多重PCR技术用于食源性金黄色葡萄球菌肠毒素的检测
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多重 Ｐ Ｃ Ｒ技术用于食源性金黄色 葡萄球菌肠毒素的检测
金黄 色葡萄球菌是造 成食物 中毒 、 化脓性疾 病的常见菌种 ， 在土壤、 空气 、 水源中均有广泛分布 ， 由于污染食物的概率大 ，因此成为一项公共卫生问题 。就 目前而言 ，已知的肠毒素种类包括 １ ９种 ，
由于 缺 少 特 异 检 测 手 段 ， 尚 且 不 能 明 确 食 物 中毒 的 机 制 。基 于 此 ，本 文 选 取 １ ４ ５株 金 黄 色 葡 萄 球 菌 进 行 研 究 ，探 讨 了 多重 ＰＣ Ｒ检测技术的应用效果 。
种 及 以 上 肠 毒 素 基 因 。 其 中 ，９种 肠 毒 素 基 因 的 检 出 率 从
高 到 低 依 次 为 ：Ｓ Ｅ Ｕ３ ７株 （ ２ ５ ． ５ ％） 、Ｓ Ｅ Ｇ３ ２株 （ ２ ２ ． ａ ０ ｏ ／ ） 、 Ｓ Ｅ Ｍ３ ０ 株（ ２ ０ ． ７ ％） 、 Ｓ Ｅ Ｋ２ ９株 （ ２ ０ ． Ｏ ％） 、 Ｓ Ｅ Ｑ ２ ６ 株（ １ ７ ． ９ ￣ ｏ ／ ） 、
Ｓ 一１ ３ ８
Ｓ —Ｏ ７ ２
ＮＣ一 ０ ｌ ７ ３ ３ １ ． １
ＮＣ ０ ０ ９ ７ ８ ２． １
一
９ ９ ％
９ ９ ％
５’一ＴＣＡＣＣＴ ＧＣＴ ＡＡＴ ＧＴＡＡＣ ＴＣＣＡＣＣＧＴ一３’
Ｓ Ｅ Ｍ ２ ６ ８ ５ ’一 ＴＣ Ｇ ＣＡＡ ＣＣＧＣＴＧＡＴＧＴＣＧＧＡ 一３ ’
５’ －ＧＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡ ＧＡＣ Ｃ ＧＴ ＡＴＣＣＴＧＴＧ一３ ’ Ｓ Ｅ Ｌ ５ ７ ２ ５’ 一ＡＣＧＧ Ｃ Ｇ ＡＴＧＴＡＧＧＴ ＣＣ Ａ ＧＧＡＡ 一３ ’
ＮＣ ０ ０ ２ ７ ５ ８ ． ２
一
ＮＣ＿ Ｏ ０ ２ ７ ４ ５ ． ２
９ ９ ％
ＳＥ Ｑ
Ｓ Ｅቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
５ ’ 一ＡＣＴＣＴＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧＡＡＣＣＴ一３ ’
Ｓ ＥＮ ５ ２ ４
多重 Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 结 果 。利 用 多 重 Ｐ Ｃ Ｒ体 系，对 １ ４ ５株
５ ’一ＡＡＣ ＧＴＧＧＣ ＡＡＴＴＡＧＡＣ ＧＡＧＴＣＡ一３’ ５ ’一Ｃ ＴＣ ＴＧＣ ＴＴＧＡＣＣＡＧＴＴＣＣ ＧＧＴＧＴ一３’ Ｓ ＥＱ ３ ３ １
５ ’ 一ＴＧＧＣＧＧＡ ＡＴＴＡ Ｃ ＧＴＴＧＧ Ｃ ＧＡ ＡＴ一３’ ５ ’ 一ＧＧＣＧＧＴＧＴＧＡ ＣＣＧＡＧ ＣＡＴＧＡ一３’ Ｓ ＥＵ ２ ２ ９ ５ ’ 一ＡＧ ＣＣＡＧＡ ＣＴＣＡＴＡ ＡＧＧ Ｃ ＧＡ Ａ Ｃ Ｔ一３’
金黄 色葡 萄球 菌 的肠毒 素基 因进 行检 测，结果 显示 ９ ７株 （ ６ ６ ． ９ ％） 至少含有 １ 种 肠毒 素 基 因 ，４ ８ 株 （ ３ ３ ． １ ％） 含有 ２
公司 提 供 。
方法
菌株复 苏 ： 在菌株磁珠 冻存管 中 ，用接种环挑 取 １ 颗磁珠 ，放 于营养琼 脂肉汤 中，在
