肉鸡中魏斯菌属细菌的分离与鉴定

鸡肉中魏斯菌属细菌的分离与鉴定
纪淑娟1，李丽1，王金玲2*
(1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110161；2. 沈阳市进出境检验检疫局，辽宁沈阳 110016)
摘要：从沈阳某养鸡场抽取病死鸡在无菌条件下采集样品10份，微需氧条件下进行细菌分离纯化，比对魏斯菌属的基本形态和革兰氏染色特点，得到与魏斯菌属类似菌株13株。

采用16SrDNA基因测序方法对分离出的细菌进行基因序列分析。

在NCBI网站用BLAST软件在GenBank上进行同源性比较，比对结果表明编号为X1001，X1002，X1006，X1008，X1009的株菌同源性达90%。

生化实验结果表明，X1006号菌株为魏斯菌属中的融合魏斯菌属。

关键词：肉鸡；魏斯菌属细菌；分离；鉴定；基因测序
中图分类号：Q93-331 文献标识码：A
Isolation and identification of weissella from the chicken
JI Shu-juan1, LI li1，WANG Jin-ling 2*
(1.College of Food Science，Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161,China;
2. Shenyang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenyang 110016, China)
Abstract:10 samples of dead chickens were drown at sterile conditions from farms in Shenyang. The bacterials for each sample were isolated and purified at micro-aerobic conditions. As a result 13 strains of bacterial derived were preliminary determined as Weissella by comparison with the characteristics of Weissella. The 16SrDNA gene sequencing detected by PCR showed that the strain namely (X1001 X1002 X1006 X1008 X1009) had highly consanguinity with Weissella. Its consanguinity reached 90%. The rusults of biochemical experiment indicated that X1006 strain posses the characteristics of fusion Weissella. Therefore it can be fusion Weissella. Keywords：chicken；weissella；isolation；identification；gene sequence
微需氧菌（microaerophilic bacterium）是一类在空气中和厌氧环境中均不生长，只能在含一定浓度二氧化碳（5%～10%）和低浓度氧气（5%左右）条件下生长的细菌。

近年来微需氧菌引起的人畜共患病害已受到国内外的广泛关注，其中，对空肠弯曲菌和幽门螺杆菌的研究报道较多。

魏斯菌属细菌是一类属乳酸菌群的间性厌氧菌或微需氧菌，36℃、CO2浓度在10%的条件下生长良好，触酶阴性，对万古霉素耐药，分解葡萄糖产生CO2，是不产生吡咯烷酮芳胺酶、亮氨酸氨基肽酶的革兰阳性球菌或球杆菌[1]。

至今为止，从不同来源分离的魏斯菌主要有2个种，即食物魏斯菌和融合魏斯菌。

食物魏斯菌广泛分布于发酵食物（如腊肠、泡菜）、土壤等，目前已经从不同来源分离出18株，其中，8株分离于马来群岛的“chiliBo”；2株分离于“Tapai”；3株分离于比利时狗耳(耳炎)；1株分离于比利时金丝雀的肝脏；1株分离于瑞典人的胆汁；1株分离于比利时人的粪便；在甘蔗和奶酪中各分离出1株[4]。

据报道，融合魏斯菌分离于甘蔗,胡萝卜汁,偶尔分离于鲜奶和污水中,并可引起人类的多种感染，如人类的菌血症、心内膜炎等[2-4]。

由于动物源性感染是近年来食源性感染的最为主要的感染途径之一，因此，从动物体内分离鉴定魏斯菌，并对其进行深入研究具有十分重要的意义。

本试验以病死鸡体作为采样原，在微需氧条件下进行细菌分离，根据菌的形态和革兰氏染色特性，并利用16SrDNA基因测序和生理生化鉴定方法，分离鉴定出魏斯菌属。

该研究结果为进一步深入研究魏斯菌属的特性、污染途径、安全性评价、制定相应的标准和污染控制技术奠定一定的基础。

1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
凝胶成像系统GDS-8000，美国UVP；基因测序分析仪ABI3130，美国AB公司；梯度PCR仪，美国伯乐公司；CO2培养箱，美国NUAIRE公司；核酸蛋白测定仪，德国艾本德公司；低温高速离心机，德国贺利氏公司。

