植物组织培养学论文

Liaoning Normal University
（20--级）
植物组织培养
题目：果树组培研究进展
学院：----学院
姓名：----
20--年--月
果树组培研究进展
摘要:
基于组培苗的植物微嫁接技术广泛地应用于果树学的各项研究中。

本文探讨了组培苗微嫁接技术在果树中的主要应用，以为今后的转基因及育种工作提供参考。

关键词:果树组织培养应用
生物技术在社会科技进步中发挥着越来越重要的作用，而组织培养技术则是生物技术的基本手段【1】。

植物组织培养是对细胞、组织的生长、分化及器官形态建成的规律进行研究的手段，它有力地推动了植物生理学、生物化学、遗传学、细胞学、形态学和农林等各类学科的发展和相互渗透【2】。

主要作用在于保存和交换珍稀濒危植物种质资源；加速世代繁殖，缩短育种周期，获得新基因型；促进幼胚发育，克服远缘杂交中的不亲和不育性等【3】
植物组织培养指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养或试管培养【4】。

近年来其在果树育种上的应用取得了较大进展，尤其在优良树种的快速繁育、种质保存和品种选育等许多领域得到了广泛应用，显示出巨大的潜力。

19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活；1902年，德国植物学家哈伯兰特细胞全能性的理论是植物组培的理论基础。

【5】1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。

植物组培的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。

植物组培的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。

不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。

在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。

【6】
1组织培养快速繁殖技术
1．1组培快繁技术研究
植物快速繁殖研究可以追溯20世纪40年代。

我国学者罗士韦(S，W，LO0)于1946年在国际上最早研究植物的茎尖培养，他建立了一种合成培养基上连续培养石刁柏(Asparagus officinalis)茎尖的方法。

继罗士韦之后。

Ball于1946 年使长度仅有40～601~m带有1～2个叶原基的羽扇豆属(Lupinus albus Linn)和旱金莲属(Tropaeolum L)的幼小茎尖分生组织进入到分生细胞的内部。

基于这一事实，1952年 Morel和Marti n从已经被病毒感染的大丽花(Dahlia)植株的茎尖分生组织培养出无病毒植株。

后来Morel(1960)又利用茎尖培养获得无病毒的观赏兰花，建立通过原球茎尖继代培养周年生产兰花试管苗的方法，并且指出在一年之内从一个兰花的茎尖有可能生产出上百万的试管苗。

此后在法国等欧美国家出现了一茎尖培养为基础的兰花、马铃薯和草莓等植物的脱毒试管苗工厂。

【7】
1．2快繁技术在果树上的应用
植物快速繁殖可以在以下几个方面应用：①杂合植物材料的大量繁殖。

许多优良的观赏植物和
经济植物的所谓“品种”都是杂种，一旦有性繁殖，由于后代分离而不能得到性状均一的后代，通过快速繁殖能够保持杂合性，并且大量生产性状均一的商品苗；②脱病毒种苗生产。

长时期营养繁殖的农作物和果树，例如马铃薯、甘薯、草莓、苹果和香蕉等往往感染和积累了许多病毒，通过茎尖培养可以脱除病毒，并进行无毒苗的大量生产；③加速繁殖数量有限的特殊种质材料。

例如刚刚引进或培育的新品种，木本植物的优选单株，珍惜濒危植物，以及有性和无性繁殖能力低的植物种类等；④单独繁殖雄株或雌株。

例如杨树的雄株不会产生令人生厌的“杨絮”(带毛的种子)，可以专门挑选雄性植物进行繁殖和种苗生产。

【8】
1)香蕉：它是目前试管苗生产数量最多的作物。

20世纪80年代初华南植物研究所从国外引进香蕉无病毒种苗，建立了快速繁殖技术然后与地方合作在广东新会和顺德建立了两个年产百万株试管苗的工厂。

新会的试管苗厂扩建后，目前的年生产能力达到2000万株。

同时对香蕉的主要病害香蕉花叶病(BaMD)和束顶病(BBTD)进行了研究。

花叶病的抗血清的制备和酶联免疫检测已经完成和应用，束顶病的病因正在研究之中。

2)草莓：经茎尖和花植株药培养脱除病毒，用小叶嫁接法进行指示植物鉴定，得到l0多个品种的无病毒植株，已在主产区逐步推广。

3)柑桔及其砧木：经过多年的努力，改进了微嫁接(micrografting)技术和指示植物鉴定，得到了去除黄龙病(YSO)和裂皮病(CEN)病原菌的主要栽培品种和砧木的无病植株，在湖北、四川和湖南等省建立了多个无病母本园。

