分子生物学实验

分子生物学实验
1. 幸免长时刻的培养，大年夜肠杆菌一样培养12个小时就能够挑取克隆子进行验证了。

主假如因为培养时刻过长，专门是含有Amp抗性的质粒。

重组菌能够或许渗出酶降解Amp，造成平板中局部Amp浓度太低。

其他未重组菌在Amp存在的情形下只是进展受克制而非逝世亡，当Amp浓度降低时就能够进展了。

卫星菌落，因为阳性菌落大年夜量分化抗生素，造成四周区域抗生素浓度降低，则无抗性的菌也进展出来了。

一句话，你的板子培养时刻过长了。

这是amp抗性质粒特有的卫星菌落，确实是又抗性的E col渗出beta内酰胺酶分化四周的amp，从而使没有抗性的e coli进展。

2.3.乙醇能够或许清除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团裸露出来。

Na＋之类的均衡离子能够或许与这些带电基联结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥感化。

是以只有在阳离子的量足以中和裸露的磷酸残基的电荷时才会产生乙醇沉淀。

1.什么缘故用无水乙醇沉淀DNA？
用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。

乙醇的长处是能够随便率性比和水相混溶，乙醇与核酸可不能起任何化学反响，对DNA专门安稳，是以是幻想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状况稳固存在，当参加乙醇时，乙醇会夺去DNA四周的水分子，使DNA掉水而易于聚合。

一样实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混淆，其乙醇的最终含量占67％阁下。

因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。

然则加95％的乙醇使总体积增大年夜，而DNA在溶液中有必定程度的消融，因而DNA损掉也增大年夜，专门用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。

折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步调要应用无水乙醇。

也能够用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。

一样在室温下放置15－30分钟即可。

2.在用乙醇沉淀DNA时，什么缘故必定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？
在pH为8阁下的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加必定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，削减DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当参加的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，如许就造成DNA沉淀不完全，当参加的盐溶液浓度太高时，其后果也不行。

在沉淀的DNA中，因为过多的盐杂质存在，阻碍DNA的酶切等反响，必须要进行洗涤或重沉淀。

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。

乙醇的长处是能够随便率性比和水相混溶，乙醇与核酸可不能起任何化学反响，对DNA专门安稳，是以是幻想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状况稳固存在，当参加乙醇时，乙醇会夺去DNA四周的水分子，使DNA掉水而易于聚合。

一样实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混淆，其乙醇的最终含量占67％阁下。

因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。

然则加95％的乙醇使总体积增大年夜，而DNA在溶液中有必定程度的消融，因而DNA损掉也增大年夜，专门用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。

折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步调要应用无水乙醇。

也能够用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。

一样在室温下放置15－30分钟即可。

1。

DNA不溶于乙醇
2。

乙醇能够吸附水分子（极性雷同），使得溶液中相对的水分子削减，增大年夜了DNA在水中的相对浓度。

3。

附：乙醇沉淀DNA须要盐离子，用金属离子樊篱DNA上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才能沉淀完全。

4.溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳喷鼻族氨，酸的比例较高，酶的活动中间是天冬氨酸和谷氨酸。

溶菌酶是一种专门感化于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地感化于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而掉去对细胞的爱护感化，最终使细菌消融逝世亡。

也能够直截了当破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的感化，这主假如因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主假如由胞壁质和磷酸质构成，个中胞壁质是由杂多糖和多肽构成的糖蛋白，这种多糖恰是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联络的。

对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大年夜肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。

溶菌酶是
母乳中能爱护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能经由过程消化道而保持其活性状况，溶菌酶还能够使婴儿肠道中大年夜肠杆菌削减，促进双歧杆菌的增长，还能够促进蛋白质的消化接收
5.酚、氯仿是变性蛋白质的（因为苯酚能溶进少量水损掉DNA，是以与氯仿一路应用，削减DNA损掉）
异戊醇是消泡剂（蛋白质变性中经常产朝气泡，会损掉DNA，是以需消泡）抽提DNA去除蛋白质时，如何应用酚与氯仿较好？酞与氯仿长短极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混应时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白掉去水合状况而变性。

经由离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大年夜，因而与水相分别，沉淀在水相下面，从而与消融在水相中的DNA分开。

而酚与氯仿有机溶剂比重更大年夜，储存在最基层。

作为别处变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的感化中，各有利弊，酚的变性感化大年夜，但酚与水相有必定程度的互溶，大年夜约10％～15％的水消融在酚相中，因而损掉了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性感化不如酚后果好，但氯仿与水不相混溶，可不能带走DNA。

