国产盐酸多西环素原料中有关物质的结构鉴定及杂质谱考察

关键词：盐酸多西环素； 杂质谱； 结构鉴定
中图分类号：R927
文献标识码：A
文章编号：1009 － 3656（ 2011） － 2 － 106 － 6
Characterization of Related Substances and Study of Impurity Profile in Domestic Doxycycline Hyclate
多西环素 杂质 A（ β-多西环素） 杂质 B（ 美他环素） 杂质 C（ 4-表多西环素） 杂质 D（ 4-表-6-表多 西环素） 杂质 E（ 土霉素） 杂质 F（ 2-乙酰-2-脱碳 酰胺多西环素）
R1
R2
R3
R4
R5
NH2 H N（ CH3 ） 2 H CH3
NH2 H N（ CH3 ） 2 CH3 H
摘要 目的：鉴定盐酸多西环素原料中检出的有关物质结构，考察国产原料的杂质谱。方法： 用十八烷基硅烷键合硅胶为填 充剂（ pH 值适用范围应大于 9） ； 以醋酸盐缓冲液［0. 25 mol·L － 1 醋酸铵-0. 1 mol·L － 1 乙二胺四醋酸二钠 － 三乙胺（ 100∶ 10∶ 1） ，用冰醋酸或氨水调节 pH 值至 8. 8］-乙腈（ 85∶ 15） 为流动相； 柱温 35 ℃ ； 检测波长为 280 nm，流速： 1. 0 mL·min －1 ； 进样体
陷，笔者在文献方法的启发下，以宽 pH 范围的 C18 填 料为固定相，对多西环素色谱行为主要影响因素进行 了系统地研究，建立了更为简便合理的色谱条件，已 被《中国药典》2010 年版采用（ 详细的建立过程已另 文发表） 。新建色谱条件可以使原料中有关物质得到 良好分离，适用不同厂家原料中杂质谱（ impurity profile） 考察。
积： 20 μL。用土霉素、美他环素、β-多西环素对照品色谱保留时间定位方法鉴定 3 个已知杂质，用文献方法分别制备了 4-表多
西环素和 4-表-6-表多西环素，再采用色谱保留时间定位方法鉴定其他 2 个杂质，用制备薄层色谱制备 2-乙酰-2-脱碳酰胺多西 环素溶液（ 采用 LC-ESI-IT-MS2 法鉴定其结构） 鉴定另外 1 个主要杂质。结果： 典型样品色谱图中检出 8 个杂质峰，6 个主要杂
《中国药典》2005 年版二部采用滴定法测定硝 酸益康唑含量，用三氯甲烷溶解供试品，在加水 20 mL 与稀硫酸 5 mL，以二甲基黄-溶剂蓝 19 混合指 示液为指示剂，用磺基丁二酸钠二辛酯试液滴定至
表 3 样品检测结果
生产单位 批号
厂家Ⅰ 厂家Ⅱ
070501 080302 080820 090211 090204
盐酸多西环素（ Doxycycline Hyclate） 是以土霉 素为原料制得的半合成广谱四环类抗生素［1］，其含 半分子乙醇和半分子结晶水的盐酸盐在临床上有着
广泛的 应 用，盐 酸 多 西 环 素 及 其 片 剂、胶 囊 剂 在 USP31 / NF26、BP2008、Ph. Eur 6. 0、JPⅩⅤ 和《中国 药典》2005 年版等中均有收载［2 ～ 6］，Ph. Eur 6. 0 提 供了其 6 个潜在杂质的化学结构，分别命名为杂质 A、B、C、D、E、F，盐酸多西环素及其潜在杂质的化学 结构如图 1 所示［4］。
典型样品中检 出 多 个 杂 质，作 者 对 6 个 主 要 杂质进行了结构推 定，推 定 思 路 根 据 有 无 杂 质 对 照的情况而异。对有杂质 对 照 品、或 虽 然 无 杂 质 对照品但有杂质溶液制备方法的 5 个主要杂质， 采用色谱保留时间定位法确定其结构； 另一主要 杂质结构的鉴定相 对 复 杂，采 用 了 制 备 薄 层 色 谱 制得纯度较高的杂质溶液，用 LC-ESI-IT-MSn 法进 行结构推 定，用 其 作 为 杂 质 对 照 溶 液，再 采 用 色 谱色谱保留时间定位法确定其在色谱图中的出 峰位置，实验中还应 用 了 光 电 二 极 管 阵 列 检 测 技 术（ PAD） 采集对照品和检出杂质 的 紫 外 图，用 于 旁证结构的一致性。现将研究结果报道如下。 1 仪器与试药
［1］ 国家药典委员会 .《中国药典》. 2005 年版 . 一部［S］. 2005： 433.
［2］ 国家药典委员会 .《中国药典》. 2005 年版 . 一部［S］. 2005： 279.
