简论shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默

简论shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默背景介绍
RNA干扰技术（RNAi）是一种通过介导基因沉默来研究基因功能的分子生物
学方法。

RNAi技术最初是利用双链RNA作为介导体来沉默目标基因，但是双链RNA的应用有很多限制，对此新的方法有了诞生，其中shRNA (short hairpin RNA) 是一种双链RNA模板，具有高度特异性的基因沉默作用，因此被广泛应用于基因
功能研究和基因治疗领域。

构建shRNA表达载体是基因沉默的重要工具之一。

HIF1 (hypoxia-inducible factor 1) 是一种重要的转录因子，参与了细胞适应低
氧环境的过程，对肿瘤的发生、发展和治疗有着重要的影响。

因此，HIF1的研究
尤为重要。

本文将介绍如何构建shRNA表达载体pWH1，并利用其对HIF1进行
沉默。

构建shRNA表达载体pWH1
材料和方法
材料
1.pWH1质粒（Addgene，编号24212）
2.shRNA序列
3.人类H1细胞
方法
1.设计shRNA序列：在选择合适的shRNA序列时，需充分考虑以下要
素：a) shRNA序列长度应为19-27nt，合适的长度可以使其具有较高的特异性；
b) 需选择目标基因独特的序列作为shRNA靶点，避免对其他基因造成影响；
c) 其次，选择shRNA序列不应出现较长的多聚体或配对受限结构，可能导致
组装和POI转录的障碍。

2.构建shRNA表达载体pWH1：将设计好的shRNA序列克隆入pWH1
载体中。

具体步骤如下：
•主动生产shRNA的目标序列DNA片段，还包括一些特殊序列，即有5’-p-UUCG-3’起始shRNA序列，它需要用于在结合shRNA和pWH1载体时)，帮助启动POI转录和帮助在Drosha酶结构中稳定H1序列。

•合成shRNA模板OLIGO，并互补焊接两侧序列。

•将shRNA模板OLIGO和pWH1载体质粒使用T4 DNA酶联酶催化剂结合，形成shRNA表达载体pWH1。

3.验证shRNA表达载体pWH1的构建：将克隆好的pWH1载体通过
测序检测，确保shRNA表达载体pWH1的正确性。

用于HIF1基因的沉默
材料和方法
材料
1.构建好的shRNA表达载体pWH1-HIF1
2.人类H1细胞
方法
1.分别将pWH1-HIF1和质控载体（GFP）转染到人类H1细胞中：
•使用梅巴胍氯化物将pWH1-HIF1和质控载体转染到人类H1细胞中。

2.通过qRT-PCR检测细胞里HIF1表达量变化，记录下实验数据。

3.通过Western blot检测HIF1蛋白表达量变化，确定HIF1基因是否
被沉默。

结论
本文介绍了如何构建shRNA表达载体pWH1，并利用其对HIF1进行沉默。

该
方法可以帮助研究人员沉默不同的基因，进一步探究基因调控的机制，为基因治疗和药物研发提供帮助。

同时，该技术也为学生和初学者提供了一个简单、实用的基因沉默方法。