因此在抽提过程中，混淆应用酚与氯仿后果最好。

经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，因为酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，现在一路将酚带走。

也能够在第二次抽提时，将酚与氯仿混淆（1:1）应用。

10．什么缘故用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混淆平均，必须猛烈振荡容器数次，这时在混淆液内易产朝气泡，气泡会阻拦互相间的充分感化。

参加异戊醇能降低分子别处张力，因此能削减抽提过程中的泡沫产生。

一样采取氯仿与异戊酵为24：1之比。

也可采取酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及基层有机溶剂相保持稳固。

1.酚/氯仿/异戊醇的感化：从核酸样品中除去蛋白质时经常应用酚和氯仿都能使蛋白质变性，并使其溶于有机相或中心相内，而异戊醇则有助于清除抽提过程中显现的气泡。

6.β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,幸免褐变,使酚轻易去除
7.
8.说得对。

75%乙醇清洗DNA的目标是脱盐的。

其机理如下：75%乙醇中含有25%的水，这部分水能够消融和DNA沉淀中混有的、DNA沉淀前参加的钾盐（或钠盐），但同时也会消融（损掉）少部分DNA（盐离子比DNA更易溶于水中）。

为了削减DNA损掉，因此用含量较高的乙醇溶液（DNA不溶于乙醇）。

蛋白质、糖、脂类等都能够溶于75%酒精，而DNA不溶
9.
10.RNase A的感化是使RNA降解，削减提取获得的DNA中的RNA，以便削减对后续实验的阻碍。

RNaseH 是一种逆转录酶。

消化mRNA用的。

RNase H，即Ribonuclease H，中文名为核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，能够特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。

RNase H不克不及水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不克不及消化单链或双链DNA或RNA。

特点：特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA，常用于cDNA第二链的合成
编辑本段用处
·在cDNA第二链合成前去除mRNA · DNA-RNA杂交体的剖断·在Oligo(dT) 存鄙人去除mRNA 的poly(A)尾
11.当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA产生变性，当参加中和液后，质粒DNA分子能够或许灵敏复性，呈消融状况，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

破细胞的主假如碱，而不是SDS，因此才叫碱法抽提。

0.2 N NaOH：是最佳的消融细胞的试剂，不管是大年夜肠杆菌照样哺乳动物细胞，碰着了碱都邑几乎在刹时就消融，这是因为细胞膜产生了从bilayer （双层膜）构造向micelle（微囊）构造的相变更所导致。

因为质粒和细菌染色体的拓扑构造不合，变性时前者因此两条链分别，却仍旧围绕蛮缠在一路不分开；但后者完全变性分甚至显现断裂。

是以，在裂解细菌时要留意：
第一，时刻不克不及过长，因为在如许的碱性前提下DNA片段会慢慢断裂；
第二，混淆必须轻柔，不然DNA也会断裂。

1% SDS（十二烷基磺酸钠）：是一种阴离子别处活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。

–12.这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，获得PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产
生的大年夜量沉淀天然就将绝大年夜部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共
沉淀。

当参加pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值复原较低的近中性水日
常平凡，质粒的两条小分子单链可灵敏复性复原双链构造，然则主染色体DNA则难以
复性。

–SDS碰到钾离子后变成十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是不溶于水的，而高浓度的盐使得沉淀更完全。

SDS极易和蛋白质结合，平均两个氨基
酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大年夜量沉淀天然就将绝大年夜部分蛋
白质沉淀了。

–同时，尽管SDS并不与DNA分子结合，因为大年夜肠杆菌的基因组DNA专门长，专门轻易和变性的蛋白质围绕蛮缠在一路。

在离心时，大年夜部分主染色体与细胞碎片，变性
蛋白质等围绕蛮缠一路被沉淀，而复性的质粒DNA以可溶性状况留在上清夜中。

13.所谓星活性又称Star活性。

是指因为反响前提不合而产生的割断与本来熟悉序列不合的位点的现象，也确实是说产生Star活性后，不只能够割断特异性的辨认位点，还能够割断非特异性的位点。

产生Star活性的成果是酶切条带增多。

因此说Star活性与粘端变平端没紧要。

别的，Star活性除了与酶本身的性质有关外，与甘油浓度，pH值及离子浓度有关。

一样正规厂家临盆的限制酶出厂前都做相干的检测，buffer体系也都做了响应的推敲。

是以正常情形下酶切，能够先不必推敲Star活性的问题。

一旦显现底物DNA不行割断，须要增长酶量或延长反响时刻时，假如应用的是易产生StaR活性的限制酶切，一样优先推敲增长酶量，而不是延长反响时刻，换句话说，延长时刻比增长酶量更易产生Star活性。

