红曲中桔霉素的Ames试验

红曲中桔霉素的Ames试验
杜新芳;陈运中
【摘要】Ames test was applied to preliminarily study the mutagenicity of citrinin in monascus by observing the reverse mutation bacteria number of histidine-defective Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100 and TAI02 treated by 0.2、 1.0、 5.0、25.0 μg/vessel citrinin. Results showed that the reverse mutation bacteria number of treatment groups were less than two times of that in blank control; and no dose-response was presented. The test result was negative, indicating that citrinin had no mutagenicity under the experimental conditions.%采用鼠伤寒沙门氏菌试验(Ames试验),通过观察0.2、1.0、5.0、25.0 μg/皿桔霉素处理对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102回复突变的影响,检测红曲中桔霉素的致突变性.结果表明,
桔霉素受试物组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍,亦未呈现剂量反应关系,试验结果为阴性,红曲中桔霉素未表现出致突变性.
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2012(051)008
【总页数】3页(P1658-1660)
【关键词】桔霉素;鼠伤寒沙门氏菌试验(Ames试验);致突变性
【作者】杜新芳;陈运中
【作者单位】武汉工业学院食品科学与工程学院,武汉430023;武汉工业学院食品
科学与工程学院,武汉430023
【正文语种】中文
【中图分类】Q319+.33
红曲由红曲霉菌发酵而成，被广泛应用于制作食醋、腐乳、食品色素以及中药等方面。

红曲在我国已有1 000多年的应用历史，尤其是在降血脂物质Monacolin K 被发现后，其更是在医药领域引起了广泛关注［1］。

然而在1995年，法国Blanc博士证实了红曲霉具有产生真菌毒素桔霉素的能力，从而使红曲产品的安全性受到了质疑［2］。

桔霉素是红曲霉菌的次级代谢产物，属于中等偏剧毒性毒素［3］，具有肾毒性，能引起试验动物的肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状［4］，并且由于桔霉素具有潜在的致畸性，会对人体产生潜在危害［5］，而在国外，桔霉素更是被列为食品污染的严格控制指标［6］。

小鼠的急性毒性试验表明其 LD50 为 112 mg／kg［7］，在此基础上，采用鼠伤寒沙门氏菌试验（Ames试验）研究桔霉素的致突变性，为深入研究其遗传毒性提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料与试剂桔霉素、葡萄糖－6－磷酸钠盐、氧化型辅酶Ⅱ、敌克松、叠氮钠、2－氨基芴、1，8－二羟基蒽醌、二甲基亚砜均由Sigma公司提供，D－生物素、L－组氨酸等其他试剂由武汉市伊格生物科技经营部提供，多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆（肝S9液）以及 TA97、TA98、TA100、TA102 由华中科技大学同济医学院提供。

桔霉素用二甲基亚砜配制成
2.0、10.0、50.0、250.0 μg／mL 桔霉素溶液供试验用。

1.1.2 培养基及 10%S9混合液①底层培养基：由每400 mL 1.5%琼脂培养基中加
入8 mL磷酸盐贮备液和20 mL 0.4 g／mL葡萄糖溶液在80℃左右混匀制成。

②顶层培养基：由每100 mL顶层琼脂［m（琼脂粉）∶m（NaCl）＝6∶5］中加
入10 mL 0.5 mmol／L的组氨酸－生物素溶液混匀配制而成。

③10%S9混合液：每 10 mL 10%S9 混合液由 6.0 mL 0.2 mol／L（pH 7.4）磷酸盐缓冲液、0.2 mL 1.65 mol／L KCl溶液、0.2 mL 0.4 mol／L MgCl2 溶液、1.0 mL 0.05 mol
／L葡萄糖－6－磷酸钠盐溶液、1.6 mL 0.025 mol／L 氧化型辅酶－Ⅱ溶液以及1.0mL的肝S9液混匀配制而成。

1.2 方法
按照GB 15193.4—2003，试验菌株选用经过鉴定合格的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸
缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102，体外活化系统为PCB诱导的肝S9
液制备的10%S9混合液。

将桔霉素受试物组桔霉素剂量设置为0.2、1.0、5.0、25.0 μg／皿。

各受试物组
平板的配制采用平板掺入法，各在45℃保温的顶层培养基中加入新鲜增菌液 0.1 mL，2.0、10.0、50.0、250.0 μg／mL 桔霉素溶液0.1 mL，在需要活化时另加
入 10%S9混合液 0.5 mL，混匀，迅速倒入底层培养基中，平放固化，每组设置
3个平行，在37℃下培养48 h。

同时设立空白对照组、阴性对照组和阳性对照组，在不加10%S9混合液时，菌株TA97、TA98、TA102选用的阳性物（阳性对照
组中加入的对照指标）为敌克松，TA100选用的阳性物为叠氮钠；在加10%S9
混合液时，菌株TA97、TA98、TA100选用的阳性物为2－氨基芴，TA102选用的阳性物为1，8－二羟基蒽醌。

