酶的综合性实验三

• 混匀，置 37 ℃水浴保温 15分钟，在510nm波长处比色，以空 混匀， 分钟， 波长处比色， 分钟 波长处比色 白管（ 管 调零，读取各管吸光度。根据各管吸光度计算其 白管（B管）调零，读取各管吸光度。根据各管吸光度计算其 血糖浓度，然后以时间为横坐标，以血糖浓度为纵坐标绘制葡 血糖浓度，然后以时间为横坐标，以血糖浓度为纵坐标绘制葡 萄糖耐量曲线。 萄糖耐量曲线。
引言
不主张作第三次OGTT试验。 试验。 不主张作第三次 试验
引言
• 空腹血糖损伤(Impaired Fasting Glucose, IFG)： 空腹血糖损伤( IFG) 空腹血糖≥6.1mmol/L, ≥6.1mmol/L,但 空腹血糖≥6.1mmol/L,但＜7.0mmo/L • 糖耐量受损(Impaired Glucose Tolerance, IGT)： 糖耐量受损( Tolerance, IGT) 餐后2h血糖＞7.8mmol/L,但＜11.1mmol/L 餐后2h血糖＞7.8mmol/L,但 2h血糖
绘制并分析a、 两组样品的葡萄糖耐量曲线 两组样品的葡萄糖耐量曲线。 绘制并分析 、b两组样品的葡萄糖耐量曲线。
参考值
• 正常糖耐量
–空腹血糖≤6.1mmol/L； 空腹血糖≤6.1mmol/L； 空腹血糖 –服糖30～60min达峰值,但峰值＜10mmol/L； 服糖30 达峰值, 服糖30～60min达峰值 但峰值＜10mmol/L； –服糖2h后血糖降至空腹血糖水平； 服糖2h后血糖降至空腹血糖水平； 服糖2h后血糖降至空腹血糖水平 –尿糖(-) 尿糖( 尿糖
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 葡萄糖 磷酸脱氢酶
NADPH在340nm有吸收峰，其吸光度增加与标本中的葡萄糖浓度成正比。 在 有吸收峰， 有吸收峰 其吸光度增加与标本中的葡萄糖浓度成正比。
评价：
本法特异性高，灵敏度高，干扰因素少， 本法特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化 特异性高 分析，为葡萄糖测定的参考方法，但是试剂较贵。 分析，为葡萄糖测定的参考方法，但是试剂较贵。
妊娠糖尿病 (Gestational diabetes
mellitus, GDM)
• 孕妇本来没有糖尿病，但在妊娠期，通 孕妇本来没有糖尿病，但在妊娠期， 常在妊娠中期或后期出现糖尿病， 常在妊娠中期或后期出现糖尿病，称为 妊娠糖尿病。 妊娠糖尿病。 • 妊娠糖尿病的原因：怀孕期间体内不能 妊娠糖尿病的原因： 产生足够水平的胰岛素而使血糖升高。 产生足够水平的胰岛素而使血糖升高。 孕妇的妊娠糖尿病发生在孕期的第28 28周 孕妇的妊娠糖尿病发生在孕期的第28周 左右，因为此时胚胎开始生长， 左右，因为此时胚胎开始生长，大量激 素可以抵抗胰岛素的分泌。 素可以抵抗胰岛素的分泌。
结果判定
• 空腹血糖损伤(IFG)： 空腹血糖损伤(IFG) –空腹血糖:6.1-7.0mmol/L; 空腹血糖:6.1 空腹血糖:6.1–服糖2h后血糖＜7.8mmol/L 服糖2h后血糖＜ 服糖2h后血糖 • 糖耐量受损(IGT)： 糖耐量受损(IGT) –空腹血糖:6.1-7.0mmol/L; 空腹血糖:6.1 空腹血糖:6.1–服糖2h后血糖:7.8-11.1mmol/L 服糖2h后血糖: 服糖2h后血糖 7.8-
血糖测定方法
• 氧化还原法：如Folin-Wu法 氧化还原法： 法 • 缩合法：如邻甲苯胺法 缩合法： • 酶法：如己糖激酶法，葡萄糖氧化酶法 酶法：如己糖激酶法， • 其他
缩合法： 缩合法：邻甲苯胺法
• 原理： 原理： –葡萄糖为一含醛基的已糖，在酸性条件下加热，可脱 葡萄糖为一含醛基的已糖， 葡萄糖为一含醛基的已糖 在酸性条件下加热， 水生成5 羟甲基- 呋喃甲醛， 水生成5-羟甲基-2-呋喃甲醛，后者与邻甲苯胺缩合成 青色的Schiff Schiff碱 青色的Schiff碱。 –Schiff碱颜色的深浅与样品中葡萄糖的含量成正比。 Schiff碱颜色的深浅与样品中葡萄糖的含量成正比 Schiff碱颜色的深浅与样品中葡萄糖的含量成正比。 • 评价：操作简便，特异性较高。 评价：操作简便，特异性较高。