别的，实际上几乎所有的限制性内切酶都可能产生Star活性。

但今朝Star活性对实际实验室操作过程中的阻碍并不太大年夜，能够先不推敲。

一样来说，限制性内切存在严格的辨认在序列特异性，但某些前提改变，会使其对辨认序列特异性的放宽，而导致在DNA内产生附加切割，限制性内切酶表示的这种活性称为星活性，或第二活性，在名称右上角加一星号表示。

产生星活性的前提
①甘油浓度
②离子强度高盐缓冲液酶降低盐
③pH值 7.5～8．5产生
④有机溶剂 DMSO(二甲亚砜)1～2%(V/V)
⑤二价阳离子Mn2+代替Mg2+
⑥酶与DNA的比例
酶与DNA比为(50U／μg)产生星活性。

为了防止星活性的显现，所有限制性内切酶反响在标准前提下(专门是pH、离子强度、二价离子浓度的前提下)进行。

某些限制性内叨酶引诱产生星活性的反响前提
酶引诱星活性前提
AvaI A,B,D
EcoRI A,B,D,E,F
HaeⅢ B,D
HhaI B,D,G
BamHI A,B,C,D,E,H
A．乙二醇(45％)；B.甘油(11～20％)；C.乙醇(12％)；
D．高酶：DNA比值()25U／μg)；E．Mn2+代替Mg2+；
F．pH8．5；G．DMSO(8％)；H．无NaCl
14.同步双酶切是一种省时省力的常用方法。

选择能让两种酶同时感化的最佳缓冲液是专门重要的一步。

NEB每一种酶都随酶供给响应的最佳NEBuffer，以包管100%的酶活性。

NEBuffer的构成及内切酶在不合缓冲液中的活性见《内切酶在不合缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。

能在最大年夜程度上包管两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。

因为内切酶在非最佳缓冲液前提下的切割速度会减缓，是以应用时可依照每种酶在非最优缓冲液中的具体活性响应调剂酶量和反响时刻。

要包管双酶切实验的高效、精确，就要选择合适的通用buffer。

如许就能幸免质粒和基因没有切动或者被切散。

常用的几家内切酶公司有MBI、NEB、Promega、Roche、Takara，要查找双酶切体系的通用buffer，最好到出品该内切酶的公司网站上查询。

15. 缓冲液在电泳过程中的一个感化是保持合适的pH。

电泳时正极与负极都邑产生电解反响，正极产生的是氧化反响（4OH--4e->2H2O+O2)，负极产生的是还原反响（4H++4e->2H2)，长时刻的电泳将使正极变酸，负极变碱。

一个好的缓冲体系应有较强的缓冲才能，是溶液两极的pH保持全然不变。

电泳缓冲液的另一个感化是使溶液具有必定的导电性，以利于DNA分子的迁徙，例如，一样电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大年夜的电流使胶发烧甚至熔化。

电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，参加浓度为1-2mmol/L，目标是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。

16.
17.关于琼脂糖凝胶电泳，浓度平日在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大年夜片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。

低浓度胶易碎，当心操作和应用质量好的琼脂糖是解决方法。

留意高浓度的胶可能使分子大年夜小邻近的DNA带不易辨论，造成条带缺掉现象。

孔径大年夜的琼脂糖。

19.⑴、细胞的进展状况和密度
最好从-70℃或-20℃甘油储存的菌种中直截了当转接用于制备感触感染态细胞的菌液。

不要用差不多由多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。

细胞进展密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个阁下为佳。

即应用对数期或对数进展前期的细菌，可经由过程测定培养液的OD600操纵。

对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml阁下。

（应留意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不合而不合）。

密度过高或不足均会使转化率降低。

此外，受体细胞一样应是限制-润饰体系缺点的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

同时受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

⑵、质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主假如超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在必定范畴内成正比，但当参加的外源DNA的量过多或体积过大年夜时，则会使转化率降低。

一样地，DNA溶液的体积不该跨过感触感染态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感触感染态细胞达到饱和。