琼脂糖、细菌基因组DNA提取试剂盒、16SrDNA PCR 扩增试剂盒、100bp DNA ladder marker 和DL2000 DNA marker大连宝生物有限公司；营养琼脂、营养肉汤、血琼脂基础北京路桥技术有限责任公司。

1.2 样品采集及细菌的分离与纯化
1.2.1 样品的采集
从沈阳某养鸡场采集的病死鸡样品。

1.2.2 细菌的分离与纯化
采集鸡体样品包括鸡体的肌肉组织和内脏，样品在营养肉汤微需氧条件下培养后无菌接种于鲜血琼脂培养基，36℃CO2培养箱培养24h，获得单菌落后、革兰氏染色镜检，纯菌转接于营养肉汤进行冻干保藏，备用，杂菌划线于鲜血琼脂培养基上继续分离纯化。

1.3细菌的16S rDNA PCR测序鉴定
1.3.1 PCR模板的制备
将冻干的细菌转接到营养肉汤中，36℃ CO2培养箱增菌培养24h，增菌后的细菌增菌液用细菌基因组DNA提取试剂盒进行细菌基因组DNA提取，用1%琼脂糖电泳检测其纯度及大小。

提取的细菌基因组DNA作为PCR扩增反应的模版。

1.3.2 16S rDNA PCR反应体系与反应条件
16S rDNA PCR反应体系（50μL）：模板DNA 1μL；PCR Premix 25μL；Forward Primer与Reverse Primer （浓度20pmol/μL）各0.5μL；16s-free H2O 23μL；阴性对照以1μL 16s-free H2O替代模板DNA；阳性对照取1μL Positive Control DNA作为模板。

PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 1 min；55℃ 1min；72℃ 1.5min；72℃ 5min；30个循环。

取扩增产物5μL进行2%琼脂糖电泳后切胶回收。

1.3.3 PCR产物的测序
将扩增后的PCR产物进行纯化，纯化产物用BigDye基因测序试剂盒进行试剂添加，用ABI 3130基因测序仪测定其序列。

测定的序列在NCBI网站用BLAST软件在GenBank进行同源性比较。

2结果与分析
2.1菌株的分离
采集的鸡体样品经微需氧条件培养分离与纯化，将菌株革兰氏染色，镜检的结果与魏斯菌属的形态染色特性进行比对，挑选出13株可疑菌株，编号为：X1001～X1013。

13株菌的基本形态和革兰氏染色结果如表1所示。

可见，分离出的13株菌均为革兰氏阳性菌、无鞭毛、无芽孢，呈短杆形、球形和类球形。

blast比对同源性达到90%以上的5株菌的镜检结果如图1所示。

表1 13株菌的形态特性和革兰氏染色结果
Table 1 The morphological characteristics and Gram staining for13 strains
菌株编号形态特性革兰氏染色
X1001;X1005;X1006;X1009 短杆菌,无鞭毛，无动力，不形成芽孢阳性
X1002;X1007;X1010;X1012;X1013 球菌,无鞭毛，无动力，不形成芽孢阳性
X1003;X1004 ;X1008;X1011 类球菌，无鞭毛，无动力，不形成芽孢阳性
X1001号菌株
X1002号菌株
X1006号菌株
X1008号菌株
X1009号菌株
图1 blast同源性达90%以上的菌株镜检图片
Fig.1 Strains of the anti-bma pictures allogenic 90%.
2.2细菌基因组DNA的提取及16S rDNA扩增结果
提取13株微需氧菌基因组DNA，进行PCR反应扩增，取扩增产物5μL进行2%琼脂糖电泳。