无病柑桔种苗已在生产中大量使用。

表现为生长健壮，结果提早，质量改善，产量提高。

黄龙病和裂皮病的血清学检测方法正在研究之中。

4)苹果及其砧木：中国科学院植物研究所陈维伦等在我国首先建立了苹果的茎尖培养技术。

已经查明苹果产区的主要危害病毒为苹果花叶病毒(AMV)、锈果病毒 (病原体为类病毒和MLO)、绿皱果病毒(ASPV )、褪绿叶斑病毒(ACLSV)、茎沟病毒(AS ．G V)和茎痘病毒(A S PV)(后三者为潜隐性病毒)通过热处理和茎尖培养得到了大部分主要栽培品种和营养系砧木 (EM7，9，26，MM106)的无以上6种病毒的植株。

病毒鉴定使用了改进的指示植物法，使检测的时间大为缩短。

褪绿叶斑病毒和茎沟病毒的血清学检测法也已完成。

苹果病毒的主要传染途径是通过嫁接，与昆虫有关，因此无病母本园和无病毒植株的生产比较简单，推广应用极为迅速。

无病毒苹果试管生产集中于河北昌黎、山东临朐、辽宁熊岳等地，年产100万苗以上。

5)葡萄：推广热处理和茎尖培养及指示植物鉴定，目前已得到了2 0多个品种的去除了葡萄扇叶病毒(GFV)、卷叶病毒(GRLV)、栓皮病毒(GCBV)和茎痘病毒(GSPV)的无病毒植株。

GFV和GRKV的ELISA检测已经建立和应用。

甘肃农业大学曹孜义等发展了较为完善的葡萄试管苗生产工艺，建立了第一个无病毒葡萄母本园。

近年来由于葡萄酒产业兴盛，对优质葡萄种苗的需求量急剧增加，带动了葡萄快速繁殖产业。

目前。

全国已有100多个单位从事葡萄试管苗生产，累计生产苗木500万株以上。

2 胚胎培养和胚乳培养
2．1胚胎培养的研究及应用
Hannig(1904年)最先实验了幼胚的离体培养，他将萝卜属(Raphanus)和辣根菜属(Cochlea ria)植物的未成熟胚培养在含有糖、无机盐、氨基酸和植物提取物的培养基中，使幼胚发育成正常的成熟胚。

Laibach(1925年)在无菌条件下从亚麻属的种间杂交形成的不能正常发育的种子中剥出未成熟的杂种胚，在含有10％～1 5％蔗糖的人工培养基，使它们发育至成熟，并产生杂种植株，从而第一次证明，利用幼胚离体培养可以挽救在自然情况下败育的杂种胚。

此后胚胎培养被育种专家们广泛用于各类植物的远缘杂交研究，因此可以说，20世纪20年代建立的幼胚培养和胚胎拯救(embryo rescue)技术是最先付诸应用的植物细胞工程技术。

【9】
胚胎培养的应用:
①拯救杂种胚获得稀有杂种；
②单倍体的产生；
③缩短育种周期；
④稀有植物的繁殖。

在果树上，通过胚离体培养技术可以解决如下问题：
1)抢救早期退化胚及进行早熟、无籽品种类型的育种。

一些果树种类，如桃、油桃、李子、杏、樱桃、锷梨等的早熟品种。

由于发育时期太短，胚往往难以发育成熟。

无籽葡萄经济价值较高，但大多为假单性结实，即合子胚早期育败。

早熟葡萄类型尤为明显。

现成功的报道有无籽葡萄品种
Youngle在花后27～33d胚开始败育。

通过早期剥离幼胚进行获得成功；Sunlite油桃花后胚球进行离体培养也获得成功；小果野蕉是栽培香蕉的近缘种。

种子不发芽。

通过早期培养可生出植株，为育种奠定基础。

利用胚离体培养技术，使特早熟桃与特早熟桃杂交。

培养特早熟桃类型也取得了很大进展。

已育出一些商业价值极高的早熟和极早熟品种，如早熟桃“春雷”、“金冠”，早熟油桃“五月火”和极早熟桃品种“早霞露”等。

2)近代育种中，采用异种和异属的远缘杂交，把野生种有价值基因转移到栽培种中是果树育种的一项重要技术。

远缘杂交由于亲缘关系较远，远缘杂交的杂种胚、胚乳和子房组织之间缺乏协调性，致使杂种胚部分或全部坏死，有时受精后的幼胚不发育或中途停止发育，难以获得杂种苗。

例如，用含V c较低(80～lOOmg／100 g)等美味猕猴桃品种海沃德与Vc含量高(1OlOmg／100g)的野生猕猴桃品种毛花猕猴桃杂交，成熟种子有50％退化；而采用胚培养，有65％胚可以抢救成活，可以克服远缘杂交亲和性差的问题。

