兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养体会

兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养体会
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨进行性退变病变慢性疾病，近些年发病率在不断增高。

基础研究主要有各种原因引起的细胞数量过少而无法开展下去。

在建立动物模型的基础上更有效的提取软骨细胞、体外培养对基础研究做出最基本铺垫，为临床治疗提供更有效的理论依据。

本文通过软骨的提取、软骨的消化、细胞的收集、培养、鉴定，结合国内外文献做一综述。

标签：骨关节炎；软骨细胞；体外培养
软骨组织﹙cartilage）由软骨细胞﹙chondrocyte）和细胞外基质﹙extracellularmatrix，ECM﹚构成，软骨细胞是关节软骨主要构成成分，主要功能是合成、分泌软骨基质，维持软骨组织新陈代谢，是软骨破坏过程中的靶细胞，因此软骨细胞的体外培养是研究关节软骨生理及病理的常用体外实验模型，尤其是骨关节炎软骨细胞的提取在研究治疗骨关节炎、最基本最关键的一步[1]。

自从1967年Manning[2]采用胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法获得了高纯度的软骨细胞以来，为了获得数量较多的软骨细胞，软骨细胞的提取、培养、传代、鉴定，等不断改进。

但不同的动物，不同的模型对软骨细胞的提取也有一定的不同。

本文通过对兔膝骨关节炎造模成功后提取软骨细胞进行培养、传代、鉴定进一步认识兔膝骨关节炎软骨细胞体外培养的要点及关键问题等。

1软骨的提取
将实验兔用空气栓塞法处死，沿右膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出以膝关节为中心约6 cm×6 cm的区域，浸泡于75%的酒精中20～30 min，放入超净台中打开膝关节腔，无菌条件下用11号刀片（带柄）削取膝關节股骨髁和胫骨平台软骨组织，将获得关节软骨组织，置入盛有含青霉素钠/链霉素双抗液（1×1010U/L）的D-hanks液的无菌平皿中，用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks 液10 mL漂洗3遍，用眼科剪将软骨组织剪成1mm3小块，见图1，然后再用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks液10 mL漂洗3遍。

在软骨的提取过程中首先必须在无菌的条件下打开关节削取软骨，我们总会最大量的削取更多的软骨使得提取更多软骨细胞，但更要主要的是①避免削取软骨以外的组织，避免细胞提取还有其他组织细胞；②削取软骨时不要削的太厚，可以一层层的削，这样可以有助于软骨的消化；③削取完后软骨组织必须剪成1 m3小块，有助于软骨的消化，用缓冲液多清洗几遍更好地去除血液、脂肪组织等其他组织。

2软骨的消化
用0.25%胰蛋白酶先消化30～35 min，用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks 液10 mL漂洗3遍；加入0.2%Ⅱ型胶原酶（DMEM配制），置于37℃，体积分数5%CO2培养箱中培养消化100 min，每30 min置37℃恒温振荡箱振荡5 min。

后抽取上清液用200目不锈钢筛网过滤入离心管，800 r/min离心4min弃上清，用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks液洗两遍每次800 r/min离心4min弃上清去除胶原酶。

加入含12%胎牛血清DMEM 3 mL。

用枪轻轻吹打可获得单个软骨细胞悬液。

将软骨细胞按1×105/L浓度接种于10 mL培养皿中，置于37℃，体积分数5%CO2培养箱中培养。

培养皿中剩余的软骨加入1%Ⅱ型胶原酶（DMEM 配制）置于37℃，体积分数5%CO2培养箱中培养消化，每1 h置37℃恒温振荡箱振荡5 min。

倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，用200目不锈钢筛网过滤入离心管，800 r/min离心4 min弃上清，用含双抗液（1×109U/L）的D-hanks液洗2遍800 r/min/次，离心4 min弃上清去除胶原酶。

加入含12%胎牛血清DMEM 3 mL。

用枪轻轻吹打可获得单个软骨细胞悬液。

将软骨细胞按1×105/L浓度接种于10 mL培养皿中，置于37℃，体积分数5%CO2培养箱中培养。

待细胞贴壁达到85%～90%后传代。

很多文献中软骨细胞消化都在3～6 h，然而软骨细胞的消化时间要大大缩短，这也是兔膝骨关节炎模型的一个弊端，因为兔子的软骨细胞消化时间过长越长细胞损伤越厉害，虽然有时我们在细胞计数时看到的都是活细胞，但放到培养瓶里样上两天基本上没有贴壁的，软骨细胞也是一种群居生活的物种，贴壁细胞越少增值能力越低。