酶的综合性实验三 ------酶在临床医学中的应用 酶在临床医学中的应用
血清葡萄糖测定
三峡大学医学院生化教研室
引言
• 正常人空腹血糖浓度(fasting plasma glucose,FPG) 正常人空腹血糖浓度 3.9mmol/L。 为 3.9-6.1 mmol/L。
肝糖原 非糖物质
分解
血糖 3.93.9-6.1mmol/L
– 即血糖测量值＜正常值 – 见于胰岛B细胞瘤，垂体前叶功能减退症，甲状 细胞瘤， 见于胰岛 细胞瘤 垂体前叶功能减退症， 腺功能减退， 腺功能减退，慢性肾上腺皮质功能减退以及功 能性低血糖症者。 能性低血糖症者。
思考题
1、OGTT为何有助于早期诊断糖尿病？ 、 为何有助于早期诊断糖尿病？ 为何有助于早期诊断糖尿病 2、除了测定血糖和OGTT，还有哪些生化 、除了测定血糖和 ， 指标可用于糖尿病的辅助诊断？ 指标可用于糖尿病的辅助诊断？ 3、简要说明糖尿病的分类及各类别的主要 、 成因。 成因。
实验操作
二、血糖的检测
支试管，编号，按下表操作。 取7 支试管，编号，按下表操作。
加入物 血清(ml) 血清 葡萄糖标准液 (ml) 蒸馏水(ml) 蒸馏水 工作液(ml) 工作液 B － － 0.01 1.0 S － 0.01 － 1.0 T0 0.01 － － 1.0 T30 0.01 － － 1.0 T60 0.01 － － 1.0 T90 0.01 － － 1.0 T120 0.01 － － 1.0
Schiff碱（青色） 碱 青色）
酶法：己糖激酶法（ 酶法：己糖激酶法（Hexokinase,糖＋ 葡萄糖＋ATP 葡萄糖-6-磷酸＋ 葡萄糖 磷酸＋NADP＋ 磷酸
ＨＫ
葡萄糖-６ 磷酸 磷酸＋ 葡萄糖 ６-磷酸＋ADP 磷酸葡萄糖酸内酯+NADPH ６-磷酸葡萄糖酸内酯 磷酸葡萄糖酸内酯
mmol/L
临床意义
• 糖耐量降低
– 血糖测量值＞正常值 血糖测量值＞ – 糖耐量受损，空腹血糖损伤 糖耐量受损， – 此外，甲状腺功能亢进、皮质醇增多症、慢性 此外，甲状腺功能亢进、皮质醇增多症、 胰腺炎以及肝糖原代谢障碍等糖耐量亦降低。 胰腺炎以及肝糖原代谢障碍等糖耐量亦降低。
• 糖耐量增高 糖耐量增高
mmol/L
引言
• IFG 和IGT可以说是一种正常人向糖尿病 IGT可以说是一种 可以说是一种正常人向糖尿病 的过渡状态， 的过渡状态，这部分人虽然现在还不是 糖尿病， 但是将来发生2 糖尿病， 但是将来发生2型糖尿病的危 险性非常高，可以说是糖尿病的后备军 糖尿病的后备军。 险性非常高，可以说是糖尿病的后备军。 • 据有关研究报道，每年5-8%的 IGT者将 据有关研究报道，每年5 8%的 IGT者将 发展成为2型糖尿病。 发展成为2型糖尿病。
下次实验
• 综合实验：血清蛋白质纯化与鉴定 综合实验：
– 预习盐析和葡聚糖凝胶 25脱盐法（p94~96) 预习盐析和葡聚糖凝胶G 脱盐法（ – 预习紫外检测仪、自动部分收集器和记录仪的 预习紫外检测仪、 使用方法（ 使用方法（p110~114)
• 组长安排本次做清洁的同学
计算： 计算：
• 葡萄糖标准液：5.5mmol/L 葡萄糖标准液： • 血清葡萄糖（mmol/L）=AT/AS ×CS 血清葡萄糖（ ）
实验结果： 实验结果：
a组样品 组样品 吸光度 浓度（mmol/L） ） b组样品 组样品 吸光度 浓度（mmol/L） ）
S Tb0 Tb30 Tb60 Tb90 Tb120 S Ta0 Ta30 Ta60 Ta90 Ta120
mmol/L
结果判定
• 糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)性糖耐量 糖尿病(Diabetes DM)性糖耐量