３ ７ ℃温度下培 养 ２ ４小时 ，并观察其浑浊度 。基因提取 ： 取混浊菌 液 ｉ ｍｌ 放在 １ ． ５ ｍｌ 的Ｅ Ｐ管 内，
ｉ ０ ０ ０ ０ ｒ ｐ ｍ 离心 ３ ｍｉ ｎ 。除 去 上 层 清 液 ，向 沉 淀 物 加 入 ２ ０ ０ １ 溶菌酶溶液 （ 浓度为 ５ ０ ｍｇ ／ ｍ１ ） ，混 合 均 匀 后 ，在 ３ ７ ℃条 件 下 静 置 ｌ 小时 。然后按照 Ｄ ＮＡ 提 取 试 剂 盒 上 的 说 明 提 取 Ｄ ＮＡ，用 微 量 分
目的基因
Ｓ ＥＬ Ｓ Ｅ Ｍ Ｓ ＥＮ
菌株编 号
Ｓ 一１ ｌ ４ Ｓ －０ ０ ５ Ｓ －０ ４ ２
Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ登录号
ＮＣ ０ ０ ３ ９ ２ ３ ． １
一
相似度
９ ９ ％ ９ ９ ％
５’ 一ＴＴＣ ＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＧＴＧＡＣ ＴＣＣＡＣＣ Ａ一３ ’ ５’一ＡＧＴＧＣＣＡＧＣＧＣＴＣ ＡＡＧＧＴＧＡＴ－ ３’
表１ 目的基因的片段长度和引物序 列
目的 基 因 片段 长 度
Ｓ ＥＧ ４ ０ Ｉ ５ ’ 一Ａ Ｃ ＧＴ Ｃ Ｔ ＣＣＡＣＣＴＧＴＴ Ｇ ＡＡ ＧＧＡ一３’ ５ ’一ＴＧＣＧＡ ＡＡＧ ＣＡＧＡ ＡＧＡＴＴＴＡ ＣＡＣＧＡ一３’ Ｓ ＨＥ ３ ４ ３ ５ ’ 一Ａ ＣＣＡＡ ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＴ Ｇ ＣＣＡ一３’ ５ ’ 一ＴＧＣＡ ＣＣ Ｔ ＣＣ ＴＣ ＴＣ ＴＧ Ｃ Ｇ ＣＣ Ｔ～３’ ＳＥ Ｊ ７ ０ ４
光光度计 ，测定提 取 ＤＮ Ａ 的浓度 ，加纯水 直至浓度达 到 １ ０ ｎ ｇ ／ｕ ｌ ，并保存在 － ２ ０ ℃的环境 中。 引物设计和片段测 序 ： 参考 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ数据库 、应用 Ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ｒ ｅ ｍｉ ｅ ｒ分析软件 ，分别对 ９种肠毒素
基因的 Ｐ Ｃ Ｒ 引物 进 行 筛选 和 设计 ，见 下 表 １ 。
５ ’ 一ＡＧＴＧ ＣＡＴ ＴＧＴ ＡＡ Ｃ Ｇ ＣＣＣＣＣＧＴ一３ ’
引物序， Ｕ
ｉ ｆ ’ 一ＧＴ Ｇ ＡＧ ＣＣ Ａ ＧＴＧＴＣ ＴＴＧＴＴＴＧ Ｔ 一３ ’
７ ０ 食 品 安 全 导 刊 ２ ０ １ ７ 年 ８ 月
目的基因 片段长度
Ｓ Ｅ Ｋ ２ ７ ３
引物序列
材料与方法
茵株 来源 １ ４ ５ 株金 黄色葡萄球菌从食物检测样 本中提取 ， 其 中食源性致病菌检测样本 ｌ １ Ｏ株 ，
包括 熟肉、速 冻制品 、凉拌菜 、沙拉 、果 汁等 ；食物 中毒样本 ３ ５株 ，从患者剩余食物 、粪便 、肛
拭 子 中获 得 。
仪 器 试 剂 Ｂ ａ ｉ ｒ ｄ — Ｐ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ 琼 脂 培 养 基 、血 平 板 、亚 碲 酸 钾 卵 黄 增 菌 掖 ，均 由 北 京 陆 桥 技 术 股 份 有 限公 司提 供 ；溶 菌 酶 、 基 因 组 提 取 试 剂 盒 、Ｐ ＣＲ 引 物 ， 由上 海 生 工生 物 工 程 公 司 提 供 ；细 菌 培 养 箱是 由 德 国宾 德 公 司 提 供 ；基 因 扩 增 仪 、毛 细 管 电泳 仪 、微 量 分 光 光 度 计 等 ，是 由 美 国 Ｉ Ｂ Ｍ
