注意：进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。

模板-引物混合物(1次反应) 成分体积最终浓度
总RNA或
poly(A)+ mRNA
1 μg 总RNA或
10 ng poly(A)+ mRNA
Anchored-oligo(dT)18 Primer,
50 pmol/μl (瓶5)
1 μl
2.5 μM 和Random Hexamer Primer,
2 μl
60 μM
600 pmol/μl (瓶6)
Water, PCR-grade (瓶7或9)
可变
使总体积为13 μl
总体积
13 μl
以上为初实验的建议浓度。

为了得到合适的模板浓度，需要使总RNA的量在10 ng到5 μg之间，使mRNA的量在1 ng到100ng之间。

注意：当RNA样本浓度较低(< 10 μg/ml)时，添加10 μg/ml MS2 RNA*以使RNA模板稳定。

③
可选步骤：
•在65°C条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性。

此步骤可确保RNA二级结构变性。

•立即将反应管置于冰上冷却。

④
在含有模板-引物混合物的试管中加入下表中其余的RT反应液组分：成分体积最终浓度Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5×(瓶2)
4 μl
1×
(8 mM MgCl2)
Protector RNase Inhibitor,
40 U/μl(瓶3)
0.5 μl
20 U
Deoxynucleotide Mix,
每种dNTP各10 mM (瓶4)
2 μl
每种dNTP各1 mM/
Transcriptor Rerverse Transcriptase,
20 U/μl(瓶1)
0.5 μl
10 U
最终体积
20 μl
⑤
•在反应管中将试剂小心混匀。

注意：不要旋涡！
•将试管轻度离心使样本收集于反应管底部。

•反应时使用带热盖的加热模块，防止反应管中的液体挥发。

⑥
根据您所使用的引物以及目标mRNA的长度，RT反应孵育时间参考下表：使用的引物目标mRNA的长度RT反应孵育时间
Anchored-oligo(dT)18 Primer,
50 pmol/μl 和Random Hexamer Primer,600 pmol/μl
不超过4 kb
25°C下10min，
之后55°C下30min
超过4 kb
25°C下10min，
之后50°C下60min
⑦
•加热至85°C维持5min使逆转录酶失活。

•将反应管置于冰上以终止反应。

•反应管在+2~+8°C下可保存1-2小时，在-15~-25°C下可保存更长时间。

⑧
此cDNA产物无需经过纯化即可加入用于PCR反应。

•一般来说，使用1-5 μl 第一链cDNA作为模板加入PCR体系中。

若是最初的实验，可尝试在50 μl PCR体系中使用2 μl cDNA作为模板。

•如果在LightCycler System上进行PCR，在20 μl 的反应体系中使用2-5 μl cDNA或cDNA
稀释液。

注意：逆转录反应工作液中MgCl2的最终浓度为8 mM。

因此PCR反应混合液中每μl 的cDNA 反应液模板带入了8 nmol MgCl2,根据实际需要优化反应液中的MgCl2浓度。

Transcriptor Reverse Transcriptase具有RNaseH活性。

在cDNA合成结束后RNaseH可除去RNA模板，这使得PCR引物更容易与cDNA结合，在某些情况下，这会提高PCR反应的灵敏度。

2.3 对照反应
cDNA合成
目录号为***********的产品提供的对照反应包括Control RNA的逆转录，以及后续的在常规热循环仪或LightCycler仪器上进行的扩增检测151bp的PBGD片段的PCR反应。

以下为两步法RT-PCR对照实验中第一链cDNA合成的条件。

注意：实验开始前应将热循环仪预热至RT反应的温度(步骤4)。

①
•使用前先将所有冷冻试剂解冻。

•开始实验前将所有试剂轻度离心。

•实验开始后保持将所有反应剂置于冰上。

②
将无菌、无核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，按照以下成分准备含模板-引物混合物的20 μl 反应体系。

注意：进行与RNA相关的操作时请保持配戴手套。

模板-引物混合物(1次反应) 成分体积最终浓度
Control RNA
2 μl
100 ng
Anchored-oligo(dT)18 Primer,
50 pmol/μl (瓶5)
1 μl
2.5 μM
Water, PCR-grade
10 μl
使总体积为13 μl
总体积
13 μl
③
添加以下成分成分体积最终浓度
Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer, 5×(瓶2)
4 μl
1×
(8 mM MgCl2)
Protector RNase Inhibitor,
40 U/μl(瓶3)
0.5 μl
20 U
Deoxynucleotide Mix,
每种dNTP各10 mM(瓶4)
每种dNTP各1 mM
Transcriptor Reverse Transcriptase
20 U/μl(瓶1)
0.5 μl
10 U
最终体积
20 μl
•吹打混匀。

•用微量离心机轻度离心。

④
55°C下孵育30min
⑤
•加热至85°C维持5min使逆转录酶失活。

•将反应管置于冰上以终止反应。

⑥
•反应管在+2~+8°C下可储存1-2小时，在-15~-25°C下可储存更长时间。

PBGD PCR
实验得到的单链cDNA可利用提供的PBGD特异性引物通过聚合酶链式反应进行扩增。

这个过程可以利用常规热循环仪或LightCycler仪器完成。

•在PCR反应体系为50 μl的常规热循环反应(使用FastStart Taq DNA Polymerase*)中加入5 μl cDNA反应液。

•采用LightCycler 1.5 System或LightCycler2.0 System进行的反应总体积为20 μl的real-time PCR (使用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I*)中加入2 μl cDNA反应液。

•采用LightCycler 480 System进行的反应总体积为20 μl的real-time PCR (使用LightCycler 480 SYBR Green I Master*)中加入2 μl cDNA反应液。

想要了解更多PCR或real-time PCR的更多具体信息，请阅读FastStart Taq DNA Polymerase*、LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green*、LightCycler 480 SYBR Green I Master*相关使用说明。

常规热循环仪PCR
根据以下流程准备50 μl标准反应体系。

在做RT对照反应管之余，以水替代cDNA模板加入反应体系作为阴性对照。

①
•使用前先将所有冷冻试剂解冻。

•开始实验前将所有试剂轻度离心。

•实验开始后保持将所有试剂置于冰上。

②
将薄管壁的PCR管置于冰上，配置50 μl的PCR反应体系,在同一反应管中依次加入下表中各个组分。

成分体积最终浓度
含20 mM MgCl2 的FastStart Buffer(10×)
5 μl
1×
PCR Nucleotide Mix*(10 mM)
0.2 mM
Control Primer MIX PBGD(5 μM)
2 μl
0.2 μM
cDNA from Control RT Reaction
5 μl
FastStart Taq DNA Polymerase*(5 U/μl)
0.4 μl
2 U
Water, PCR-grade
36.6 μl
总体积
50 μl
③
在带有热盖的热循环系统中进行PCR或在反应体系上覆盖30 μl矿物油（如果热循环系统不带热盖）：
1个循环
预变性
94°C
5min
35个循环
变性
退火
94°C
50°C
10s
20s
延长
72°C
30s
1个循环
最终延长
冷却
72°C
4°C
7min
④
取15 μl于3%琼脂糖凝胶上进行电泳。