敲除SOCS1a引起斑马鱼肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗

分类号
学号 D********* 学校代码10487
密级
博士学位论文
敲除SOCS1a 引起斑马鱼
肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗
学位申请人： 戴梓茹
学科专业：生物化学与分子生物学
指导教师：刘木根教授 殷战研究员
答辩日期：2015年05月10日
Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Biochemistry and Molecular Biology
Depletion of Suppressor of Cytokine Signaling-1a Causes Hepatic Steatosis and Insulin Resistance in
Zebrafish
Ph.D.Candidate: Ziru Dai
Major: Biochemistry and Molecular Biology
Supervisor: Prof. Mugen Liu Prof. Zhan Yin
HuazhongUniversity of Science and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R. China,
May, 2015
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。

对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

学位论文作者签名：
日期：年月日
学位论文版权使用授权书
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本论文属于
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学位论文作者签名：指导教师签名：
日期：年月日日期：年月日
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摘要
酪氨酸激酶-信号转导子和转录激活子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信号通路是通过激活各种生理过程的多个关键信号级联反应来调节胞外信号的核心传输系统之一。

最新研究表明，细胞因子信号传导抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）家族蛋白能通过形成负反馈回路抑制JAK/STAT信号通路。

SOCS蛋白家族是一类负反馈调节蛋白，参与调控多种细胞因子介导的信号通路。

稳定遗传小鼠模型的研究阐明了SOCS家族中的几个成员的不同生理功能。

其中，SOCS1参与调控干扰素γ（interferon γ，IFNγ）和泌乳素信号通路，而SOCS3则主要调节白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）信号通路和胎盘的发育。

研究发现小鼠SOCS2突变体出现体型显著增大的表型，表明了SOCS2参与调节GH信号通路。

此外，越来越多的证据表明，SOCS蛋白对胰岛素通路有调节作用。

机体生长是一个依赖于GH信号通路并被严密控制的过程。

关于GH对出生后促生长的影响包括对脂类、葡萄糖以及氨基酸的代谢的影响的研究还不清楚。

在哺乳动物中，GH通过激活JAK2/STAT5 通路而大范围的转录活化下游靶基因，包括胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factor-I，IGF-I）、抗细胞凋亡基因和SOCS2。

胰岛素是由胰腺产生的一种多肽类激素，它能促进其他组织从血液中吸收葡萄糖和促进供能脂类的储存。

一般而言，GH也通过抵抗胰岛素对糖的作用和脂肪代谢而影响胰岛素信号通路。

在哺乳动物模型中，长期的GH超量表达可能会增加肝糖产量和存储的甘油三酯，从而导致胰岛素抵抗作用。

斑马鱼（Danio rerio）SOCS家族至少有12个成员。

斑马鱼SOCS1a基因在肝脏中表达量较高。

脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）或聚肌胞:多聚核苷酸（polyinosinic:polycytidylic acid，poly I:C）可诱导斑马鱼中SOCS1a的表达，这表明SOCS1a可能是IFN通路的抑制因子。

研究发现，在GH或生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）过量表达的斑马鱼肝脏中SOCS1a产生明显的应激效应，
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这表明SOCS1a可能参与调节水生生物的GH信号通路。

通过转基因小鼠模型，已经阐明了SOCS家族成员的生理功能。

然而，但对非哺乳生物物种的SOCS家族的研究缺乏，包括SOCS蛋白在硬骨鱼类体内的基因功能尚未阐明。

我们利用转录激活因子样效应物核酸酶（Activation of transcription factor sample effector nucleic acid enzymes，TALENs）技术敲除斑马鱼SOCS1a基因，并研究其生理作用。

早期，斑马鱼SOCS1a突变系JAK/STAT5通路被过度活化，红细胞生成增多，生长正常。

24 hpf时，斑马鱼突变系胚胎gata1的表达显著升高。

90 dpf时，成年斑马鱼血液中红细胞数量没有显著差异。

与对照组相比，SOCS1a突变系中的典型炎症性细胞因子如IFN-γ，IL-1，IL-6和肿瘤坏死因子α（tumour-necrosis factorα，TNF α）等基因的表达没有显著性差异。