3)在柑橘上可以通过胚胎抢救培养进行三倍体育种和获得柑橘无病毒苗。

三倍体柑橘无籽、果大、抗性好，是柑橘育种中的热点之一，但杂交的合子胚有早期退化的现象，因此必须结合胚抢救才能达到三倍体育种的目的。

2．2 胚乳培养的研究及应用
在国外研究者热衷于被子植物胚胎培养的同时，我国学者开创了裸子植物的胚胎培养。

1934年清华大学的李继侗和沈同报道了人工培养上培养银杏(Gink．gobiloba)胚胎的研究结果。

他们发现银杏的胚乳提取物可以刺激离体胚的生长，首次证明胚乳中可能存在某种促进胚胎生长的物质。

这一结果启发了Van Over．beek后来的研究，他们在1941年发现椰乳(椰子的液体胚乳)对于离体培养的曼佗罗(Datura)幼胚的生长和发育有显著的促进作用,使心形胚或更幼小的胚能够存活。

【10】椰乳的应用使各类植物的幼胚培养相继获得成功。

罗士韦和王伏松也是裸子植物胚胎培养的先驱，他们于1943年在Science上发表论文，报道了云南松 (P inus yunnanensis)和云南杉(Ketdeefia evelyniana)的由几个细胞组成的幼胚的离体培养获得成功。

王伏雄在20世纪50～6O年代与钱南芬等合作在油松和杂种桃的离体培养上也做出了重要的应用研究成果。

【11】目前幼胚培养技术已被广泛地用于我国的农作物育种工作。

3体细胞胚胎发生和人工种子
3．1 体细胞胚胎发生的研究及应用
从体细胞产生胚状体的过程叫做体细胞胚胎发生(Somatic embryogenesis)。

在自然界体细胞胚胎发生的例子是柑橘属的植物可以从胚珠的珠心组织长生许多瞩心胚。

Steward(1958年)和Reinert(1958年，1959年) 首次发现可以从胡萝卜的体细胞离体培养物诱导产生胚或胚状体(embryoid)，也被成为体细胞胚(somatic embryo)或不定胚(adventitious embryo)。

据不完全统计，能够通过体细胞胚胎发生途径从植物组织培养物诱导胚状体发生的植物种类在150种以上，分布于40多个科，其中包括被子植物几乎所有重要的科和一些裸子植物，这表明胚状体发生在高等植物中是一个普遍的现象。

在被子植物上，不仅能够从孢子体的根、茎、叶、花、果实等器官的组织培养物诱导产生二倍体的胚状体，还能从花粉、助细胞和反足细胞产生单倍性胚状体，以及从胚乳诱导三倍性的胚状体。

目前，果树的体胚发生研究虽然有了较大进展，但仍有不少问题需要解决。

例如，大量高质量和高同步化体胚产生的培养条件、体胚转换率的提高、体胚发生的遗传稳定性的控制以及体胚发生的分子机理等方面
的研究还不够深入。

今后，应对体胚发生的分子机理及生理生化机制、建立体胚发生的优化系统，提高体胚转换率这几方面进行重点研究，彻底了解体胚发生的本质规律，促进体胚发生研究成果在生产实践中的应用。

3．2人工种子的研究进展
将植物组织培养产生的胚状体包裹上用有机化合物和营养物质制作的人工种皮，即成为人工种子(artifitieial seeds)。

Redenbaugh等(1986年)首次报道了用藻酸钙包裹制成的苜蓿和芹菜的人工种子，他们称之为体细胞种子(somatic seeds) 。

近年来人工种子包
裹技术(Patel等，2002年)和人工种子的冰冻保存技术( Martinez等，1999年)均有显著的改进，并且报道了利用芒果 (Ara等，1999年)和菠萝(Soneji等，2002年)的体细胞胚制成了具有较高萌发率的人工种子。