电泳结果如图2所示。

电泳结果可见，实验菌株除X1011和X1012外，其他均扩增得到1600bp长度片段大小的扩增产物。

-+ 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M
注：M：Marker 100bp；1～13：X1001～X1013 16SrDNA基因扩增产物；＋：以Positive Control DNA 作为
模板的阳性对照；－：以16s-free H2O替代模板DNA作为阴性对照。

图2 13株菌的16SrDNA基因PCR扩增反应结果
Fig.2 Amplification results of 13 strains 16SrDNA gene by PCR
2.3 16S rDNA基因序列分析
l1株菌的16S rDNA基因测序结果，在NCBI上进行blast同源性搜索结果见表2。

表2 l1株菌16S rDNA基因序列的Blast比对结果
Table 2 Comparison of 16S rDNA gene sequence for l1 strains with GenBank
菌株登录号最相似菌株长度覆盖率/
%
同源性/%
X1001 GQ383925.2 Flavobacteriaceae bacterium XJ109 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
911 99 92
X1002 FM955885.1 Acinetobacter sp. Asd MZL2 16S rRNA
gene, strain Asd MZL2
1260 95 93
X1003 EU869294.1 Weissella sp. RT-2Br 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
636 66 85
X1004 GQ383925.2 Flavobacteriaceae bacterium XJ109 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
532 69 81
X1005 EU869294.1 Weissella sp. RT-2Br 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
976 95 88 X1006 EU869294.1 Weissella sp. RT-2Br 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
843 69 90
X1007 GQ069742.1 Uncultured bacterium clone nbw232e06c1
16S ribosomal RNA gene
501 56 84 X1008 AM232808.1 Empedobacter sp.F-Fue-04TIIa partial 16S
rRNA gene, isolate F-Fue-04TIIa
828 99 90
X1009 FM955885.1 Acinetobacter sp. Asd MZL2 16S rRNA
gene, strain Asd MZL2
1260 95 93 X1010 EU841965.1 Uncultured bacterium clone gra084 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
586 66 84
X1011 FJ960149.1 Uncultured bacterium clone D9A4_035 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
333 52 79
可知，在所测试的11株菌中，同源性在90%以上的有5株菌，它们分别是X1001、X1002、X1006、X1008、X1009。

2.4 确证实验结果
为了进一步验证鉴定结果，依据《伯杰细菌鉴定手册》对魏斯菌属的鉴定方法，对X1001、X1002、X1006、X1008、X1009号菌株进一步进行了生理生化确证试验，结果如表3所示。

表3 X1006号菌株魏斯菌属的确证实验
Table 3 Confirmation experiment of X1006 strains
菌株号试剂种类
过氧化氢酶万古霉素
葡萄糖（产气）
生化管吡咯烷酮芳胺酶
（PYR）
亮氨酸氨基肽
酶(LAP)
X1001 ＋耐药－－－X1002 ＋不耐药＋－－X1006 －耐药＋－－
X1008 ＋耐药－－－
X1009 ＋不耐药＋－－
注：90%或更多的菌株阳性；90%或更多的菌株阴性。

表3表明，X1006号菌株的生化特性与魏斯菌属相符，因此，确认该菌株为魏斯菌属细菌。

据报道，魏斯菌属至少由12个菌种组成，菌种的鉴定是一个复杂的过程。

本试验尝试了通过生理生化特性对X1006号菌株进行魏斯菌属种的鉴定。

试验结果见表4。

表4 X1006号菌株的生理生化鉴定结果
Table 4 Further identification of X1006 strains by physiological and biochemical characteristics
生化试剂特征
L-阿拉伯糖－
纤维二糖＋
半乳糖＋
麦芽糖＋
蜜二糖－
D-棉子糖－
核糖＋
蔗糖＋
海藻糖－
D-木糖＋
果糖＋
水杨苷＋
七叶苷＋
精氨酸水解＋
葡聚糖＋
注：＋，90%或更多的菌株阳性；－，90%或更多的菌株阴性
试验结果表明，本试验分离出的X1006号菌的生理生化特性与融合魏斯菌相符，因此，判断该菌为融合魏斯菌。