从第20dpf开始，SOCS1a突变系出现生长缓慢并伴随死亡，成年斑马鱼体重显著低于野生型。

敲除SOCS1a的杂合系成年斑马鱼机体快速生长，体重显著高于对照组。

成年斑马鱼SOCS1a突变系出现全身脂肪减少、肝脏脂肪变性、胰岛素抵抗等和哺乳动物脂肪代谢障碍症相似的表型。

肝脏比较转录组学数据分析表明，斑马鱼SOCS1a突变系肝脏中糖异生、脂分解和低氧诱导效应增强，且肝细胞出现明显的线粒体功能障碍。

综合起来，研究结果表明SOCS1a对JAK/STAT5通路的负调节作用可能参与包括红细胞生成和生长激素活性的抑制作用，导致在杂合系中出现的机体快速生长的生长激素激活作用。

此外，斑马鱼模型和哺乳动物模型的SOCS1a突变系在胰岛素敏感性、脂代谢和炎症效应等方面的不同表型，反映出了SOCS1a在水生生物和陆生生物中的不同功能机制。

关键词：SOCS1a；肝脏脂肪变性；胰岛素抵抗；JAK2/STAT5活化
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Abstract
The JAK/STAT signaling pathway, which is one of the core transmission systems that mediate the extracellular signals for the activation of many key signal cascades involved in various physiological processes. More recently, members from a small protein family identified as suppressors of cytokine signaling (SOCS) have been found to form negative feedback loops to inhibit JAK/STAT signaling .SOCSprotein is a kind of negative feedback regulating protein molecules, which participate in the signaling pathways mediated by cytokines. Based on mouse genetic studies, distinguishable physiological roles for several members of the SOCS family have been delineated. Among the mouse SOCS proteins, SOCS1has been shown to be mainly involved in IFNγ responses and prolactin signaling, whereas SOCS3plays regulatory roles in leukemia inhibitory factor and IL-6 signaling and placental development. The observation of gigantism in SOCS2-deficient mice provides clear evidence that SOCS2is a negative regulator of GH signaling. Moreover, there is a growing body of evidence suggesting a role for SOCS proteins in insulin signaling.
Somatic growth is a tightly regulated process that is dependent on GH signaling and action. Related to its role on postnatal growth promotion, GH has many other potent effects, including lipid, glucose, and mineral metabolism. In mammals, the activation of JAK2/STAT5 signaling via GH leads to the transcriptional activation of a wide range of target genes, including IGF-I, anti-apoptotic genes, and SOCS2.Insulin is a peptide hormone produced by β-cells in the pancreas. Its main function is to promote the absorption of glucose from the blood to other tissues and the storage of fat for use as energy. Normally, GH also influences insulin signaling by antagonizing the action of insulin on glucose and lipid homeostasis in diverse tissues. In mammal animal models, chronic GH excess may promote insulin resistance by increasing hepatic glucose production and triglyceride storage.
The zebrafish SOCS family contains at least 12 members. Zebrafish socs1a has been found to exhibit significant expression in the liver. The expression of zebrafish socs1a may be induced by LPS and poly I:C, suggesting its potential roles as an inhibitor of IFN
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signaling. However, it has also been reported that socs1a may also be stimulated significantly in the livers of GH or GHR overexpressing transgenic zebrafish, indicating its involvement in teleost GH signaling pathways. Utilizing a dozen of powerful genetically modified mouse models, the physiological functions of each SOCS family member have been carefully defined. However, there is no similar genetic model for non-mammalian species. The specificity within the SOCS family of proteins in teleost model has not yet been elucidated.To address these questions, we depleted SOCS1a using the transcription activator-like (TAL) effector nucleases (TALENs) technique to understand its physiological roles in zebrafish.