关于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大年夜的转化效力低，实验证实，大年夜于30kb的重组质粒将专门难进行转化。

此外，重组DNA分子的构型与转化效力也紧密相干，环状重组质粒的转化率较分子量雷同的线性重组质粒高10~100倍，是以重组DNA大年夜都构成环状双螺旋分子。

⑶、试剂的质量
所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯洁的水配制，最好分装储存于4℃。

⑷、防止杂菌和杂DNA的污染
全部操作过程均应在无菌前提下进行，所用器皿，如离心管，移液枪优等最好是新的，并经高压灭菌处理。

所有的试剂都要灭菌，且留意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，不然均会阻碍转化效力或杂DNA的转入。

⑸、全部操作均需在冰长进行，不克不及分开冰浴，不然细胞转化率将会降低。

20.TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，然则消融度大年夜，易于储存
TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大年夜，然则消融度小，不易经久储存，易产生沉淀
TAE与TBE的差别
起重要明白 TAE 與 TBE 緩衝溶液的成份如下：
50x TAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA)
242 gm Tris base
57.1 ml Acetic acid 100ml
0.5M EDTA
Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to 8.5.
10x TBE Buffer (Tris-Borate-EDTA)
108 gm Tris base
55 gm Boric acid
9.3 gm Na4EDTA
Add ddH2O to 1 liter.
The pH is 8.3 and requires no adjustment.
它們的分別有下列幾點：
1. TBE 不克不及太濃 (它只可有 10 times)，因為 borate 會专门轻易沉澱，但一样有少許沉澱是不會有太大年夜問題。

2. TBE 的 buffering capacity 比 TAE 高，用 TBE 來跑出來的 gel，辨论率 (resolution) 會比較高。

3. 因為 TBE 有 borate 離子 (ion)，它會影嚮酵素 (enzyme) 的工作。

是以，若要為分離出的 DNA 進行下一步酵素處理，如 cloning 或 restriction cut 的話，就要切記不要讓 DNA 碰上 borate ion。

4. TAE的 buffer capacity 比較差，gel 一样比較模糊，但它不會對影嚮酵素
三种缓冲液的配制方法
Tris-乙酸（TAE）：50×浓贮存液（每升）：
242g Tris 碱
57.1ml 冰乙酸
100ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)
应用时再稀释50倍。

Tris-磷酸（TPE）：10×浓贮存液（每升）：
108g Tris 碱
15.5ml 85％磷酸（1.679g /ml）
40ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)
应用时再稀释10倍。

Tris-硼酸（TBE）：5×浓贮存液（每升）：
54g Tris 碱
27.5g 硼酸
20ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)
21.标准的PCR反响体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混淆物各200umol/L 800ul
引物各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反响五要素：参加PCR反响的物质重要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
22. 1、推敲是否引物有问题，不特异；2、是否Taq酶加多了，一样50ul体系加1U Taq 就能够了；3、是否是Mg2＋加多了，Mg2＋加多了会造成非特异扩增；4、是否退火温度不行？5、是否轮回数过多，PCR扩增后期，进入平台期扩增，缺点扩增增长，非特异性也加强.
23.可能有如下缘故:
1, 模板量过低;
2, 引物浓度多大年夜;
3, 退火时刻过长.
4, 最重要的一点是,在引物设计过程中幸免引物间有互补序列,专门是3'末尾, 同时尽量使引物3'末尾的GC含量高一点,使与模板慎密结合.
做到以上各点,一样可不能显现引物二聚体了.
24.因为RNase能灵敏降解RNA，且耐热、耐酸、耐碱，不须要关心因子，用蛋白质变性剂只能使之临时掉活，变性剂去除后，其活性又可复原。

是以，分别提取RNA时，为确保RNA的完全性，必须制造一个无RNase的情形，操作时应专门留意以下几个方面：
1．操作者在全部实验过程中必须戴消毒手套和口罩，并经常改换。