3 结论
鸡体样品经微需氧条件培养分离纯化、革兰氏染色和形态特征观察，初步分离出13株疑似魏斯菌属的菌株。

其中，有11株菌的DNA经PCR反应得到了特异性扩增。

16S rDNA序列分析结果表明，编号为X1001，X1002，X1006，X1008，X1009的菌株的同源性达90%，X1006号菌株的生化特性与魏斯菌属相符，因此，确定该株菌为魏斯菌属。

进一步的生化试验结果表明，X1006号菌株具备了精氨酸阳性反应等融合魏斯菌的基本特征，因此初步判断该菌株为融合魏斯菌。

这一研究结果将为开展融合魏斯菌的传播途径及其控制技术等研究工作提供参考。

参考文献
[1] 凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京，中国轻工业出版社，1999：58-60.
[2]Olano A，Chua J，Schroeder S，et al．Weissella confuse (basonym:Lactobacillus confuses) bacteremia: a case repore．J Clin Microbol,2001,39(4):1604-1607.
[3] Flaherty JD,LevettPN，Dewhirst FE,et al.Fatal case of endocarditis due to Weissella confuse. J Clin Microbiol,2003,41(5):2237-2239.
[4] Bjorkroth KJ,Schillinger U,Geisen R,et al．Taxonomic study of Weissella confuse and description of Weissella cibaria sp．Nov.,detected in food and clinical samples．Int J Syst Evol Microbiol,2002,52((Pt 1):141-148.
[5]李中华,段雄波.魏斯菌属细菌的分类与鉴定新进展[J].国际检验医学杂志，2006,27(8):721-723.
[6]鲁杏华,何世成,谈志祥,等.猪化脓隐秘杆菌的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医,2009,36(5):149-151.
[7]宋长芹,黄海岩,宋立清,等.16SrDNA检测在口腔厌氧菌鉴定中的应用[J].预防医学论坛,2010,16(3):202-204.
[8]丁君,李娇,王美庆,等.利用16SrDNA 方法检测刺参消化道细菌种类[J]．海洋环境科学,2010,29(2):250-254.
[9]管宇,沈志强,刘吉山,等. 应用16S rRNA基因测序法鉴定禽多杀性巴氏杆菌的研究[J]．中国预防兽医学报,2003,25(5):349-352.
[10]张辉．鸡肉食品中LMO的分离鉴定与PCR方法检测[D]．吉林：吉林农业大学，2004．
[11]肖开提，阿依吐拉.肉孜,白军民.熊克雷伯氏菌病的病原分离鉴定[J].中国兽医杂志，2007,43(12):61-62.
[12] Choi HJ,Cheigh Cl,Kim SB,et al.Weissella kimchii sp.nov.,a novel lactic acid bacterium from kimchi.Int J Syst Evol Microbiol,2002,52(Pt 2):507-511.
[13] Magnusson J,Jonsson H,Schnurer J,et al. Weissella soil sp. Nov.,a lactic acid bacterium isolated from soil. Int J Syst Evol Microbiol,2002,52(Pt 3):831-834.
[14] Lee JS,Lee KC,Ahn JS,et al.Weissella koreensis sp. Nov.,isolated from kimchi. Int J Syst Evol Microbiol,2002,52(Pt 4):1257-1261.
[15]王成义，闫茂仓，陈少波，等. 基于1 6S rRNA和recA香鱼鳗利斯顿氏菌的分离鉴定[J].海洋通报，2010,29(1):84-90.
[16]薛占永，呼秀智，林德贵. 犬脓皮病病原菌的分离鉴定[J].中国兽医杂志，2009,45(4):63-64.。