国产盐酸多西环素原料中有关物质的结构鉴定及杂质谱考察
袁耀佐1 ，张玫1 ，钱文1 ，杨志明2 ，赵恂1 （ 1. 江苏省食品药品检验所，南京 210008； 2. 常州制药厂有限公司，常州 213018）
质按色谱出峰顺序分别为土霉素、4-表-6-表多西环素、4-表-多西环素、美他环素、β-多西环素、2-乙酰-2-脱碳酰胺多西环素； 杂
质谱考察结果显示，不同来源的国产盐酸多西环素的杂质谱相似，均检出美他环素、β-多西环素、2-乙酰-2-脱碳酰胺多西环素
及另外两未知杂质，但大多未检出土霉素。结论： 建立的方法适用于盐酸多西环素原料中杂质谱考察和有关物质检查。
NH2
H
N（ CH3 ） 2 R4 + R5 = CH2
NH2 N（ CH3 ） 2
H
H CH3
NH2 N（ CH3 ） 2
H
CH3 H
NH2 H N（ CH3 ） 2 OH CH3 CH3 H N（ CH3 ） 2 H CH3
图 1 多西环素及有关物质的结构式
盐酸多西环素有关物质测定方法报道很多，主要 以 HPLC 方法为主［2 ～8］，由于目前文献方法均存在缺
Drug Standards of China 2011，V． 2 95． 9 98． 0 92． 6 93． 8
牻牛儿酮 / mg / 粒
16． 55 16． 28 17． 02 16． 61 16． 39
三氯甲烷层由绿色变为红灰色。实验中存在水相与 三氯甲烷层的平衡过程，滴定速度慢，反应时间长， 需剧烈振摇，滴 定 终 点 不 易 确 定，测 定 结 果 波 动 较 大。本法采用 HPLC 法同时检测硝酸益康唑和牻牛 儿酮的含量，经方法学验证，该方法灵敏、准确，重复 性好，适用于复方莪术油栓中硝酸益康唑和牻牛儿 酮的含量测定，能对产品的质量进行有效的控制。 参考文献
作者简介： 袁耀佐，男，副主任药师。学科及研究方向： 抗生素质量研究。联系电话： 13905172943。
Drug Standards of China 2011，Vol. 12 No. 2
中国药品标准 2011 年第 12 卷第 2 期 107
Abstract Objectives： To identify the chemical structures of related substances in bulk of Doxycycline Hyclate and to study the impurity profile of Doxycycline Hyclate. Methods： Carry out the method with high performance liquid chromatogram，using a column packed with octadecysilane bonded silica gel and a mixture of a buffer solution which consist of 100 volumes of 0. 25 mol·L －1 ammonium acetate solution，10 volumes of 0. 1 mol·L －1 ethyldiaminetetraacetic acid disodium salt solution and 1 volume of triethyamine adjusting pH to 8. 8 with glacial acetic acid acetonitrile （ 85∶ 15） as the mobile phase，maintain the column temperature at 35℃ ，detection wavelength is 280nm，flow rate is 1 mL·min －1 ，injection volume is 20 μL. Use oxytetracycline，metacycline and β-epidoxycycline reference substances to identify and locate three impurities peaks in the chromatogram of a typical bulk of doxycycline hyclate，other two impurities were identified and located in the chromatogram by impurity solutions prepared according to literature methods，another impurity was located by a impurity solution which prepared by a preparative TLC method，and identified by LC-ESI-IT-MS2. Results： There are eight impurity peaks in a chromatogram of typical bulk of doxycycline hyclate，the six major impurity peaks are oxytetracycline，4epi-6-epidoxycline，4- epidoxycline，metacycline，β-epidoxycycline and 2-acetyl-2-decarbamoyldoxycline respectively according to the elution order. The study showed that impurity profiles of different domestic doxycycline hyclate were similar，all include metacycline， β-epidoxycycline，2-acetyl-2-decarbamoyldoxycline and other unknown impurities，but no oxytetracycline was detected from most doxycycline hyclate samples. Conclusions： The established method was suitable to be applied in the study of impurity profile and test of related substances of doxycycline hyclate Key Words： Doxycycline hyclate； Related substance； impurity profile； Characterization
取“2. 8”项下供试品溶液 1 份，在 0、2、4、6、8 h 内，分别进样，按上述色谱条件测定硝酸益康唑和牻 牛儿酮的峰面积，结果表明，供试品溶液在室温条件 下，8 h 内稳定，硝酸益康唑和牻牛儿酮峰面积 RSD 分别为 0. 3% 和 0. 2% 。 2. 11 样品测定
取供试品适量，按上述方法制备供试品溶液并 测定。结果见表 3。 3 讨论
中国药品标准 2011 年第 12 卷第 2 期 106
16. 92 mg，RSD 为 0. 5% ，重复性良好。 2. 9 精密度实验
取“2. 8”项下供试品溶液 1 份，连续进样 6 次， 按上述色谱条件测定硝酸益康唑和牻牛儿酮的峰面 积，结果表明，硝酸益康唑和牻牛儿酮峰面积 RSD 均为 0. 2% ，进样精密度良好。 2. 10 溶液的稳定性
characterization盐酸多西环素doxycyclinehyclate是以土霉素为原料制得的半合成广谱四环类抗生素半分子乙醇和半分子结晶水的盐酸盐在临床上有着广泛的应用盐酸多西环素及其片剂胶囊剂在usp31nf26bp2008pheur0jp和中国药典2005年版等中均有收载pheur个潜在杂质的化学结构分别命名为杂质abcdef盐酸多西环素及其潜在杂质的化学结构如图1所示杂质e土霉素nhohch杂质f2乙酰2脱碳酰胺多西环素ch多西环素及有关物质的结构式盐酸多西环素有关物质测定方法报道很多主要以hplc方法为主由于目前文献方法均存在缺陷笔者在文献方法的启发下以宽ph范围的c18料为固定相对多西环素色谱行为主要影响因素进行了系统地研究建立了更为简便合理的色谱条件已被中国药典2010年版采用详细的建立过程已另文发表
Yuan Yao-zuo1 ，Zhang Mei1 ，Qian Wen1 ，Yang Zhi-ming2 ，Zhao Xun1 （ 1. Jiangsu Institute for Drug Control，Nanjing 210008；
2. Changzhou Pharmaceutical Factory，Changzhou 213018）