若桔霉素受试物组的回变菌落数超过自发回变菌落数（空白对照组）的2倍以上
并具有剂量反应关系，则可判定试验结果为阳性，在相同条件下重复试验2次；
否则则可判定试验结果为阴性，在相同条件下重复试验1次。

2 结果与分析
加入10%S9混合液的试验组就相当于动物体的消化系统，它可以将加入的受试物代谢，这样就可以检测所加的受试物在代谢过程中有没有产生致突变的物质，而不加10%S9混合液时就是检测受试物本身是否具有致突变性。

试验结果显示，阳性对照组各菌株的回变菌落数均超过空白对照组的自发回变菌落数的2倍以上，表明各鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株对受试物桔霉素的检测有效；而在加与不加体外活化系统（10%S9混合液）的条件下，各剂量桔霉素受试物组的回变菌落数均与空白对照组的自发回变菌落数相近，并未超过其2倍，亦无剂量反应关系，表明桔霉素在试验剂量范围内，在加与不加10%S9混合液两种情况下，桔霉素的Ames试验结果为阴性，表示桔霉素未表现出致突变性。

各菌株的回变菌落数见表1。

表1 桔霉素的Ames试验结果桔霉素受试物组空白对照组阴性对照组阳性对照组剂量μg/皿0.2 1.0 5.0 25.0 TA97 TA98 TA100 TA102-S9 118.3±10.2
113.3±9.1 109.0±10.7 105.6±5.1 111.7±6.4 103.3±8.2 2 427.8±92.3+S9 106.0±12.0 116.3±6.4 120.0±10.0 114.0±7.3 117.3±7.8 101.0±10.7 2 774.7±132.2-S9 18.0±4.7 29.3±1.8 33.7±2.4 32.7±3.6 21.0±2.0 28.7±4.2 1 053.3±68.4+S9 28.0±7.3 30.0±4.0 27.3±5.1 34.3±5.6 27.0±4.7 27.7±3.8 2 366.7±143.5-S9 130.7±13.6 121.3±9.1 118.7±10.9 124.7±7.1 81.3±8.2 127.7±9.1 2 410.0±56.6+S9 118.7±7.1 125.0±9.3 123.0±10.0 123.3±7.8 115.0±6.0 132.3±7.6 2 782.7±87.1-S9 273.3±14.2 271.3±8.9 275.7±15.1 271.0±8.0 257.7±15.8 270.2±16.2 839.3±46.1+S9 290.7±17.6 273.3±13.6 283.3±12.4 276.3±10.7 272.7±41.8 289.3±7.8 996.0±71.7
3 小结与讨论
根据相关报道，桔霉素可以致畸、导致肿瘤的发生，可以诱发突变，但在试验条件下，受试物组桔霉素浓度为250.0 μg／mL，即剂量最高达到25.0 μg／皿时，其
Ames试验的结果表明其未表现出致突变性。

而这一试验结果与Martin等［8］
的在桔霉素浓度达到100 μg／mL时可引起DNA的单链损伤的研究结果不一致，但与 Sabater－Vilar 等［9］所研究的桔霉素在低剂量时未表现出致突变性的结果相一致。

在中国制定的相关标准QB／T 2847—2007中规定，功能性红曲米（粉）中的桔霉素含量（以绝干计）≤50 μg／kg，在国家标准 GB/T 5009.222—2008 中规定，对液态样品中桔霉素的定量限为50 μg／L，固态样品为1 mg／kg。

在
红曲的实际应用中必须严格控制桔霉素的含量，避免毒副作用和不良反应的发生，保证红曲药用和食用的安全性。

参考文献：
［1］黄艳，李从发，姚广龙，等.红曲及其安全性研究进展［J］.食品研究与开发，2006，27（8）：217－220.
［2］ BLANC P J，LAUSSAC J P，LE BARS J，et al.Characterization of monascidin A from Monascus as citrinin ［J］.International Journal of Food Microbiology，1995，27（2－3）：201－213.
［3］陈平，罗金亮，周礼红.红曲代谢产物研究的现状和前景［J］.江苏调味副食品，2009，26（4）：26－29.
［4］张徐兰，吴天祥，李鹏.桔霉素与红曲霉的安全性争议［J］.酿酒科技，2007（1）：81－83.
［5］曹岚，杨旭.红曲的应用及安全性分析［J］.酿酒科技，2008（6）：89－91.
［6］林涛，林清录，周俊清，等.红曲生理活性物质及其开发应用的安全性评价［J］.中国食物与营养，2005（1）：28－30.
［7］赖卫华，许杨.红曲霉产桔霉素的研究动态［J］.食品科学，2002，23（7）：139－141.
［8］ MARTIN W，LORKOWSKI G.，CREPPYE E，et al.Action of citrinin on bacterial chromosomal and plasmid DNA in vivo and in vitro ［J］.Applied and Environmental Microbiology，1986，52（6）：1273－1279.
［9］ SABATER －VILAR M，MAAS R F M，FINK －GREMMELS
J.Mutagenicity ofcommericialMonascusfermentation products and the role of citrinin contamination ［J］.Mutation Research，1999，444（1）：7－16.。