金黄 色葡萄球菌是造 成食物 中毒 、 化脓性疾 病的常见菌种 ， 在土壤、 空气 、 水源中均有广泛分布 ， 由于污染食物的概率大 ，因此成为一项公共卫生问题 。就 目前而言 ，已知的肠毒素种类包括 １ ９种 ，
由于 缺 少 特 异 检 测 手 段 ， 尚 且 不 能 明 确 食 物 中毒 的 机 制 。基 于 此 ，本 文 选 取 １ ４ ５株 金 黄 色 葡 萄 球 菌 进 行 研 究 ，探 讨 了 多重 ＰＣ Ｒ检测技术的应用效果 。
种 及 以 上 肠 毒 素 基 因 。 其 中 ，９种 肠 毒 素 基 因 的 检 出 率 从
高 到 低 依 次 为 ：Ｓ Ｅ Ｕ３ ７株 （ ２ ５ ． ５ ％） 、Ｓ Ｅ Ｇ３ ２株 （ ２ ２ ． ａ ０ ｏ ／ ） 、 Ｓ Ｅ Ｍ３ ０ 株（ ２ ０ ． ７ ％） 、 Ｓ Ｅ Ｋ２ ９株 （ ２ ０ ． Ｏ ％） 、 Ｓ Ｅ Ｑ ２ ６ 株（ １ ７ ． ９ ￣ ｏ ／ ） 、
Ｓ 一１ ３ ８
Ｓ —Ｏ ７ ２
ＮＣ一 ０ ｌ ７ ３ ３ １ ． １
ＮＣ ０ ０ ９ ７ ８ ２． １
一
９ ９ ％
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５’一ＴＣＡＣＣＴ ＧＣＴ ＡＡＴ ＧＴＡＡＣ ＴＣＣＡＣＣＧＴ一３’
Ｓ Ｅ Ｍ ２ ６ ８ ５ ’一 ＴＣ Ｇ ＣＡＡ ＣＣＧＣＴＧＡＴＧＴＣＧＧＡ 一３ ’
５’ －ＧＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡ ＧＡＣ Ｃ ＧＴ ＡＴＣＣＴＧＴＧ一３ ’ Ｓ Ｅ Ｌ ５ ７ ２ ５’ 一ＡＣＧＧ Ｃ Ｇ ＡＴＧＴＡＧＧＴ ＣＣ Ａ ＧＧＡＡ 一３ ’
ＮＣ ０ ０ ２ ７ ５ ８ ． ２
一
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ＳＥ Ｑ
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Ｓ ＥＮ ５ ２ ４
多重 Ｐ Ｃ Ｒ 检 测 结 果 。利 用 多 重 Ｐ Ｃ Ｒ体 系，对 １ ４ ５株
５ ’一ＡＡＣ ＧＴＧＧＣ ＡＡＴＴＡＧＡＣ ＧＡＧＴＣＡ一３’ ５ ’一Ｃ ＴＣ ＴＧＣ ＴＴＧＡＣＣＡＧＴＴＣＣ ＧＧＴＧＴ一３’ Ｓ ＥＱ ３ ３ １
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金黄 色葡 萄球 菌 的肠毒 素基 因进 行检 测，结果 显示 ９ ７株 （ ６ ６ ． ９ ％） 至少含有 １ 种 肠毒 素 基 因 ，４ ８ 株 （ ３ ３ ． １ ％） 含有 ２
公司 提 供 。
方法
菌株复 苏 ： 在菌株磁珠 冻存管 中 ，用接种环挑 取 １ 颗磁珠 ，放 于营养琼 脂肉汤 中，在
３ ７ ℃温度下培 养 ２ ４小时 ，并观察其浑浊度 。基因提取 ： 取混浊菌 液 ｉ ｍｌ 放在 １ ． ５ ｍｌ 的Ｅ Ｐ管 内，
