14-蛋白质三级结构的研究方法

蛋白质三级结构的研究方法
生物物理系 魏代玉 10589030
生物大分子是生命活动的执行者。

而生物大分子的三维结构能使我们在最基本的层次上理解生物学过程：比如在一个生物学过程种，哪些分子发生相互作用，它们如何作用，酶分子如何催化一个反应，离子通道如何运输离子，载体如何转运物质，药物分子如何发生作用等。

在某些情况下，三维结构甚至能使我们在原子水平上理解疾病，一个典型的例子是镰刀形红细胞症。

三维结构的一个重要应用是我们可以利用三维结构的信息来设计新药。

所以说，了解一个分子的结构及其反应中的结构变化对理解生物学过程十分重要。

现阶段测定蛋白质三维结构的方法主要有X射线晶体衍射分析，电镜三维重构技术以及核磁共振技术。

这三种方法因其各自的优缺点适用于测定不同生物分子的结构。

此外应用较多的还有圆二色谱，和电子顺磁共振技术，但是这两种技术不能直接测定蛋白质结构，所以主要应用于测定蛋白是否发生构像变化。

X射线晶体衍射分析（X－ray Crystallography）主要包括以下几个步骤[1]：
1．晶体培养。

结构测定的精度依赖于晶体所能达到的衍射分辨率，所以获得具有强衍射能力的晶体是蛋白质晶体结构测定分析的关键步骤，是蛋白质晶体结构
分析的瓶颈。

2．数据收集和处理。

一般来讲，中等大小晶胞的一套高分辨率数据，至少要收集几万个衍射强度数据，在经过专门的数据处理程序包处理，给出这一套数据的
各种统计结果，以判断数据质量的好坏。

3．测定相位。

用X射线衍射方法测定晶体结构，其核心问题是解决每个衍射点的相位问题。

对小分子可以利用Patterson函数计算出晶胞中原子的位置，但是大
分子不可能利用这种方法，只能利用其他方法如同晶置换法才能确定相位。

4．相位的改进。

电子密度图的质量及其后的可解释性主要决定于相角的准确性。

在某些情况下采用晶胞不对称单元中等同部分的电子密度平均，有可能大大改
善误差较大的起始相角。

5．电子密度图的计算和解释。

有了每个衍射点的相位，加上已经收集到的每个衍射点的结构振幅，就可计算电子密度图。

由于蛋白质分子结构的复杂性，它的
电子密度图随着分辨率的不同，从图上能识别出的结构层次也不同。

6．结构模型修正。

从电子密度图上最初建立的蛋白质分子结构模型是比较粗糙的，需要进一步精华。

现在X射线晶体衍射分析的方法已经很成熟，其中有两个难点。

一个就是获得高质量的晶体，另一个是确定相位。

现在最常用的方法是单对或多对同晶置换法。

这个方法的基础是测量重原子（常为金属）结合到蛋白质分子上有限的几个特异位点时而导致的衍射强度变化。

一般是将母体晶体浸在重原子溶液中，必须保证浸泡于重原子溶液中的晶体不出现裂痕，但是所得晶体是否合适最终仍要经过X射线数据收集与母体晶体比较之后才能知道。

核磁共振（Nuclear magnetic resonance）是指原子核在外加恒定磁场作用下产生能级分裂，从而对特定频率的电磁波发生共振吸收的现象。

和光学吸收相比，相同之处都是物质对外来电磁波的共振吸收的现象，不同之处是光学吸收涉及原子或分子的固有能级之差，而核磁共振中所涉及原子核的能级差则只有在外加磁场作用下才能产生[2]。

原子核都在不断做自旋运动，正电的原子核在自旋时可以产生磁场，就像一个小型的磁铁，从而可以在磁场中受力产生转动。

按照量子力学原理，可能产生的自旋态是量子化的，如1H有两个自旋态，不同取向的自旋核所具有的能量不同产生分裂，当入射电磁波能量等于能级间能量差即引起原子核两个能级间的跃迁，这时就发生了核磁共振。

处于低能级的自
旋核吸收能量跃迁到高能级，而处于高能级者则发射能量回到低能级，这两种跃迁的几率是相同的。

由于任意稳定下处于低能级的核总是多于高能级的核，所以总起来说仍表现为对电磁波的净吸收现象。

满足共振条件可以有两种方法，一是固定电磁波的频率而逐渐改变外加磁场，称为扫场，另一种是固定磁场而改变电磁波的频率，称为扫频。

目前应用最广的是脉冲傅立叶变换的核磁共振技术。

即应用一个短时间方波脉冲激发样品，这种方波中包含各种不同的频率在内，因此样品中不同的核可在同一时间内都得到激发。

但是脉冲过后得到的是指数衰减的时域函数，借助Fourier 变换的数学方法把时域函数转换成频域函数，这时就能见到已经产生的若干共振峰，这种变化过程可以由计算机自动完成。

一维核磁共振只能测定小分子的结构如氨基酸，要测定大分子物质就需要利用二维核磁共振以及多维核磁共振。

一维核磁共振是在一个脉冲之后的t1时间进行数据收集，二维核磁共振在t1时间后再加一个脉冲后在t2时间内收集数据S （t1，t2），然后分别以t2和t1为变量进行傅立叶变换就得到二维谱S （w1，w2）。