4体细胞无性系变异
经过组织培养循环出现的再生植株的变异称为体细胞无性系变异。

日本的Wakasa(1979年)以无刺卡因种Mitsubishi品系为材料，从冠芽、裔芽和果实诱导出团状愈伤组织，经7～14个月的继代培养，再生出850个无性系。

其中从果实再生的104株全部表现不同程度的变异，从裔芽再生的136株98％表现变异，来自冠芽的29株7％变异，来自腋芽的110株34％变异。

变异的性状包括刺的多少、叶片颜色、蜡质的多少和叶簇密度等。

这些变异体的变异性状在2年的生长期内保持不变，说明是稳定而不受环境影响的。

作者认为变异的原因可能有二：一是外植体中细胞之间存在遗传上的差异；二是在培养过程中发生染色体重组。

果树体细胞无性系变异研究始于20世纪70年代。

1979年Wakasa首次报道了菠萝组培苗中存在着无性系变异的现象。

随后在香蕉、柑橘、草莓等组织培养再生植株中均观察到无性系变异的存在。

迄今为止约有7科14属25种或品种的果树组培苗中存在不同程度的体细胞无性系变异，如漆树科的芒果，凤梨科的菠萝，芭蕉科的芭蕉，木犀科的油橄榄，薇科的草莓、苹果、李子、桃、梨、悬钩子，芸香科的柠檬、来母、甜橙、枳、枳橙，猕猴桃科的猕猴桃葡萄科的葡萄等。

针对果树常规育种及其细胞培养的现状，利用其培养过程中所产生的体细胞无性系，并加以人工定向选择，已经取得了一定的进展。

由于果树遗传上的特殊性，变异后代的遗传分析需要更长的时间投入，这也是果树常规育种同样要面临的难题。

因此，对某些由单一基因控制的果树性状利用其体细胞无性系选择的手段进行遗传改良应该是能在近期内就能达到；对果树那些由多基因控制性状的遗传改良，可通过长期的选择与鉴定来获得。

只要采用长短结合的方针，对所能产生的体细胞无性系变异进行多目标的、广泛的定向选择和长期跟踪鉴定，是完全能够创造一些具有优良性状的果树新种质的。

5单倍体的诱导与单倍体育种
1921年意大利植物学家在自然界中发现曼佗罗的单倍体植株，人们就设想利用加倍单倍体来产生纯系，已达到迅速稳定杂种，加快常规育种的目的。

但是自然发生的单倍体出现频率极低，因此很难用于育种实践。

为了大量体消除法和花药与花粉培养法，后两种方法是主要的方法。

获得单倍体，发展了多种人工诱导单倍体的方法，目前产生单倍体主要的方法有诱导孤雌生殖法、半配合法、染色花粉和花药培养主要用于获得单倍体，经染色体组加倍以后得到纯系，可以缩短获得纯系的时间，便于研究遗传规律。

提高选育效率，解决多年生杂合果树育种中存在的难题。

同时还可用于制造缺体和其他非整倍体，扩大遗传种质。

先后有苹果、葡萄、梨等树种成功的报道：
1)葡萄花培：邹昌杰，李佩芬获得了花培单倍体植株，他们以葡萄二倍体品种胜利的花药为试材，以改良B5为基本培养基，添加很低浓度的生长调节剂，产生的单倍体的愈伤组织具有植株的特征。

其表面不规则，见光后转绿。

根尖细胞显微镜检验证实其染色体数为单倍体。

2 ) 苹果花培：苹果花药培养工作国外从2O世纪60年代开始，由于苹果为年生木本植物，培养技较难，影响因素也较复杂，迄今国外尚未有苹果花药培养成为植株的报道。

国内从20世纪70年代开始进行苹果花药培养技术研究，先后得到了元帅、国光、赤阳、金冠、富士、新红星、红玉等8个品种的l3个株系的花培植株。

3)枣的花培：王震星等于1996年得到了金丝小枣花药培养的单倍体植株。

认为5月中旬至5月下旬采集的花药较易获得愈伤组织，且一定时间的低温处理愈伤组织诱导率显著高于未处理者以5摄氏度、5d愈伤组织诱导率最高，达49.6％,同时向培养基中添加一定浓度的生长素也是诱导愈伤组织所必须的，最佳诱导培养基为MS+2,4～D1.0 + NAA 0.4,6～BA主要用于诱导愈伤组织分化出了小植株，最适浓度为1.5～2.0，同IBA O.4—0.8配合时效果最佳，但仍存在所得植株中，单倍体植株数量小，在花药培养过程中何时分离单倍体细胞扩大繁殖及试管苗分化等问题，仍需进一步研究。