Although elevated levels of JAK/STAT5 activation and erythropoiesis have been observed in socs1a-deficient zebrafish, these animals exhibited normal growth during the early stages. An upregulated expression level of gata1 was found in socs1a-/- embryoscompared with wild-type embryos at 24 hpf. A modest increase in the numbers of erythrocytes was observed in socs1a-/- adults compared with wild-type adults, as determined through the red blood cell counts at 90 dpf. There are no significant variations in the expression levels of the typical inflammatory cytokines, such as IFN-γ, IL-1, IL-6, and TNFα, between the wild-type control and their socs1a-deficient siblings.Socs1a-deficient zebrafish began to grow slowly with certain mortalities after 20 days post fertilization (dpf), while the heterozygous socs1a-deficient zebrafish exhibited enhanced somatic growth.
Decreased adiposity, hepatic steatosis, and insulin resistance were observed in our socs1a-deficient adult zebrafish, which is similar to the lipodystrophy phenotypes observed in mamals. Comparative transcriptomic analyses revealed elevated levels of gluconeogenesis, lipolysis and hypoxia-inducible response and decreased activities of lipogenesis and glycolysis in the hepatocytes of socs1a-deflicient adult zebrafish. Evident mitochondrial dysfunction has also been observed in hepatocytes from socs1a-deficient zebrafish.
Taken together, our results suggest that the negative regulatory roles of SOCS1a on JAK/STAT5 signaling may be involved in the suppression of the erythropoiesis and growth hormone activities, which was also reflected with the fact of the enhanced somatic growth performance observed in the heterozygous socs1a-deficient fish. The differences in
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the effects caused by SOCS1a depletion on insulin sensitivity, lipid metabolism and inflammatory responses between zebrafish and mammalian models observed here may reflect differences between the functional mechanisms of SOCS members in terrestrial mammals and aquatic teleosts.
Keywords:SOCS1a; hepatic steatosis; insulin resistance; JAK2/STAT5 activation
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目录
摘要 (I)
Abstract (III)
1 绪论 (1)
1.1 SOCS家族蛋白的结构与功能 (1)
1.2 SOCS1参与调节多种信号通路 (4)
1.2 SOCS1的生物学功能 (9)
1.4斑马鱼作为模式动物的优点 (20)
1.5 TALEN技术及应用 (22)
1.6 本研究的目的和意义 (25)
2 实验材料和方法 (27)
2.1实验动物 (27)
2.2实验试剂 (27)
2.3实验仪器 (29)
2.4 实验方法 (30)
3 研究结果 (44)
3.1斑马鱼SOCS1a突变系建立 (44)
3.2斑马鱼SOCS1a调节JAK-STAT 和GH信号通路 (46)
3.3敲除SOCS1a导致肝脂肪变性和脂肪组织减少 (50)
3.4肝脏转录组数据分析 (53)
3.5敲除SOCS1a导致肝脏胰岛素抵抗 (55)
3.6敲除SOCS1a导致肝细胞线粒体功能异常 (57)
3.7 敲除SOCS1a的杂合体斑马鱼体重显著增加 (59)
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4讨论 (61)
5 总结和展望 (65)
致谢 (68)
参考文献 (70)
附录1 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 (84)
附录2 本论文中用到的缩略语 (85)
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1 绪论
1.1 SOCS家族蛋白的结构与功能
1.1.1 SOCS家族蛋白的基本结构
在受到外界刺激时，细胞会分泌一类有生物活性的多肽分子，称为细胞因子（cytokine，CK），它们包括IL、IFN、生长激素（growth hormone，GH）、催乳素（prolactin，PRL）、IGF-I、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）、血小板生成素（thrombopoietin ，TPO）和促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）等。

细胞因子被分泌后与受体蛋白结合，并启动下游的细胞信号传递功能。

为维持体内平衡，细胞因子信号转导受到严格的控制，否则将会导致机体产生功能紊乱甚至诱发疾病或导致发育不良。

目前至少发现了三大类对细胞因子信号转导起到负调节作用的抑制因子，它们分别是活化STATs的蛋白抑制因子（Protein Inhibitor of Activated STAT，PIAS）、蛋白酪氨酸激酶（phosphotyrosine phosphatases，SHPs）和SOCS[1]。

SOCS家族蛋白也是细胞因子的一种，当细胞信号通路被过量活化甚至影响机体的免疫、造血或繁殖等功能时，SOCS蛋白能阻断信号传递，维持机体平衡。

目前，对小鼠、人类等的研究中发现了8个SOCS家族成员：细胞因子诱导的含SH2的蛋白（Cytokine inducible SH2-containing protein，CIS）和SOCS1-SOCS7[2]。