3细胞的传代及培养
软骨细胞培养方法很多，包括单层培养法、三维培养法、离心管培养法、生物反应器等。

其中单层培养法、三维培养法用的比较多，因三维培养法需要付出昂贵的费用本实验采用单层培养法来培养兔膝骨关节炎软骨细胞。

软骨细胞呈贴壁生长后，随传代次数增加，软骨细胞发生去分化现象，限制了软骨细胞的大量扩增。

其中应该注意的是提取软骨细胞时应用含12%～13%FBS培养基进行培养，从第二代细胞开始改用含10%FBS培养基进行培养，每3 d换液1次，细胞融合并覆盖瓶底>80%时，用0.25%胰蛋白酶﹙含0.02%EDTA﹚消化，进行传代培养。

主要是因为开始时用含12%～13%FBS培养基进行培养是因为可以使细胞更容易贴壁，而后改为含10% FBS培养基进行培养是为了防止细胞早期就会出现”去分化”现象。

实验一般选用第三第四代细胞，其活性与增值能力最强。

细胞传代时应注意的是胰蛋白酶消化时间不要过程，室温一般30～60 s或用0.1%的胰蛋白酶。

尽可能的减少细胞的损失。

细胞离心600转5 min，用枪吹打细胞时用力不要过猛。

传代后细胞损伤严重时主要表现是细胞增值能力下降或出现”去分化”现象，细胞的”去分化”现象主要表现在细胞的形态与分泌，细胞从多呈三角形、长梭形或多角形向圆形改变，分泌的Ⅱ型胶原以及蛋白多糖减少。

5细胞的鉴定
5.1软骨细胞形态学观察在倒置显微镜下观察，刚接种的软骨细胞呈球形，24～48 h后开始贴壁生长，细胞多呈三角形、长梭形或多角形，72 h后细胞开始增殖，单层生长，彼此不相接触。

细胞增长至爬满瓶底时软骨细胞可变为圆形，胞体丰满，胞浆均匀，核大而圆并且互相连接成”铺路石”样结构。

苏木精-伊红
染色苏木精-伊红染色可见软骨细胞呈三角形或多角形，细胞核呈紫蓝色，可见明显的双核仁或多核仁形态，细胞基质红染，胞浆及细胞周围有紫红色或红色异染出现[3]。

5.2Ⅱ型胶原蛋白Ⅱ型胶原的合成和分泌是软骨细胞维持其分化表型的特征性指标，可通过Ⅱ型胶原免疫荧光染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色来鉴定。

Ⅱ型胶原免疫荧光染色﹙异硫氰酸荧光素FITC﹚可见胞浆和胞膜呈清晰绿色荧光，细胞核区域未见明显绿色荧光，证明软骨细胞特征性Ⅱ型胶原主要分布在胞浆和细胞膜上。

Ⅱ型胶原免疫组化染色可见软骨细胞胞浆被染成棕黄色，胞核不着色，胞外基质中也有棕黄色颗粒出现[4]。

5.3蛋白聚糖蛋白聚糖是软骨细胞分泌的基质成分，是软骨细胞功能的主要指标，可通过甲苯胺兰染色和阿利新蓝﹙Alcianblue﹚染色进行鉴定。

甲苯胺兰染色可见软骨细胞呈紫蓝色，细胞基质呈蓝色，软骨细胞内及细胞周围有蓝紫色异染颗粒；阿利新蓝染色可见软骨细胞胞浆和胞膜呈深蓝色，证明培养软骨细胞分泌和合成蛋白聚糖[5]。

