吴茱萸次碱抑制脂多糖诱导的BV2小胶质细胞炎症反应并改善神经炎症模型小鼠学习记忆功能损伤

第39卷第3期2 0 2 1年3月
中华中医药学刊
C H I N E S E A R C H I V E S O F T R A
D I T I O N A L C H I N
E S E M E D I C I N E
Vol. 39 No. 3
Mar. 2 0 2 1
D01：10. 13193/j. issn. 1673-7717.2021.03.028
吴茱萸次碱抑制脂多糖诱导的BV2小胶质细胞炎症反应 并改善神经炎症模型小鼠学习记忆功能损伤
胡蒙蒙，刘起发，臧小豪，胡錦荣，杜健堂，周渭
(广东工业大学，广东广州510000)
摘要：目的研究吴茱萸次碱（R u t)对脂多糖（L PS)诱导的B V2小肢质细胞炎症抑制作用与潜在机制及其对神经炎症模型小鼠的学习记忆能力损伤的缓解作用方法①实验采用9~1丨周C57雄性小鼠，腹腔注射脂多糖（lip^olysac- (.hari(le,LPS) 250 . k g-1来建立神经炎症模型.采用M orris水迷宫实验评价各组小鼠的空间学习记忆能力；采用尼氏染色法观察脑内海马和大脑皮层中神经元的形态和数量；采用ELISA法检测小鼠海马和皮层中相关炎性因子的含量②建立LPS诱导B V2小胶质细胞激活模型采用M TT法检测细胞存活率；Griess R eag en t法测定B V2细胞上清液中的一氧化氮（N O)的含量；定量PC R技术和E U S A检测liu t对促炎因子白细胞介素-i p(i n t e r l e u k i n-l p，I L-l p)、肿 瘤坏死因子-〇i( tumor necrosis factor -〇(，TNF - a)的影响.结果I But - H(0. 3 mg • kg_ 1)可改善腹腔注射L P S引起 的空间学习记忆能力的损伤（P <〇.〇丨），改善神经元形态和数量（P <0.001 )，降低海马和皮层中相关炎症因子I L-1(3 和T N F-a的水平（P cO.O O l) ②模型组上清中NO、IL -丨(J、TNF -c(的含量明显升高；吴茱萸次碱低剂量组（Rut - L，
0. 15 mg . kg — 1)、吴莱萸次碱高剂量组（R u t-H，0.3mg . kg」）上清中NO、I l,-i p、T N F-o t的含量明显下降。

结论吴
茱萸次碱可以缓解腹腔注射L P S引起的小鼠认知功能障碍、改善神经元形态和数量，减少神经炎症反应以及抑制LPS 诱导B V2小胶质细胞炎症反应。

关键词：认知功能障碍；脂多糖;神经炎症；BV2
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号= 1673-7717(2021 )034)11(M)8
Rutaecarpine Inhibits LPS - Induced Inflammation of Microglia BV2 Cells and Improves Learning
and Memory Impairment in Neuroinflammatory Mice
HU Mengmeng, LIU Qifa, ZANG Xiaohao, HU Jinrong, DU Jiantang, ZHOU Wei
(G uangdong U n iversity o f Technology, G u a n g z h o u510000, Guangdong,China)
N〇sX X diC\：Objective T o investigate the anti - inflammatory effects of rutaecarpine( Rut) and underlying mechanism by using lipopolysaccharide( L P S)-induced B V2 microglial cells as well as the effect and m e c h anism of Rut improving learning and m e m­ory impairment of neuroinflammatory model induced by LPS. Methods(I)The experiment used 9-11weeks C57male mice which were intraperitoneally injected L P S(250 (j i g * kg 1 )to induce neuroinflammatory model. T h e spatial learning and m e m o r y al)ility of the mice in each group were evaluated by Morris water maz e tests. Nissl Staining was used to observe the form and (juantity of brain neurons in the hippoc a m p u s and cortex. T h e contents of related inflammatory cytokine in the hippocampus and cortex were detected by using e n zyme linked immunosorbent assay. ©I n vitro neuroinflammation model was established with mi­croglial R V2 cells by L P S stimulation. M IT assay was used to evaluate the cell viability. T h e concentration of N O in cell super­natant was measured by Griess reagent. T h e effects of Kut on the proinflammatory factors interleukin - 1p( IL -1p)and tumor necrosis f a c t o r-a(T N F-a)were detected by quantitative P C R and ELISA. Results①T h e high concentration of R u t(0. 3 m g • kg 1 )could improve the cognition and m e m o r y lesion caused by intraperitoneal injection of L P S(P<0. 01 ) ,improve the morphology and n u m b e r of neurons(P<0. 001 )and reduce the levels of inflammatory cytokines IL - 1p and T N F-a in hippo-
c a m p u s an
d cortex( P<0• 001 ).②T h
e contents o
f IN O，IL - 1p and T N F-a in the culture supernatant of model group were sig-
nificantly increased. T h e contents of N O,IL - 1p and T N F - a in the culture supernatant of low -dose group( Rut -L, 0. 15 m g•kg 1)and high - dose group (Kut - H,0. 3 m g•kg 1)were significantly decreased. Conclusion Oral administration of Rut can alleviate the cognitive impairment of mice induced by intraperitoneal injection of L PS, probably clue to the neuroprotec­tion effect of Rut by d o w n -regulating neuroinflammatory response.
________Keywords ： cognitive dysfunction ； lipopolysaccharide ； neuroinflam m ation ； BV2
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金（81502911 )
作者简介:胡蒙蒙（丨993 -)，女，河南周口人，硕士研究生，研究方向：天然单体抗神经相关疾病药效学。