而鱼类SOCS 家族已经被克隆出12个家族成员，除了哺乳动物中的CIS和SOCS1-SOCS7之外，还包括另外的四个成员：SOCS3b、SOCS5b 、SOCS8和SOCS9[3]。

研究发现，哺乳动物中，SOCS家族蛋白从氨基端到羧基端可分为3个区域，N区、SH2区和SOCS 盒（SOCS box）（图1.1）[2]。

其中，SH2区和SOCS盒是SOCS蛋白形式功能的关键结构域。

SOCS蛋白的SH2结构域与磷酸化酪氨酸残基结合，进而对细胞信号通路产生调控作用。

SOCS盒有两方面的活性作用：维持SOCS蛋白稳定和促进特异信号蛋白发生降解[4]。

小鼠SOCS基因的SOCS box突变后，小鼠对IFNγ的反应增强，这表明SOCS box是SOCS1蛋白的主要功能结构域[5]。

激酶抑制区（kinase inhibitory
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region，KIR）是仅存在于SOCS1和SOCS3一个特殊结构，当机体或细胞受到刺激时，SOCS1和SOCS3可将KIR作为假底物，竞争JAK的催化位点，从而抑制JAK/STAT信号转导通路[6]。

图1.1 SOCS家族成员的名称和结构域。

Figure 1.1The alternative names and domain structures of the SOCS family members.
引自：LARSEN L, ROPKE C. Suppressors of cytokine signalling:SOCS[J]. APMIS, 2002,
110(12):833-844.
1.1.1 SOCS家族蛋白的功能
1995年，SOCS家族的第一个成员CIS被克隆出来，其编码蛋白中的一段序列与SH2结构域非常相似，并由此而命名为CIS[7]。

1997年，3个研究小组相继发现了第二个家族成员SOCS1，并且根据实验方法的不同来命名此蛋白：能与JAK催化域结合的命名为JAK结合蛋白（JAK-binding protein，JAB）[8]；能与STAT3的SH2结构域发生免疫反应的命名为STAT诱导的STAT抑制因子（STAT-induced STAT inhibitor，SSI）[9]；能抑制细胞信号转导的蛋白命名为SOCS1[10]。

紧接着，从cDNA 文库中分离得到SOCS2和SOCS3[10]。

随后SOCS的其他家庭成员也被相继发现[11]。

SOCS家族蛋白对细胞信号传导产生负反馈调节作用[12]。

SOCS蛋白既是细胞因
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子的一种，同时也是由细胞因子诱导产生的。

在正常细胞中SOCS只有少量基础表达，但是当受到细胞因子如IFNγ、LPS等的刺激后，他们的表达会迅速的提高以应对机体各种生命活动的变化。

SOCS家族蛋白在机体中泛表达，各成员在绝大数造血组织中均有表达。

CIS主要表达于肾、脂肪、肝和肌肉等组织；SOCS1主要表达于胸腺、肝、脾脏等组织中，肺、睾丸、眼睛、心脏等组织中也有少量表达；SOCS2主要在肝、心、肺和肾等组织中表达；SOCS3主要表达于肝、脑、骨骼肌、脾和脂肪等组织及胎儿肝细胞[10, 13]。

在造血细胞中，IL-2、IL-3或EPO等因子能诱导CIS 产生，而CIS过表达会抑制STAT5的表达[14]。

肝脏GH和乳腺PRL的诱导会导致CIS转基因小鼠的STAT5酪氨酸磷酸化水平明显降低[15]，这提示CIS对STAT5具有负调节的作用。

敲除SOCS1的小鼠在出生后生长缓慢，并在出生3周后出现致死性新生综合征，表现为肝脏脂肪变性，多器官为单核细胞所浸润，胸腺明显变小，骨髓、脾脏和外周血液中的成熟B淋巴细胞明显减少[16]。