6原生质体培养和体细胞杂交
6．1 原生质体培养与体细胞杂交的研究进展
1960年Cocking采用酶发分离原生质体获得成功，提供了一种大量制备有活力的原生质体的方法，开创了植物原生质体培养和细胞杂交的研究领域。

1971年Nagata和Takcbc从培养的烟草叶肉细胞原生质体获得完整的再生植株，极大的推动了这方面的研究。

大约同一时期，原生质体培养和体细胞杂交也在英、日、德、美等国获得成功。

1972年中国科学院植物研究所的吴素萱和蔡起贵，遗传研究所的李向辉，以及植物研究所的夏镇澳、许智宏和卫志明等研究者分别开始进行原生质体培养的研究，此后我国在此方面取得很大进展。

迄今我国学者已经在5O多种植物上首次获得原生质体再生植株，并得到多种植物的细胞杂种。

6．2在果树上的应用
自20世纪60年代酶发分离原生质体取得成功以来，植物原生质体研究发展迅速，从1986年3个苹果基因型的叶肉原生质体经培养获得再生植株至今，已有l2种苹果基因型原生质体再生植株。

葡萄、桃、银杏等树种的原生质体培养也已再生出愈伤组织或胚状体。

国内学者从20世纪80年代开始研究，分别获得了苹果品种新红星、中华猕猴桃和美味猕猴桃、山杏及葡萄酿酒品种自诗南、梅郁的原生质体再生植株。

7超低温冷冻保存种质技术
超低温冷冻保存法是将离体培养的茎尖分生组织、愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体经冷冻保存剂二甲亚砜(DMSO)等处理后，送入-196℃液氮库进行超低温冷冻保存。

当需要时，可将上述培养物在3O～4O℃温度下迅速解冻，在满足原有培养条件下。

植物恢复分裂、分化和植株再生的能力。

把生长细胞冷冻起来然后再解冻，已能适用于许多植物不同的组织类型，包括愈伤组织培养体、悬浮培养体、生长点、花药、花粉、原生质体等，其存货冷冻都取得成功。

许多实验报道，愈伤组织培养体在一196℃下不加照料也能贮存几个月或可能几百年，而其代谢及遗传特性没有或完全没有变化。

经超低温保存后尚具备分化能力的植株种类有苹果、草莓、猕猴桃、杏等。

上述植物经保存后，可有大约50％～100％的茎尖分化成小植株。

低温冷冻保存为保存种质提出了诱人的前景。

8应用展望
目前，国内多数的嫁接绑缚材料为锡箔纸或铝箔纸。

而国外的一些研究则使用硅胶管作绑缚材料，优点在于能够及时观察到接口的愈合程度，及时排除死亡的植株，且操作便利【12】因此，绑缚材料也会不断更新。

在2006年召开的国家苹果育种研讨会上,山东农业大学束怀瑞院士建议并提出，利用中国特色的资源，重视远缘杂交，生物技术与常规技术结合，转基因育种仍然不能放松。

一直以来，转基因食品的安全性一直是一个争论焦点。

周瑞金等【13】的研究结果表明外源nptII基因只在转化植株体内表达，不通过嫁接在接穗和砧木间进行传导，说明其用做砧木时，对果实的食用是安全可行的。

果树的优势在于可以选用嫁接的繁殖方式，若能通过试验的方法来探讨目的基因在砧木和接穗之间的传递性，则就有可能解决食品安全性的难题，为今后的转基因育种开阔更广泛的空间，显然组织培养微嫁接技术将成为这方面研究的重点课题。

就植物组织培养而言，首先要扩大融合组合和树种范围，目前，果树原生质体融合主要集中在柑橘、猕猴桃、柿等树种上，而对苹果、桃、李等树种的研究相对较少。

苹果为我国北方大宗水果，砧木具有较强的区域性，通过细胞融合技术可望打破区域性界限，获得苹果上通用的新型砧木。

其次是开展果树非对称融合的研究，加大变异频率，有目的的转移，控制优良性状的胞质基因，提高育种效率。

另外还应注意对已获得的果树体细胞杂种进行深入研究，以便了解果树体细胞杂交过程中的核质遗传重组规律，以期待进一步指导果树生物工程育种的实践。

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