通讯作者:周渭（1987 -)，男，湖北荆州人，讲师，硕士研究生导师，博士，研究方向：神经炎症抑制剂的药物化学研究和老年痴呆症诊断试剂方面的 化学生物学研究。

E-niail:z丨丨ou_w ei@ g d u t. e(丨u. (.n:
110
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神经炎症即神经系统的炎症反应，由一系列的信号，包括 感染、外伤、毒性代谢物以及自免疫反应等都能引发神经炎症[1_3]。

神经炎症广泛参与了多种与认知功能障碍相关的中 枢系统疾病的发病过程，如阿尔茨海默病（AlzheimerS disease，AD)和帕金森症（Parkinson's disease),且大量研究表明神经炎 症参与调节了主要包括学习记忆能力在内的认知功能4_7'。

近年来，也有越来越多的临床研究表明，脑内炎症反应可能是 这些神经系统疾病重要的发病机制之一 。

因此，神经炎症对不同情况下的学习记忆功能有着重要的调节作用，探讨神 经炎症在这些认知功能中的作用对于这些神经退行性疾病的 治疗有一定的指导作用[^3]。

研究发现抗炎天然产物在预防和治疗神经炎症所诱发的 神经退行性疾病过程中发挥着越来越重要的作用14_17,且抗 神经炎症的天然产物来源广泛，主要分布于毛茛科、菊科、姜 科，唇形科等药用植物中；活性成分及结构具有多样性,主要包 括生物碱类、萜类、酚酸类、苯丙素类、黄酮类等化合物，这使得 天然产物成为了抗神经炎症的研究热点。

天然产物被认为是 研发抑制神经炎症所诱发的神经退行性疾病药物的丰富宝藏 |18_2〇]。

U I.-1P);酶联免疫吸附测定（E L1S A)试剂盒（江苏酶标生 物科技有限公司，批号分别为M B-2868B、M B-5737B);T R I
Reagent® (德国，S i g m a公司）；其余常规试剂均为分析纯。

1.4仪器
M u r r i s水迷宫仪器设备及记录软件（上海欣软科技有限公 司）；酶标仪（T e c a n Infinite M200 P r o,瑞士 T e c a n 公司）；焚光 显微镜（N i k o n Eclipse T h:2〇00, H本 N i k o n 公司）；包埋机（J B- P5,武汉俊杰电子有限公司）。

2方法
2.1动物分组、处理方法及模型制备
将所有实验小鼠(8〜9周）随机分为5组，每组8只。

分 别为空白对照组（Control)、神经炎症模型组（L P S)、阳性药物 组（几丨>488)、吴茱萸次碱低剂量组（如1-1,0.15>^.1{8-丨）、吴茱萸次碱高剂量组（R u t-H,0.3 m g •k g-1)。

实验的第1 ~ 7天，通过灌胃给药的方式，C o n t r o l和L P S给予0.9 %生理盐 水,T T P488组给予5 m g •k g-1的T T P488,其他每组给予相应 的化合物，连续2周；从第8天开始，除过C o n t r o l组外，其它各 组腹腔注射L P S(250 |x g •k g^)建立炎症模型，连续I周。