–空腹血糖≥7.0mmol/L ； 空腹血糖≥7.0mmol/L 空腹血糖 –or 服糖2h后血糖＞11.1mmol/L ； 2h后血糖 or 服糖2h后血糖＞
mmol/L
合成
糖原 脂肪、 脂肪、 氨基酸、 氨基酸、 核糖等
＞8.89mmol/L 8.89mmol/L
随尿排出
引言
• 一般正常人进食后血糖都会暂时性升高，进食后 一般正常人进食后血糖都会暂时性升高， 暂时性升高 30分种或60分种可升到最高峰 分种或60分种可升到最高峰， 30分种或60分种可升到最高峰，但血糖一般不超 8.9mmol/L；进食2小时后又会回到空腹水平， 过8.9mmol/L；进食2小时后又会回到空腹水平， 这就是人体对糖的耐受现象。 这就是人体对糖的耐受现象。 • 口服葡萄糖耐量试验（Oral glucose tolerance 口服葡萄糖耐量试验（ 试验 test， OGTT）是一种口服葡萄糖负荷试验， test， OGTT）是一种口服葡萄糖负荷试验，用 以了解人体对进食葡萄糖后的血糖调节能力。 以了解人体对进食葡萄糖后的血糖调节能力。 • 通过OGTT试验，可以早期发现糖代谢异常，早期 通过OGTT试验，可以早期发现糖代谢异常 早期发现糖代谢异常， OGTT试验 诊断糖尿病 糖尿病(Diabetes 诊断糖尿病(Diabetes Mellitus, DM) ，是一种 简单、快捷的诊断方法。 简单、快捷的诊断方法。
试剂
1. R1：磷酸盐缓冲液， 4-氨基安替比林， 磷酸盐缓冲液， 氨基安替比林 氨基安替比林， 苯酚 2. R2：GOD，POD ， 3. 工作试剂：R1和R2按10:1混合 工作试剂： 混合 4. 葡萄糖标准液：5.5mmol/L 葡萄糖标准液：
实验操作
一、口服葡萄糖耐量试验的取样方法
1. 抽取空腹血糖并留尿检测尿糖。 抽取空腹血糖并留尿检测尿糖。 空腹血糖并留尿检测尿糖 2. 一次性口服葡萄糖 一次性口服葡萄糖75g（将葡萄糖用温水溶解 （ 后，于5分钟内喝完。儿童的用量为每公斤体 分钟内喝完。 分钟内喝完 重1.75克，总量不超过 克)。 克 总量不超过75克 。 3. 分别于服糖后 、60、90和120分钟后抽血、 分别于服糖后30、 、 和 分钟后抽血 分钟后抽血、 留尿一次，检测血糖和尿糖。 留尿一次，检测血糖和尿糖。
实验目的
1. 掌握血清葡萄糖测定方法（葡萄糖氧化 掌握血清葡萄糖测定方法（ 酶法） 酶法） 2. 熟悉口服葡萄糖耐量试验的测定方法 熟悉口服葡萄糖耐量试验 试验的测定方法 3. 掌握口服葡萄糖耐量试验的临床意义 掌握口服葡萄糖耐量试验的临床意义 试验
实验原理
• 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)利用氧和水将葡萄糖 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD) 氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。 • 过氧化氢在过氧化物酶 (peroxidase，POD)作用下，分解为 (peroxidase，POD)作用下， 水和氧的同时将无色的4 氨基安替比林与酚氧化缩合生成红 水和氧的同时将无色的4-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红 色的醌类化合物。 色的醌类化合物。 • 红色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比，在510nm波 红色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比， 510nm波 长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血糖的浓度。 长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血糖的浓度。