此外，SOCS1-/-小鼠还出现胰腺外分泌紊乱、胰岛增生等严重的胰腺炎症[17]。

这提示SOCS1基因可能对机体的免疫系统和代谢系统有调控作用。

敲除SOCS2的小鼠出现胶原沉积，心脏、肺部和脾脏中IGF-I的mRNA表达水平升高，此外，敲除SOCS2的雄性小鼠在12周时体重比对照组小鼠约大35%，并且其体重的增加不是由于腹部脂肪组织的增多引起，而是由于内脏器官重量增加、大腿肌肉细胞增多、骨骼和身体长度增加[18]，这表明，SOCS2-/-小鼠体重显著增增加的表型可能是由于SOCS2参与GH/IGF-I信号的转导而引起的，SOCS2蛋白通过对GH信号通路的负反馈调控作用对机体的生长发育进行调控[19]。

胚胎中高表达SOCS3导致小鼠胚胎红细胞生成显著减少而死亡，而敲除SOCS3导致红细胞生成显著增加而死亡[20]。

提示SOCS3蛋白是机体生命活动所必需的，其在胚胎期肝脏红细胞生成过程的关键负性调节因子。

此外，SOCS3也参与瘦素和胰岛素信号通路的调节[21-23]。

研究表明，SOCS4-SOCS7主要是由EGF/SCF/insulin/IGF-1诱导产生，并调节相对应的信号通路（表1.1）[12]。

表1.1 SOCS家族蛋白的诱导因子及其抑制的信号通路。

table 1.1 Inducing factors of SOCS family proteins and suppressed signaling by SOCS family proteins.
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引自：Fujimoto M and Naka T. SOCS1, a Negative Regulator of Cytokine Signals and TLR Responses, in Human Liver Diseases[J]. Gastroenterol Res Pract, 2010. 2010:1-7.
1.2 SOCS1参与调节多种信号通路
SOCS1基因含两个外显子，其编码区域位于第2个外显子，不同物种的SOCS1基因编码的氨基酸数目略有不同。

小鼠编码212个氨基酸，人类SOCS1编码211个氨基酸，鱼类编码201-237个氨基酸，斑马鱼的SOCS1a基因编码201个氨基酸[24]。

SOCS1最先是作为细胞因子诱导的STAT信号通路的抑制因子而被鉴定出来。

SOCS1基因参与多种细胞信号通路调节，包括JAK/STAT、胰岛素、催乳素PRL、IFN、GH 等信号通路。

1.2.1 SOCS1负反馈调节JAK/STAT信号通路
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图1.2 SOCS1负调控JAK/STAT信号通路。

Figure 1.2 SOCS1are negative-feedback inhibitions of cytokine signal transduction.
引自：Alexander W S. Suppressors of cytokine signalling (SOCS) in the immune system[J]. Nat Rev Immunol, 2002, 2(6):410-416.
JAK/STAT信号通路是细胞因子和生长激素信号传递的主要信号途径。

JAK活化后会刺激细胞的生长、分化，细胞迁移和凋亡。

而这些细胞事件是造血作用、免疫发育、乳腺发育、细胞凋亡和其他过程的关键。

JAK家族包括四个家族成员：JAK1-JAK3和TYR2[25]。

STATs家族是一类具有信号转导和转录功能的蛋白质，存在于细胞胞浆内，活化后可以转录目的基因。

目前在哺乳动物中已经发现了7种STATs家族成员，包括STAT1-STAT6，其中STAT5包括STAT5a和STAT5b[26]。

配体刺激并诱导细胞膜上的受体亚基多聚化，使位于两个受体亚基的胞内结构域与
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JAK酪氨酸激酶相结合从而JAK被活化，JAK活化后，进一步激活STAT蛋白[27]，STAT活化后，转入细胞核内，调控包括与免疫、造血、生长等相关的下游基因的表达[28]。

SOCS蛋白受多种细胞因子的诱导而产生，包括IL，IFN-，TNF，TGF，EPO，G-CSF，LPS，Insulin等。

细胞因子刺激并诱导JAK/STAT信号通路活化，促进下游基因转录，而信号通路的过度活化，会扰乱机体平衡甚至产生肿瘤等疾病，为此，SOCS蛋白作为抑制因子，负反馈调节JAK/STAT信号通路的细胞信号转导[29-32]。

SOCS蛋白主要通过几种机制调节JAK/STAT信号通路：（1）利用SH2结构域直接与JAK结合从而抑制JAKs的激酶活性；（2）利用SH2结构域与受体竞争结合JAK 激酶底物，阻止转录因子STAT的活化；（3）通过C端的SOCS盒与elongin BC复合物和cullin 2相互作用，特异性降解下游的目标信号蛋白，从而终止信号转导[33, 34]。