其 中吴茱萸次碱的低剂量和高剂量药物均用30%P E G 400配
天然产物吴茱萸为芸香科植物吴茱萸或疏毛吴茱萸的干 燥或将近成熟的果实，在吴茱萸汤、导气汤等多种方剂中均有 配伍，有散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻的功效211。

吴茱萸碱 和吴茱萸次碱是从中药吴茱萸中提取出来的化学单体，是其代 表性生物碱和主要有效成分，在抗高血压、抗癌、抗炎、抗血栓 等方面都具有较好的药理活性:22 ..其中，吴茱萸次碱可以缓 解炎症，改善A D样病理变化[23]。

因此，我们假设吴茱萸次碱 对神经炎症具有抑制作用,进而对神经炎症所诱发的记忆损伤 也有一定的缓解作用，故我们设计以下实验来探讨吴茱萸次碱 的抗神经炎症作用。

本研究从抗炎角度，以脂多糖（lip«p〇-lysaccharides,LPS)诱导小鼠神经炎症模型和BV2小胶质细胞 炎症模型为研究模型。

通过水迷宫、酶联免疫吸附试验(ELISA)、尼氏染色、N O检测、实时荧光定量核酸扩增检测系 统(QPCR)等检测方法在整体水平研究吴茱萸次碱是否改善 神经炎症诱发的学习记忆功能障碍的影响、调节海马和大脑皮 层炎性细胞因子白介素-1P(interleukin - 1p,II,-丨p)、肿瘤 坏死因-a(tumor necrosis fact〇ra,T N F- c〇的表达和改善神经 元损伤的作用以及吴茱萸次碱的抗炎潜在机制等，为神经炎症 相关神经系统疾病的预防和治疗提供理论与实验依据
1材料
1.1实验动物
C57小鼠,S P F级,体质量20〜22 g,由南方医科大学实验 动物中心提供，动物许可证号:S C X K(粤）2016 -00413小鼠词 养环境温度（23 ±2)^，湿度10% ±2%，自由饮食和饮水，每 日光照/黑暗时间分别为7 :00和19 :00>实验过程遵循本单 位实验动物伦理委员会相关规定。

1.2实验细胞制，T T P488在25 ^加去离子水搅拌配制，L P S用P B S配制。

图1吴茱萸次碱的化学结构式
给药
--------------
夺一 LPS
腹腔注射^4--------------1
<一Morris
水迷宫-4
-14 d -7d0d5d6d7d
Art(p.O) LPS(i.p.) 1|
m m脑组织
图2动物实验设计
2.1.1 M o r r i s水迷宫实验小鼠造模结束后，隔天开始Morris (Morris water m a z e)水迷宫实验。

M o r r i s水迷宫系统包含1个 直径为120 c m、高50 c m的圆形水槽，水槽内有1个直径8 r m、高34 «n救生平台，1个用来跟踪的摄像头和1台电脑。

圆形 水槽分为A.B、C、D4个象限。

实验前，在水槽外围帘子上（每 个象限对应的中央区域）贴上不同形状、不同颜色的图案（一 般为圆形、三角形、正方形），将水槽中注人水，使得水液面高
B V2小胶质细胞系购于国家细胞共享平台。

1.3药物与试剂
吴茱萸次碱（四川省维奇克生物科技有限公司，纯度為 98%,批号w k q丨7102511 )，结构式如图1所示；L P S(055:B5), 德国S i g m a公司；D M E M培养基（G i b c o);胎牛血清（G i b c o); N O化学法试剂盒（碧云天）；溴化噻唑蓝四氮唑（M T T);B C A (碧云天）；肿瘤坏死因子-〇1(1'1'^-〇〇;白细胞介素-10于救生平台I并加人少量白色素混合均匀使水呈乳白色,搜盖救生平台。

通过温度计监测水温，使水温维持在18 ~22 T。

实验时间为6 d,第1 ~4天为训练阶段。

实验时，将小鼠 依次从4个不同象限面向水池壁放人水池中，让小鼠自由游泳 寻找平台，同时记录小鼠找到平台所需的时间（即逃避潜伏 期）。

实验第5天，保持实验相关物品位置不变,将小鼠从平台 所在象限相对应的象限放人水槽,测定小鼠对前4天学习记忆
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能力=在实验的第6天，撤去救生平台和水槽周围的标记物，将小鼠从平台所在象限的对位象限放人水中，记录小鼠在60 s
内穿越原平台所在象限的次数、时间实验时保持安静，以减
少外界环境干扰所引起的实验误差。