5.4 IL-1，TNF-α、MMP-13在细胞内以及分泌表达在ELRSA试剂盒。

6展望
软骨是一种特殊类型的结缔组织，由软骨细胞、软骨基质和纤维构成。

软骨细胞的功能为合成细胞外基质大分子及各种酶类，而软骨细胞外基质主要有胶原和蛋白多糖聚集体组成。

胶原中有间质型胶原I、Ⅱ和Ⅲ，且Ⅱ型胶原为软骨细胞的基因表达产物可用来确定软骨细胞的表型[6]。

1965年Chesterman和Smith首次利用体外培养的软骨细胞修复松质骨和关节软骨缺损，近30年来软骨细胞体外培养在方法学上也取得了很大进展[7]。

软骨细胞经过培养所形成的结节样结构，具有关节软骨的生物学特征。

软骨细胞体外培养的方法是从细胞水平来探索关节软骨生物学特性，为研究关节软骨疾病的发病原理及其治疗方法（包括药物治疗）提供了有效而简便的方法。

以细胞体外培养技术为基础，在体外将软骨细胞进行定向诱导分化，调节细胞的增殖及凋亡等方面的研究，有助于研究治疗某些退行性疾病的药物，因此具有广阔的应用前景。

因骨性关节炎软骨细胞处于退变期，细胞周期较正常软骨细胞周期要短，其可能原因：骨性关节炎软骨细胞为变性软骨细胞，细胞功能的改变可能影响细胞周期的变化[8]。

损伤的骨性关节炎软骨中，软骨细胞代谢活跃，相伴随的细胞分泌的各种胞外基质也相应高表达，软骨代谢的异常，导致胞外基质成分的异常，软骨细胞生存环境改变促使软骨细胞过早的死亡，加剧骨性关节炎的进程；骨性关节炎软骨细胞中混杂有纤维软骨细胞，纤维软骨细胞增殖速度明显较软骨细胞快，必将影响细胞周期的变化[9-10]。

体外培养软骨细胞是研究软骨分化、增殖以及软骨病变的一种常用模型，也是软骨组织工程的基础。

目前体外软骨细胞的培养技术已经日渐成熟，可从许多动物及人的不同软骨组织中分离培养软骨细胞，但是软骨细胞的体外培养方法均
存在一定的局限性，培养条件还有待进一步完善。

另外，软骨细胞分化、增殖过程中受到多种调控因子的调控，其相互作用机制复杂，对软骨细胞体外培养的影响还有待进一步的深入研究。

参考文献：
[1]陈百成，张静.骨关节炎[M].北京：人民卫生出版社，2004：175-178.
[2]Manning WK，Bonner WM. Isolation and culture of chondrocytes from human adult articular cartilage [J]. Arthritis Rheum，1967，10（3）：235-259.
[3]Tew SR，Peffers MJ，McKay TR，et al. Hyperosmolarity regulates SOX9 mRNA posttranscriptionally in human articular chondrocytes [J]. Am J Physiol Cell Physiol. 2009，297（4）：898-906.
[4]Qusous A，Parker E，Geewan C，Kapasi A，et al. Novel methods for the quantification of changes in actin organization in chondrocytes using fluorescent imaging and linear profiling [J].Microsc Res Tech. 2012，75（7）：991-999.
[5]Stumm M，Boger E，Gaissmaier CG，et al. Genomic chondrocyte culture profiling by array-CGH，interphase-FISH and RT-PCR [J]. Osteoarthritis Cartilage. 2012，20（9）：1039-45.
[6]Gr？ssel S，Rickert M，Opolka A，et al. Coculture between periosteal explants and articular chondrocytes induces expression of TGF-beta1 and collagen I [J]. Rheumatology （Oxford）. 2010，49（2）：218-230.
[7]Sato M，Shin-ya K，Lee JI，et al. Human telomerase reverse transcriptase and glucose-regulated protein 78 increase the life span of articular chondrocytes and their repair potential [J]. BMC Musculoskelet Disord. 2012，2；13：51.
[8]Musumeci G，Loreto C，Carnazza ML，et al. OA cartilage derived chondrocytes encapsulated in poly（ethylene glycol）diacrylate （PEGDA）for the evaluation of cartilage restoration and apoptosis in an in vitro model [J]. Histol Histopathol. 2011，26（10）：1265-1278.
[9]Krawczak DA，Westendorf JJ，Carlson CS，et al. Influence of bone morphogenetic protein-2 on the extracellular matrix，material properties，ndgene expression of long-term articular chondrocyte cultures：loss of chondrocyte stability [J]. Tissue Eng Part A. 2009，15（6）：1247-55.
[10]Yu SM，Kim HA，Kim SJ. 2-Deoxy-D-glucose regulates dedifferentiation through beta-catenin pathway in rabbit articular chondrocytes [J]. Exp Mol Med. 2010，31；42（7）：503-13.
編辑/张燕。