在细胞信号转导过程中，STAT蛋白结合磷酸化的JAK而被激活，在SOCS1行使功能的过程中，其SH2结构域会竞争性的结合JAK，从而抑制STAT活化；SOCS1和SOCS3还可以通过自身的KIR结构域形成竞争性底物与JAK结合，从而抑制JAK 下游的蛋白的活化（图1.2）[35]；另外，SOCS1的SOCS盒能够通过第三种机制降解JAK，从而参与调节包括JAK/STAT在内的信号通路[36]。

1.2.2 SOCS1负调控insulin（胰岛素）信号通路
胰腺是分泌消化、代谢等相关的酶和激素的重要组织器官，分为胰腺外分泌部和胰腺内分泌部。

胰腺外分泌部主要分泌与消化相关的胰脂肪酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶等，而胰腺内分泌部主要分泌胰岛素、胰高血糖素等参与调控糖和脂肪能量代谢相关的激素。

胰岛素能够促进糖的利用、脂肪合成和蛋白合成，抑制糖异生、脂分解，维持机体血糖稳定。

机体胰岛素敏感性组织包括肌肉组织、脂肪组织和肝脏组织等，胰岛素或胰岛素样生长因子信号通路已经被广泛研究。

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图1.3 SOCS抑制insulin信号通路
Figure 1.3 Inhibition of the insulin signaling pathway by suppressor of cytokine signaling of SOCS1 和SOCS3.
引自：Lebrun P, Van Obberghen E. SOCS proteins causing trouble in insulin action[J]. Acta Physiol (Oxf), 2008, 192(1):29-36.
胰岛素作为细胞因子的一种，在细胞分泌后通过与细胞膜表面受体结合而激活下游信号通路，从而行使其生理功能。

研究发现，胰岛素分泌并与胰岛素受体( insulin receptor，IR)结合后，刺激蛋白酪氨酸激酶（proteinTyrosinekinase, PTK）磷酸化而被激活，PTK活化后，通过级联效应，依次活化下游的胰岛素受体底物蛋白（insulinreceptor substrate，IRS）、磷脂酰肌醇3激酶（phos-phatidylinositide-3kinase，PI3K）、下游效应物蛋白激酶（protein kinase，AKT），最后，活化的AKT再进一步启动各种下游信号进而调控细胞活动[37, 38]。

研究表明，SOCS蛋白通过以下几种机制参与胰岛素信号通路调节（图1.3[39]）：
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（1）竞争性结合IR；（2）降解IRS蛋白；（3）抑制IR酪氨酸激酶活性。

SOCS3通过竞争性结合IR阻止IRS-1和IRS-2的磷酸化，从而抑制下游信号通路。

LPS诱导或机体肥胖会引起肝脏、肌肉等组织中SOCS1和SOCS3的表达量升高，进而导致IR酪氨酸磷酸化部分受损，IRS磷酸化完全受到抑制，此外，过表达SOCS3会导致IRS-1和IRS-2的磷酸化水平降低，而过表达SOCS1只导致IRS2磷酸化降低[40]。

此外，在多种细胞中均发现SOCS1和SOCS3是通过结合IRS-1和IRS-2，并促进他们的泛素化降解从而抑制他们的活性；SOCS1的SOCS盒结构域突变后，虽然SOCS1仍然能与IRS结合，但是其泛素化降解的功能已经丧失[41]，这表明SOCS1蛋白的SOCS盒结构域是行使泛素化降解的功能结构域。

以上研究结果提示SOCS1是通过竞争性结合IR和抑制IRS2的磷酸化来负调控胰岛素信号通路。

1.2.2 SOCS1负调控TLRs信号通路
Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）信号通路是机体由于微生物病原体入侵而产生的应激通路，用于激活机体免疫系统的免疫应答，进而对病原体的进行清除，保护机体维持正常生命活动。

大多数情况下，TLRs信号通路被活化激活免疫反应后并没有引起机体发生肿瘤及自身免疫性疾病，这是由于机体存在严密的负反馈调节机制，能及时终止TLRs信号通路的过度激活以维持细胞稳态[42]。