2. 1.2 E L I S A检测小鼠大脑海马区和皮层区T N F-a和I L- 1P含量行为学实验（M o r r i s水迷宫）结束后，将小鼠快速断 头处死，取大脑海马区和皮层区配置成10%的匀浆液，-20弋保存24 h。

第2日，从冰箱中拿出解冻，反复3次来破坏细胞 膜。

5000 r_m i t T1离心5 m i n,取出上清液，按照E L1S A 试剂盒说明书检测匀浆上清液中l p、T N F-a的含量。

2. 1.3 尼氏染色检测小鼠大脑海马区和皮层区不同层次的病 变小鼠脑组织经过P B S灌流、多聚甲醛溶液固定和梯度蔗 糖溶液脱水后进行冰冻切片，之后进行甲苯胺蓝染色。

染色
后，二甲苯透明，中性树胶封片，在400 x的显微镜下拍照，保 存图片。

然后，每组选3张图片、每张图片中选择3个非重叠 的区域使用丨m a g e- Pro P l u s软件进行计数。

2.2细胞培养与处理
I3V2细胞株用含有10% F B S和1%双抗（链霉素和青霉 素）的D M E M培养液37丈、5%C02培养箱中培养，维持细胞 培养液的p H恒定在7.2 ~7.4,每2天传代1次。

将细胞分为 空白组（Control)、模型组（L P S)、不同浓度药物处理组（25、100、200 (jurml/L)。

L P S诱导建模的终浓度为 100 ng •m L-1。

2.2. 1M T T法检测细胞存活率 B V2细胞以5 x 104•m l，1的密度种于96孔板中，细胞接种24 h后，模型组用L P S诱导 炎症，药物组加入不同浓度的药物和L P S,同时处理细胞,24 h 后弃去上清，避光加人M T T(0.5 m g •m l")，在培养箱孵育4 h;弃上清，每孔加人150 g L D M S0,酶标仪检测吸光度（A57Q…m)。

2. 2. 2 Griess R e a g e n t法测定B V2细胞上清液中的N O B V2 细胞以1x l O6 •m L—1的密度种于96孔板中，细胞接种24 h 后，模型组用L P S诱导炎症，药物组加人不同浓度的药物和L P S，同时处理细胞，孵育24 h,取细胞培养上清，1000 r •m i n1离心15 m i n,仔细收集上清。

严格按N O试剂盒（硝酸还 原酶法）说明书操作，检测上清中N O含量。

2.2.3 E L I S A检测细胞上清中IL- 1p和T N F- a的表达
按照上述实验操作取细胞培养上清，1000 r •m i i T1离心15
m i n,仔细收集上清。

严格按照E L I S A试剂盒说明书操作，检测 细胞上清中IL- 1p、T N F- 〇t的含量。

2.2.4 Q P C R检测细胞中I L-l p和T N F-c x m R N A的表达
B V2细胞以2x l06 •m L1的密度种于6孔板中，待细胞贴壁 后，模型组用L P S诱导炎症，药物组加人不同浓度的药物和L P S,同时处理细胞，孵育24 h,弃去上清，P B S清洗。

按照 K N A提取试剂盒说明书提取细胞总R N A,按照Revert Aid firsl
L P S250 tig •kg-'
注：* * *与…)此0丨组比较,/><〇.〇〇丨；#与1^8组比较，/*<0.
图6海马和皮层中T N F
strand c D N A S y m h e s i s K i t反转录试剂盒说明书将细胞总R N A
逆转录为c D N A。