二维谱就是把作为对角线的一维谱的峰进一步分开。

在生物学研究中最常用的是两种谱：相关谱（correlated spectroscopy ，COSY ）和增强谱（Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy ，NOESY ）。

COSY 也有显示J 偶合的同核位移相关谱和异核自旋－自旋偶合。

如果已知蛋白质的一级结构中氨基酸残基的连接顺序，则通过COSY 谱可以很容易地辨认出每个峰的归属。

而NOESY 谱是指两个没有自旋自旋耦合的核，若在空间距离上小于0.5nm 时，辐照其中一个核使之饱和，另一个核的信号强度会增强而产生交叉峰。

这种交叉峰地面积大小与两核间距的六次方成反比。

因此可以利用这两种谱，第一步COSY 谱指认出产生共振峰的核，第二步是从J 偶合和NOESY 谱确定的NOE 值确定出二级结构的类型以及核间距离，根据核间距离构建出三级结构的模型。

核磁共振主要步骤如下：先准备样品，浓缩蛋白质的水溶液（0.21－1mM ），如果测1H 谱需用D 代试剂，将样品置于外加磁场中，测量共振频率，计算机通过频率得出每一对原子核的偶合常数和NOE 值，计算对应的原子间距离。

最后构建模型。

X 射线晶体衍射分析就是用于测定晶体的结构，核磁共振除了测定分子结构之外还有很多方面的应用。

例如研究脂的多型性，离子浓度测定（如细胞内Na ＋的测定），活体中磷代谢的研究，核磁成像（恒定磁场加梯度磁场）等。

NMR 实验都力求磁场均匀，使整个样品中性质相同的核同时发生共振。

如果在恒定磁场上再加一个梯度磁场就可以控制相同性质的核的磁共振，使之在一个平面上，一条线上甚至一个点上发生。

对梯度场进行扫描就可以分别记录每一点的共振强度，用计算机辅助得到同一核的断层像，三维重组即得三维空间图，即核磁成像。

核磁成像优点很多，容易分辨软组织，对机体无损伤，而且随着所测核在体内得代谢变化，图像也会变化，反映了活体中一定的功能变化，因此核磁共振已经成为许多医院中一种常规的检查手段，且被应用于研究脑的功能变化。

在电镜下观察生物大分子时，观察的对象是三维结构，电镜图像是这些三维结构的二维投影。

由生物结构的二维电镜图像推知其三维结构的方法称为三维电镜方法（Electron Microscopy of Biological Macromolecules ）。

这种方法在最近这些年发展迅速，主要分为三种手段：电子晶体学，单颗粒技术和电子断层成像技术。

这三种手段的适用对象如下表[3]。

三维电镜方法的主要原理是中心截面定理[4]：
二维投影（电镜照片）的傅立叶变换＝物体的三维傅立叶变换的一个中央截面
傅立叶变换： (,,)(x,y,z)exp[2()]F X Y Z i xX yY zZ dxdydz ρ=Π++∫∫∫Ó
其中：(,,)x y z ρ是物体的质量密度函数。

中心截面Z ＝0时，(,,0)(x,y)exp[2()]F X Y i xX yY dxdydz δ=
Π+∫∫∫Ó
其中，(,)x y δ为物体的二维投影。

简单来说，不能用照片直接组合形成物体的三维结构，但是将照片分别进行傅立叶变换，傅立叶空间的各个平面可以进行组合形成三维结构，再进行傅立叶反变换即为实际空间中的物体三维结构。

综上所述，三种方法同时各自具有局限性。

晶体学方法对样品制备要求很高，很多蛋白质难以得到三维或二维晶体，对于膜蛋白和大质量的分子和复合体的结晶尤其困难，而且不同蛋白质的结晶条件很不同，摸索起来十分费时费力。

此外，获得高度有序的三维晶体对于解析它们的原子分辨率固然有利，但是在生理条件下蛋白质及核酸等生物大分子的结构是否完全与其在晶体状态中的一样，至今还是人们普遍关心的问题。

相位问题也是晶体学的一个难点。

核磁共振方法虽然可以精确解析溶液中的分子结构，避开了结晶的困难，也接近生理状态，但是它能解析的分子质量有限制。

三维电镜技术不需要结晶，没有相位问题，最新发展的冷冻制样技术使样品更好的保持在生理状态，且没有分子量限制，甚至细胞也可以进行三维重构。

虽然现阶段分辨率没有上面两种方法高，但是随着电镜设备本身的进步、制样技术的提高、图像处理技术的进步，分辨率水平正在不断提高中。

而且，可以将晶体分析和核磁共振得到的高分辨率单体和电镜技术得到的较低分辨率的分子复合体结合起来进行分析，研究分子相互作用及其分子的构像变化。

参考文献:
1． 赵南明，周海梦.2003.生物物理学.北京.高等教育出版社
2． 林克椿，吴本玠等.2004.医学生物物理学.北京.北京大学医学出版社
3． 程凌鹏,张景强.2004.伊蚊C6/36细胞浓核病毒三维重构的研究.广州:中山大学博士
学位论文
4． 隋森芳.2003.膜分子生物学.北京:高等教育出版社。