TLRs受体能识别入侵机体的病原性微生物，并能激活TLRs信号通路下游的信号转导。

配体（如LPS）与TLRs结合后，主要经过两种途径进行信号传导：（1）直接或间接招募并活化髓样分化因子（myeloid differentiation factor，MyD88），并进一步激活下游分子，最终活化核内因子-κB（nuclear factor-kappa B，NFκB），促进炎症分子的表达；（2）活化后的TLR招募Toll-白细胞介素-1受体结构域诱导干扰素接头分子（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF）TRIF与TANK结合激酶（TANK-binding kinase，TBK）作用，进一步活化干扰素调节因子3（Interferon Regulating Factor 3，IRF3），启动下游基因转录（图1.4）[43]。

SOCS1可通过多个信号通路调节靶点进行反馈调节。

首先，通过增加IFN等细胞因子的分泌后再通过JAK/STAT通路的负反馈调节间接调节TLRs信号通路。

其次，活化TLRs后，Mal 磷酸化并暴露出SH2结合位点，SOCS1通过与之结合而促使其被泛素化降解[44]。

再
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次，SOCS1可以和MyD88下游的p65结合并使其发生泛素化降解，从而抑制NFκB 下游相关炎症基因的转录表达[45]。

图1.4 SOCS1抑制TLR4和Mal信号通路。

Figure 1.4 Inhibition of TLR4 signaling and of Mal in mediating by SOCS1.
引自：Kobayashi T, Takaesu G, and Yoshimura A. Mal-function of TLRs by SOCS[J]. Nat Immunol, 2006, 7(2):123-124.
1.2 SOCS1的生物学功能
1.2.2 SOCS1参与调节机体免疫系统
为维护机体正常发育和生命活动，机体形成了两种防御机制，一种是物种长期进化过程中形成的天然（innate immunity），另一种是出生后为适应而产生的适应性免疫（adaptive immunity）。

研究表明，SOCS1蛋白主要通过JAK/STAT和TLRs信号通路调控机体的天然免疫、适应性免疫和T细胞的分化发育[46-48]。

SOCS1参与机体天然免疫调节。

如前面所述，敲除SOCS1引起机体高敏炎症反应，SOCS1-/-小鼠在出生后3周内出现致死性新生综合征，机体出现对IFNγ的高敏
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反应，表达量明显升高，T淋巴细胞数量明显减少，并因严重的炎症病变致死[16]。

此外，SOCS1-/-小鼠出现严重的胰腺炎，炎症因子IFNγ、TNF和IL12的表达明显升高[17]。

为进一步了解SOCS1基因和IFNγ的相互关系，建立了SOCS1和IFNγ的双基因敲除系，分别比较了SOCS1-/-IFNγ-/-，SOCS1+/+IFNγ-/-和SOCS1+/+IFNγ+/+三组小鼠的发育情况。

结果发现，SOCS1-/-IFNγ-/-小鼠的死亡率明显高于对照组，且小鼠发育为多囊性肾病、肺炎、慢性皮肤溃疡、内脏和多器官息肉等不同程度的炎症病变[49]。

此外，SOCS蛋白对LPS具有高敏感性，LPS处理SOCS1-/-小鼠，会导致TNF和IL-12的表达增加[50, 51]。

LPS能诱导机体NK （natural killer，自然杀伤）细胞和T细胞大量产生IFNγ，IFNγ被证明是内毒素休克的关键调节因子[52]。

研究发现，IL-10可以诱导SOCS1表达、抑制IL-10/STAT3活性，同时抑制IFNγ信号通路[53]。

以上证据表明SOCS1蛋白是细胞对IFNγ等炎症因子敏感性的关键调节因子，参与IFNγ与免疫系统之间信号通路的调节。

SOCS1蛋白参与调节树突状细胞(dentriticcells，DCs）的成熟过程。

树突状细胞是一种抗原递呈细胞(Antigen presenting cells, APC)，在机体的适应性免疫调节过程中扮演着重要的角色。

由于DC是唯一的APC，且其主要功能是传递抗原，并能诱导T 细胞产生免疫反应，因此也被称为专职的APC。

DC的发育主要包括两条途径：一是在粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）刺激下髓样干细胞分化为DC，二是来源于淋巴样干细胞。