按照q P C R引物设计原则，设计引物，经验 证成功设计的基因序列见表丨。

样品在95弋下，预变性10 m i n。

P C R循环程序为95 T：,15 s—60 f O s,循环40次，每 个循环结束后进行荧光信号收集。

溶解曲线为75 95
每20 s升温1T。

每个样本设置3个复孔，取C t平均值进行 计算。

2.3统计学方法
实验数据以X表示，采用G r a p h p a d Prism6.0软件进行统计分析。

同一时间多组间比较采用单因素方差分析（o n e­
w a y A N O V A) ,P<0. 05 表示差异具有统计学意义。

表1基因序列
基因名称Forward引物序列Reverse引物序列
I L-1P5、G C A T C C A G C T T C A A A TC T C
G C-3，
5f-T G T T C A T C T C G G A G C C T G T
A G T G-3f
T N F-a5, -C C C T C A C A C T C A C A A A C C A
C C-3f
5' -C H T G A G A T C C A T G C C G T
T G G-3,
G A P D H5, -C C T C G T C C C G T A G A C A A A A
T G-3,
5, -T G A G G T C A A T G A A G G G G
TC G T-3,
3结果
3. 1K m对L P S诱导神经炎症模型小鼠空间学习记忆能力的 影响
本研究通过M o r r i s水迷宫系统考察吴茱萸次碱高低剂量 对L P S诱导的神经炎症小鼠记忆损伤和认知功能障碍的改善 作用。

如插页I X图3所示，随着训练时间的延长，各组小鼠的 逃避潜伏期有逐渐缩短的趋势,L P S组的小鼠逃避潜伏期与空 白对照组（Control)的小鼠相比明显延长，证明连续7 d、腹腔注 射L P S能显著降低小鼠的学习记忆能力,所建神经炎症模型具 有说服力;与L P S组相比，在实验的第5天时吴茱萸次碱高、低 剂量组均能有效缩短逃避潜伏期（P<〇.05,P< 0.01)。

插页K
图4中实验小鼠第5天的运动轨迹图也印证了这一结果。

在实 验的第6天，进行空间探索实验。

电脑自动追踪记录60 s小鼠 的运动轨迹和运动数据，统计小鼠在平台所在象限出现时间所 占总时间的百分比和出现在目标平台的次数。

实验结果表明，L P S组与Control组相比，在平台所在象限出现的时间的百分比 和出现的次数均较少，而给予吴茱萸次碱高剂量后有所增加(P< 〇. 01)，以上结果都表明了吴茱萸次碱在0.3 mg •k f1范围内能 够明显改善神经炎症小鼠的空间学习记忆能力。

见插页K图5。

3.2 K u t对L P S诱导神经炎症模型小鼠海马区和皮层区T N F-t x和I L- 1卩含量的影响
图6结果显示:无论是大脑皮层区，还是海马区,L P S组与
LPS 250 M g • kg-'
5;## 与 LPS 组比较,P< 0.01 ;### 与 LPS 组比较,？<0.001。

a和I L-l p的表达水平
+L P S 100 ng • m L _l
图9 K u t 对B V 2小胶质细胞存活率的影响
Rut
60-
注：* * *与control 组比较，/> <〇.〇〇丨；##与L P S 组比较，
尸< 0.01;### 与 L P S 组比较，P < 0.001。

图8实验小鼠海马和皮层中正常神经元的数目3.4
R u t 对B V
2细胞活性的影响
使用M T T 法检测吴茱萸次碱对B V 2细胞活性的影响，有
检测结果可知当吴茱萸次碱的浓度为0.1 ~ 100 junol /L 时， B V 2细胞活性都能达到90%以上，这可以认为再次浓度范围 内，吴茱萸次碱对B V 2的毒性可以忽略不计。

而当吴茱萸次 碱的浓度为100 ~ 200 j j u m I /L 时，B V 2细胞活性都能达到 80%以上，在此浓度下，对B V 2的活力产生了一定的影响。

为 了方便进一步验证药效，以及药效是否为剂量依赖，因此选择 25、100、200 p _m 〇l /L 作为R u t 的有效作用浓度，见图9。

因此 实验分组设置为空白对照组、L P S 组、L P S + R u t 组（R u t 浓度 为 25、100、200 p m o l /L )。

3.5 R u t 对L P S 诱导的B V 2细胞释放的N O 的影响
一氧化氮（Nitric O x i d e ,N O )分布在哺乳动物的组织内，特 别是神经元内。

大量的N O 能导致自由基损伤,参与神经炎症 过程诱导神经元凋亡和认知功能障碍。

图10结果显示：模型 组N O 释放量显著高于空白组（P < 0. 000 I );与模型组相比, R u t 剂量依赖性的抑制B V 2细胞中N O 的产生，且浓度在12.5 ~ 200 p m o l /L 时具有显著性差异。

由此说明R u t 的浓度 在12.5 ~ 200 p m o l /L 时，具有较好的抗神经炎症作用。

3.6
R u t 对B V
2小胶质细胞L P S 损伤后炎症因子释放的影响
定量P C R 结果表明，与空白组相比，模型组细胞内炎症因 子1匕，、丁呢-〇(111腿的表达显著升高（均/3<0.000 1); 与模型组相比，1^8 + 1^组（25、100叫〇1/1^)炎症因子比- i p 、T N F -a m R N A 的表达显著降低（均P c O .O O O 1)，见图11。

