PCR体系优化

PCR体系优化
由于Taq DNA聚合酶是目前PCR反应体系中应用最广泛的酶，因此此文主要讨论使用该
酶的PCR反应体系。

A镁离子浓度
镁离子是热稳定DNA聚合酶的辅因子，其浓度对PCR至关重要。

模板DNA的浓度，鳌合物（如EDTA和柠檬酸盐）、dNTP浓度和蛋白都会影响反应体系中游离镁离子的量。

如果游离的镁离子含量不够，那么Taq DNA聚合酶则无法行使功能（figurel）。

过多的游离镁离子则会降低酶的保真度，可能会增加非特异性扩增。

因此，研究者应当根据实际的实验结果来
优化每一反应中镁离子的浓度。

可以用一系列的镁离子浓度梯度来验证，镁离子浓度范围为
1~4mM每次增加或降低 0.5~1 mM扩增产量最高，非特异性产物最低时的镁离子浓度即为最优。

最优镁离子的浓度范围跟DNA聚合酶的类型相关，例如， Pfu DNA聚合酶似乎对镁离
子的依赖性更低，但其优化范围通常为2~6mM
许多DNA聚合酶产品提供 Mg-free reaction buffer和单独一管25mMMgCl2，这样就可以自行调节Mg+浓度，优化反应体系。

MgC2溶液在反复冻融后会出现浓度分层，为获得均
一的溶液，在配液的时候，要确保MgCb溶液完全溶解并充分震荡混匀。

非常简单的两步，
溶解和混匀，常常会造成实验失败。

有些科学家倾向于使用包含MgCb的buffer , MgC2的终浓度为1.5mM。

值得注意的是有
文献报道发现使用此类buffer的结果并不稳定，有时体系内游离镁离子的浓度会有0.6mM 的变化，如果在90C加热10min，则结果趋于稳定，因此作者假设反复冻融的buffer中MgCb
可能会有沉淀现象发生。

M12345678
2.645
1.605
1.198-
0 0.5 10 1.5 2,0 2.5 3,0 3.5
Figure 1.镁离子浓度对PCR扩增的影响。

用不同浓度Mg 2+测试，产物大小为1.8kb
琼脂糖凝胶电泳，EB染色泳道M为MAKER;Lane 1, 0mMMg2+ ; Lane 2, 0.5mMMg2+ ;Lane
3, 1mM Mg 2+ ; Lane 4, 1.5mM Mg 2+ ; Lane 5, 2mM Mg 2+ ; Lane6, 2.5mM Mg 2+ ; Lane
7, 3mM Mg 2+ and Lane 8, 3.5mM Mg 2+
B Buffer 缓冲液
大多数 Buffer 里含有一种缓冲试剂，多数为基于 Tris 的缓试剂。

此外还有盐类，通常为KCL 缓冲试剂调节反应体系的pH值，pH值会影响DNA聚合酶的活性和保真度。

与不添
加KCL的比，适量的KCL能够增加50~60%DN骤合酶的活性。

一般来说，KCL浓度为50mM。

C 酶浓度
我们推荐（promega的科研人员）在50微升体系中使用1-1.25units Taq DNA聚合酶。

多数情况下，这些酶是过量的，再添加酶并不能显著提高产物量。

事实上，酶量不断升高会增加Taq DNA聚合酶5'宀3'外切酶活性，跑胶的时候会观察到弥散的条带。

想要准确吸取少量的含50%甘油的酶溶液是非常困难的，因此建议一次配置大量的预混
液，这样酶的加量便会很大，减少误差。

D PCR 引物设计
引物决定扩增区域和扩增子的大小，引物长度一般在15~30bp。

理想状态下的引物其 GC
含量应该在40~60%避免在引物3端出现三个连续的 G或C以减
少非特异性结合。

还要避免自身或者引物间互补，以降低引物二聚体。

引物自身二级机构干扰退火时引物与模板的结合。

正反向两条引物之间Tm值相差不超过5 C,以便两条引物在同一退火温度下拥有相似的扩增效率。

可以在引物上添加其他用途的序列，比如在5'端添加酶切位点序列，方便下一
步的克隆，或者添加T7 RNA聚合酶启动子，以便进行体外转录。

实际应用中会发现不同软件给出的Tm值不同，同一软件不同参数得出的Tm值也不同。

不必纠结于此，只需要使用同一个软件统一参数去评估一个项目中所用的引物就好，Tm值
只是一个相对的标准，不论哪种软件只要你的所有引物都在一个标准体系内评定，不会影响
后续实验的分析。

就好比你带两块表反而不知道具体时间，只需要有一个标准参考体系即可。

E 模板质量
扩增依赖DNA模板的数量和质量。

核酸纯化过程中经常使用的试剂（盐类、胍、蛋白酶、有机溶液和SDS是潜在的DNA聚合酶抑制剂。

例如0.01% SDS会导致90% Taq DNA聚合酶活性被抑制，而0.1% SDS则会抑制99.9%的Taq DNA聚合酶活性。

其他PCR抑制剂有苯酚、肝素、二甲苯蓝、。