SOCS1在调节DC功能、抑制炎症疾病以及系统免疫力中扮演重要的角色[54-57]。

虽然GM-CSF可通过TLRs信号通路诱导不成熟DC向成熟DC转化，但是在CD14+人单核细胞中，TLRs 对GM-GSF产生的是抑制作用；在DC前体细胞中，TLR能诱导抑制GM-CSF敏感性的SOCS蛋白产生，过表达SOCS1会抑制GM-CSF信号转导；而且，通过模拟DC前体细胞中表达SOCS1来观察TLR信号对DC产生的影响，结果显示，TLR刺激DC产生和分化的过程主要由SOCS1来参与调节[58]。

体内和体外实验都证明，SOCS1缺陷的DCs 能更加容易诱导辅助型T淋巴细胞（T Helper Type 1，Th1）反应。

体外实验显示，SOCS1缺陷的DCs能诱导初始T细胞分泌更多的IFNγ；缺失SOCS1的骨髓DCs中，淋巴瘤细胞同样会产生大量的IFNγ，并且，与对照组相比，缺失SOCS1的骨髓DCs能够
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产生更加有效的抗肿瘤免疫能力[59]。

利用缺失TLRα链或缺失SOCS1的CD28的小鼠来探讨SOCS1的功能，结果发现，缺失SOCS1的小鼠中，SOCS1能快速恢复炎症反应的急性期；高表达SOCS1基因的正常小鼠脾脏DCs中含有较多的CD11c+CD8- DC，而SOCS1-/-小鼠脾脏中DCs总数不变的情况下，CD8α+DCs所占的比例明显高于对照组，经LPS和胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（cytosine-phosphate-guanine，CpG）刺激后，CD8+DCs分泌更多的IFNγ、IL-12和B淋巴细胞，这表明SOCS1缺失小鼠中的DCs参与调节自身免疫，因此，成熟DC中表达的SOCS1主要起着监督和控制DC的异常扩张，以维持体内的免疫平衡[60]。

SOCS1影响胸腺T细胞的分化发育。

在没有受到外界刺激的情况下，SOCS1在胸腺中高表达，敲除SOCS1基因后，CD8+T细胞数量显著高于对照组[61]。

在受到IL-21和IL-7的刺激时，SOCS1-/-小鼠中CD8+T细胞大量增殖，这可能是机体由于SOCS1缺失引起T细胞发育异常所致[62]。

此外，SOCS1-/-小鼠不仅发生严重的炎症反应，且胸腺明显变小[16]。

以上证据表明，SOCS1参与并调控T细胞的分化发育过程。

1.2.2 SOCS1调节机体造血功能
研究表明，SOCS1经JAK/STAT信号通路调节机体造血功能。

敲除SOCS1基因后，小鼠造血功能异常。

与对照组相比，SOCS1-/-小鼠中性白细胞增多，血小板和血容积减小，巨噬细胞祖细胞减少，在GM-CSF刺激下祖细胞产生高敏反应[63]。

红血球增多症是以单位血液容积、血细胞数量等超出正常水平为特点的一种血液疾病。

VHL（von Hippel-Lindau）基因突变会导致先天性红血球增多症。

研究发现，这种疾病产生的分子机理与SOCS1有密切关系。

正常情况下，VHL与SOCS1形成异质二聚体E3连接酶，并泛素化降解JAK激酶。

相反，当二聚体出现异常时，其功能丧失，JAK激酶过度激活，并过度活化下游通路，从而导致红细胞增多症的产生，这提示，SOCS1对红细胞的生成有着重要的调控作用[64]。

SOCS1通过抑制TEL-JAK，参与调节造血细胞（Ba/F3）的转化[65]，这是由于SOCS1蛋白的SOCS box结构域对TEL-JAK的蛋白体降解作用导致[65, 66]。

利用Morpholino技术敲降斑马鱼SOCS1a基因后，24 h斑马鱼胚胎原始造血位点后部中间的细胞团（posterior intermediate cell mass，pICM）周围的区域明显增大，骨髓细胞和血红细胞生成受到干扰；随后采用整体原位杂交技术比。