E L 1S A 法检测结果表明，L P S 刺激后，细胞分泌的T N
F _ a
L P S 100 n g • m L
"1
注：* * * *与rontro 丨组比较，P < 0. 000 1 ; #与L P S 组比 较,P <0.05;##与 LPS 组比较,P < 0.01;###与 LPS 组比较,P <
0.001。

图10 K u t 对L P S 诱导的B V 2细胞中INO 释放董的影响 与I L -l p
显著提高。

R u t 干预后，可极显著的降低T N F -a 及
I L -1P 的释放，药物处理组与L P S 模型组相比,存在极显著性 差异（P <0.000 1〉。

由以上结果可见，R u t 具有极好的抗神经 炎症作用。

4讨论
神经退行性疾病通常由异常的蛋白质积累和脑组织特定 区域神经元结构和功能的进行性缺陷导致的神经元死亡引起， 包括老年痴呆（Alzheimer's disease , A D )等^4-251，而A D 等神经 退行性疾病临床上主要表现为进行性的记忆减退和认知障碍。

近年来，越来越多的临床研究表明，冲经炎症广泛的参与到各 种神经退行性疾病中，与之密切相关[26_28)。

在神经炎症发病 机理中，错误折叠蛋白等形成寡聚体产生毒性物质，产生的神 经毒性，刺激小胶质细胞和星型胶质细胞，使得其大量活化，释 放肿瘤坏死因子-〇«(1'1^-«)、白细胞介素-10(比-丨0)等 炎症因子，一方面直接促进蛋白质的错误折叠和聚集，产生神 经毒性，诱导神经元凋亡,这对学习记忆和突触可塑性均有影 响;另一方面活化星型胶质细胞，进一步扩大炎症反应。

而后， 这些大量产生的毒性低聚体、活性氧和炎症因子，又将反过来
Control 组相比I L
- i p 的含量均较高，大约是正常组的2 ~4
倍，给予吴茱萸次碱高剂M 之后，海马体中I L -l p 的产生明显 减少(P < 0. 000 1),但是在大脑皮层区吴茱萸次碱低剂量组 却没有显著性差异的表现。

T N F - a 的产生M 相较于IL - 1 p 较少，但变化趋势与丨L - i p —致，且与对照组相比有显示性差 异。

这提示，吴茱萸次碱具有较好的抗神经炎症作用，且高剂 量组效果更佳。

3.3 R u t 对L P S 诱导神经炎症模型小鼠海马和皮层中神经元 的影响
插页X 图7和图8结果显示：与C ontrol 组相比，L P S 组的 小鼠海马和皮层区域的神经锥体细胞中的尼氏小体数目较少, 且着色较浅、细胞膜不完整且细胞核模糊：而Control 组的结 果却与之相反，在给予吴茱萸次碱高、低剂量后，神经细胞的尼 氏小体数目得到一定程度恢复，且着色较深、细胞膜完整、细胞 核清晰可见。

但高剂量的吴茱萸次碱组恢复程度更高（P < 〇. 〇1 )，说明吴茱萸次碱能通过抑制神经炎症，减少炎症因子的释放来降低神经元的损伤程度。

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学刊 V o 丨.39N 0.320 2 1 年3 月
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+L P S 100 ng • m L "115-i +L P S 1(H) ng • m L _,
40-
L P S 100 ng • m L _,
LPS 100 ng • mL 1
注：* * * * 与 contr…l 组比较，p <〇.〇〇〇 1 ;## 与 LPS 组比较，P < 0.01 ;#### 与 LPS 组比较，
0_000 1
图11 R u t 对L P S 诱导的B V 2细胞中T N F -a 和I L -6释放量的影响
作用于小胶质细胞，形成…个自身推进性的恶性循环29_3V : 因此研究可抑制小胶质细胞过度激活和有效防治神经炎症所 诱发的神经退行性疾病的药物具有重要意义。