2．玻璃器皿冲刷洁净后，需180~250℃干烤4小时以上。

3．尽可能应用一次性塑料成品(Ep管、吸优等)，用0.1%DEPC溶液浸泡住宿，80℃烤干后高压灭菌。

4．电泳槽冲刷洁净后，于3%H2O2中浸泡30分钟以上，然后用0.1%DEPC溶液或高压灭菌水完全冲刷。

5．除Tris类试剂外，所有溶液用0.1%DEPC处理12小时以上，然后高压消毒。

所用试剂应未开封或RNA专用试剂。

6．应用强烈、有效的RNase克制剂以克制内源RNase。

常用的RNase克制剂有异硫氰酸胍（GTC）、氧钒核糖核苷复合物（VRC）、RNasin及焦碳酸二乙酯（DEPC）等。

评判RNA质量的标准是RNA的均一性和完全性。

均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完全的RNA则取决于最大年夜限度地幸免纯化过程中内源性及外源性RNase对RNA的降解。

平日采取紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA 的A260/A280=2.0，但因为所用的标本不合，此比值有必定的变更，一样在1.7~2.0之间，低于该值注解有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。

有时样本的
A260/A280可能大年夜于2.0，如反复读数无误，并不表示纯度有问题。

RNA的完全性可经由过程琼脂糖电泳法进行剖断。

完全的RNA电泳时，28S（约4.8Kb）和18S（约1.9Kb）rRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。

25.RNA提取提取RNA能够分为总RNA，mRNA，Virus RNA（RNA病毒）几类Trizol即异硫氰酸胍-苯酚法，这种方法的道理是：起首用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，开释出核酸。

开释出来的DNA和RNA因为在特定pH时消融度不合，分别位于全部别系中的中心相和水相，从而使DNA和RNA分别开来。

进一步经由过程有机溶剂来抽提沉淀RNA，就能够获得纯洁的RNA；
26.
27.一、防止RNA酶污染的方法
1. 所有的玻璃器皿均应在应用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时刻。

2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲刷（留意：有机玻璃器具因可被氯仿腐化，故不克不及应用）。

3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲刷，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲刷，晾干。

4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不克不及高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。

6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

二、常用的RNA酶克制剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不完全的RNA酶克制剂。

它经由过程和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而克制酶的活性。

2. 异硫氰酸胍：今朝被认为是最有效的RNA酶克制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶掉活。

它既可破坏细胞构造使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性感化。

3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全克制RNA酶的活性。

4. RNA酶的蛋白克制剂（RNasin）：从大年夜鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。

RNasin是RNA酶的一种非竞争性克制剂，能够和多种RNA酶结合，使其掉活。

5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有必定克制造用。

28.
29。

配1000ml的DEPC处理水，加1mlDEPC。

磁力搅拌器搅拌住宿。

翌日高压蒸汽灭菌 121c，25min DEPC分化成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。

最好分装小瓶来用，尽量幸免污染。

DEPC水是用
DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。

经检测不含RNase、DNase和proteinase。

DEPC水能够用于RNA沉淀的消融，含有RNA的各类反响体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各类要求无RNase、DNase和proteinase的反响体系。

DEPC水一样是指千分之一浓度的DEPC,在搅拌器上搅拌至完全消融，即看不到“油珠”为止，用来处理枪头、EP管的DEPC水不需高压灭活，而用于配制DEPC酒精等试剂和用来这种RNA相干实验的DEPC水需灭火后应用。

DEPC气味芳喷鼻浓烈，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作。

方法是：取市售DEPC 1ml，参加1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分化为CO2和乙醇）。

有些试剂可直截了当参加DEPC，终浓度一样为0.1%～0.4%，原则上在杂交及其往常的步调中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包含乙醇的稀释。

此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。

留意：①DEPC是潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的前提下进行，并幸免接触皮肤。

②含有Tris 缓冲液的溶液中，不克不及参加DEPC。

去离子纯清水参加DEPC达浓度0.1%，室温下连续搅拌住宿，分瓶包装后湿热高压灭菌完全挥发去除DEPC 后能够经久储存在室温或4度冰箱，不宜反复应用。

30.
31.非变性凝胶里面没加变性剂，一样是SDS。

非变性胶跑出来的蛋白能保持其活性一样用做功能实验，如EMSA。

因为没有变性剂的缘故非变性胶电泳时除了与蛋白分子量有关也会受都电荷的阻碍，是以对蛋白等电点切实事实上定懈弛冲液的酸碱性有留意，有时须要倒转电泳时的正负极。

从跑的胶来看，变性胶会比较好看，带比较窄，非变性胶跑出来则比较粗拙。

32.[1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸消融，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。

[2]等胶凝固后，去掉落梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。

[3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺
10ml。

[4]55℃加热15min，冰浴冷却。

[5]加2ml5×载样缓冲液。

[6]上样、同时加RNA标记物（同位。