ｉ ０ ０ ０ ０ ｒ ｐ ｍ 离心 ３ ｍｉ ｎ 。除 去 上 层 清 液 ，向 沉 淀 物 加 入 ２ ０ ０ １ 溶菌酶溶液 （ 浓度为 ５ ０ ｍｇ ／ ｍ１ ） ，混 合 均 匀 后 ，在 ３ ７ ℃条 件 下 静 置 ｌ 小时 。然后按照 Ｄ ＮＡ 提 取 试 剂 盒 上 的 说 明 提 取 Ｄ ＮＡ，用 微 量 分
目的基因
Ｓ ＥＬ Ｓ Ｅ Ｍ Ｓ ＥＮ
菌株编 号
Ｓ 一１ ｌ ４ Ｓ －０ ０ ５ Ｓ －０ ４ ２
Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ登录号
ＮＣ ０ ０ ３ ９ ２ ３ ． １
一
相似度
９ ９ ％ ９ ９ ％
５’ 一ＴＴＣ ＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＧＴＧＡＣ ＴＣＣＡＣＣ Ａ一３ ’ ５’一ＡＧＴＧＣＣＡＧＣＧＣＴＣ ＡＡＧＧＴＧＡＴ－ ３’
表１ 目的基因的片段长度和引物序 列
目的 基 因 片段 长 度
Ｓ ＥＧ ４ ０ Ｉ ５ ’ 一Ａ Ｃ ＧＴ Ｃ Ｔ ＣＣＡＣＣＴＧＴＴ Ｇ ＡＡ ＧＧＡ一３’ ５ ’一ＴＧＣＧＡ ＡＡＧ ＣＡＧＡ ＡＧＡＴＴＴＡ ＣＡＣＧＡ一３’ Ｓ ＨＥ ３ ４ ３ ５ ’ 一Ａ ＣＣＡＡ ＴＣＡＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＴ Ｇ ＣＣＡ一３’ ５ ’ 一ＴＧＣＡ ＣＣ Ｔ ＣＣ ＴＣ ＴＣ ＴＧ Ｃ Ｇ ＣＣ Ｔ～３’ ＳＥ Ｊ ７ ０ ４
光光度计 ，测定提 取 ＤＮ Ａ 的浓度 ，加纯水 直至浓度达 到 １ ０ ｎ ｇ ／ｕ ｌ ，并保存在 － ２ ０ ℃的环境 中。 引物设计和片段测 序 ： 参考 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ数据库 、应用 Ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ ｒ ｅ ｍｉ ｅ ｒ分析软件 ，分别对 ９种肠毒素
基因的 Ｐ Ｃ Ｒ 引物 进 行 筛选 和 设计 ，见 下 表 １ 。
５ ’ 一ＡＧＴＧ ＣＡＴ ＴＧＴ ＡＡ Ｃ Ｇ ＣＣＣＣＣＧＴ一３ ’
引物序， Ｕ
ｉ ｆ ’ 一ＧＴ Ｇ ＡＧ ＣＣ Ａ ＧＴＧＴＣ ＴＴＧＴＴＴＧ Ｔ 一３ ’
７ ０ 食 品 安 全 导 刊 ２ ０ １ ７ 年 ８ 月
目的基因 片段长度
Ｓ Ｅ Ｋ ２ ７ ３
引物序列
材料与方法
茵株 来源 １ ４ ５ 株金 黄色葡萄球菌从食物检测样 本中提取 ， 其 中食源性致病菌检测样本 ｌ １ Ｏ株 ，
包括 熟肉、速 冻制品 、凉拌菜 、沙拉 、果 汁等 ；食物 中毒样本 ３ ５株 ，从患者剩余食物 、粪便 、肛
拭 子 中获 得 。
仪 器 试 剂 Ｂ ａ ｉ ｒ ｄ — Ｐ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ 琼 脂 培 养 基 、血 平 板 、亚 碲 酸 钾 卵 黄 增 菌 掖 ，均 由 北 京 陆 桥 技 术 股 份 有 限公 司提 供 ；溶 菌 酶 、 基 因 组 提 取 试 剂 盒 、Ｐ ＣＲ 引 物 ， 由上 海 生 工生 物 工 程 公 司 提 供 ；细 菌 培 养 箱是 由 德 国宾 德 公 司 提 供 ；基 因 扩 增 仪 、毛 细 管 电泳 仪 、微 量 分 光 光 度 计 等 ，是 由 美 国 Ｉ Ｂ Ｍ