天然产物以出色的抗炎优势和丰富来源使其在预防和治 疗神经炎症所诱发的神经行性疾病过程中发挥着越来越重要 的作用，也成为了抗神经炎症的研究热点[34_371。

这给了我们 启示，前期我们检索和整理文献，分析抗炎天然产物和改善记 忆的天然产物，甄选出一系列未被报道的能够改善记忆的且具 有抗炎活性的天然单体。

然后在L P S 诱导的神经炎症小鼠模 型中评价其记忆改善活性与体内抗神经炎症活性，结果发现吴 茱萸次碱在神经炎症模型上表现出出色的抗炎活性，因此此次 研究选择吴茱萸次碱
首先，本研究通过反复、连续向C 57小鼠腹腔注射L P S 建 立神经炎症动物模型。

首先我们运用M m r i s 水迷宫系统检测 小鼠的记忆和认知功能>_4°‘。

M o r r i s 水迷宫是心理学家M o r ­ris 上世纪 80 年代初设计的用来研究小鼠学习记忆的装置，它 是考察小鼠的学习记忆能力的经典行为学检测方法，1 ~4 d 为 定位航行实验，第5天空间探索实验，第6天可视平台实验。

通过实验可以发现，腹腔注射L P S 显著增加了小鼠空间学习 期的逃避潜伏期;测试期逃避潜伏期有延长的趋势，同时穿越 平台次数和目标象限停留时间有降低的趋势。

表明腹腔注射 L P S 可以使小鼠的学习和记忆能力明显下降，但这种影响时间 有限，在后续的练习当中不足以引起组间差异。

与模型组相
比，吴茱萸次碱可以缩短小鼠逃避潜伏期、增加穿越平台次数
和目标象限停留时间的趋势，而且这种作用随着R u t 浓度的增 力口，效果越显著。

为了进一步揭示小鼠行为学上的改变，我们观察神经元在 海马区和大脑皮层的形态改变。

通过对各组小鼠微观结构的 观察,L P S 组的小鼠海马和皮层区域的神经锥体细胞中的尼氏 小体数目较少，且着色较浅、细胞膜不完整且细胞核模糊。

而 Control 组的结果却与之相反，在给予吴茱萸次碱高、低剂量 后，神经细胞的尼氏小体数目得到一定程度恢复，且着色较深、 细胞膜完整、细胞核清晰可见，说明吴茱萸次碱对神经元有一 定的保护作用。

同时通过E U S A 检测海马和大脑皮层炎性细 胞因子水平，结果发现L P S 注射后小鼠海马和皮层T N F - a 和1(J 含量显著增高；而吴茱萸次碱治疗后，海马和皮层 T N F -a 和I L -l p 含量也有不同程度降低。

由此可见,腹腔注 射L P S 后可导致神经元损伤引起小鼠空间学习记忆障碍，同 时导致大量炎性细胞因子释放，而吴茱萸次碱对L P S 诱导神 经炎症小鼠受损的空间学习记忆能力具有一定程度的改善作 用，且显著的降低炎症因子T N F - a 和II . - I p 的含量。

接下来，利用L P S 刺激B V 2细胞，建立体外的神经炎症细 胞模型，使用Griess R e a g e n t 对细胞上清液中N O 的定量，使用 E L I S A 法检测细胞上清液中炎症因子T N F -a 、I L -丨(3的含 量。

结果表明：L P S (100 n g • m L —1 )作用于B V 2小胶质细胞，
N O
,II , - I p 、T N F - «含量均明显升高，而使用吴茱萸次碱能够
第39卷第3期 中华中医药学刊 Vol. 39 No. 32 0 2 1 年 3 月
C H I N E S E A R C H I V E S O F T R A
D I T I O N A L C H I N
E S E M E D I C I N E
Mar. 2 0 2 1
IL-ljl
TNF-a
I500-.
2.51
(1—lE
•
33/c a r l I
显著抑制L P S所诱导的神经炎症，剂量依赖性的抑制炎症相
关因子N0,I L-i p和T N K-a的释放，有效缓解L P S所导致
的神经炎症。

在R u t浓度为100〜200 ijunol/L时，抗炎效果较 高，结合毒性数据，可见1〇〇fJUiiol/L左右的剂量为其有效抗炎
浓度。

综上所述，吴茱萸次碱能够有效缓解神经炎症所致的学习
记忆能力的下降以及炎症因子的过度表达等。

这使其成为能
够有效缓解神经炎症诱发的神经退行性疾病的潜在先导物，为
抗神经炎症的天然单体的发现提供思路，也为天然产物来源的
治疗神经退行性疾病的药物的发现奠定基础。

相关机理的深
人研究有待我们进一步开展。

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