野生大豆回交导入系蛋白质含量性状的QTL分析

野生大豆回交导入系蛋白质含量性状的QTL分析
马占洲;孙殿君;蒋洪蔚;范冬梅;王久镇;曾庆力;刘春燕;李涛;胡国华
【摘要】以野生型大豆ZYD00006(供体亲本)与黑龙江省主栽品种绥农14(轮回亲本)所构建的回交导入系(1 204株)为研究材料,利用WinQTL2.5的复合区间作图法(CIM)在9个连锁群定位了16个与蛋白质含量相关的QTL(14个正效应,2个负效应);导入系群体经过严格的蛋白质含量筛选鉴定,得到10个蛋白质含量性状明显大于轮回亲本的导入系株行.利用这10个高蛋白含量株行(选择群体)结合随机对照群体,通过基于遗传搭车原理的卡方分析,检测到分布于10个连锁群上的17个与大豆蛋白质含量相关的标记位点,对蛋白质含量表现为正效应.两种方法共同检测到7个QTL.这些材料和位点将为高蛋白含量相关基因克隆及分子辅助育种提供重要的材料基础和标记信息.
【期刊名称】《中国油料作物学报》
【年(卷),期】2014(036)003
【总页数】7页(P316-322)
【关键词】野生大豆;导入系;蛋白质含量;复合区间作图法;QTL定位
【作者】马占洲;孙殿君;蒋洪蔚;范冬梅;王久镇;曾庆力;刘春燕;李涛;胡国华
【作者单位】东北农业大学农学院,黑龙江哈尔滨,150030;黑龙江省农垦科研育种中心,黑龙江哈尔滨,150090;东北农业大学农学院,黑龙江哈尔滨,150030;黑龙江省农垦科研育种中心,黑龙江哈尔滨,150090;东北农业大学农学院,黑龙江哈尔
滨,150030;东北农业大学农学院,黑龙江哈尔滨,150030;东北农业大学农学院,黑龙江哈尔滨,150030;黑龙江省农垦科研育种中心,黑龙江哈尔滨,150090;黑龙江垦丰
种业有限公司,黑龙江哈尔滨,150090;黑龙江省农垦科研育种中心,黑龙江哈尔滨,150090
【正文语种】中文
【中图分类】S565.103
大豆是我国重要的农作物之一，是植物蛋白质的主要来源。

大豆主要包括栽培大豆(Glycine max (L.)Merr.)和一年生野生大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc)，二者构成大豆的初级基因库[1]。

我国栽培大豆资源数目最大，类型也最为丰富，但蛋白质含量通常为38.91%～45.29%%，而野生大豆蛋白质含量最高能够达到55%，平均为(46.8±3.18)% [2]。

随着时代的发展以及人们对植物蛋白需求的增加，大豆所提供的蛋白质已难以满足人们的需求，在耕地面积有限的情况下，提高栽培大豆蛋白质含量具有重大意义。

传统育种手段育种时间长，工作量大，育种上实现获得目标性状又不带来有害性状很困难。

随着分子标记定位QTL技术的出现[3]，有助于实现快速育种获得目标性状。

迄今为止，已有很多人对大豆蛋白质含量进行了QTL定位和研究[4～8]，但这些研究均是在栽培品种之间进行的，还未有人在野生大豆方面进行研究。

自20世纪末Zamir[9]首次构建了野生番茄渗入系并利用此群体预测定位了上千个QTL，开启了人们对野生资源的开发和利用；Fridman[10]利用野生番茄导入栽培种的回交导入系鉴定并定位了产糖量的QTL；郝伟等[11]以野生稻为供体亲本，构建覆盖绝大部分野生稻基因组的替换系，利用这套替换系，初步定位了控制稻米外观和理化品质性状的15个QTL；董华林[12]利用野生稻高代回交群体分析水稻农艺性状QTL；曾庆力等[13]利用野生大豆回交导入系定位了控制小粒性状的9个QTL；王吴彬[14]利用野生大豆回交导入系鉴定并定位6个农艺性状QTL。

本研究利用WinQTL Cartographer V. 2.5遗传分析软件，对野生豆ZYD00006
和绥农14构建的BC3F3回交导入系群体蛋白质含量QTL进行定位，同时在回交导入系群体中筛选鉴定高蛋白质含量材料。

利用“遗传搭车作图”[15]的方法检测等位基因频率的变化并定位控制蛋白质含量的QTL。

1 材料与方法
1.1 材料
供体亲本为野生豆ZYD00006，受体亲本(轮回亲本)为黑龙江省主栽品种绥农14。

绥农14与ZYD00006杂交获得杂种F1，F1与绥农14回交两个世代获得BC2F1，共31个家系，这些家系再与绥农14回交一个世代并自交两代得到BC3F3共170个株行，每行选取单株粒数大于100粒的植株3～10株共1 204个单株，本试验的群体构建于2006年至2012年。

1.2 试验材料表型获得及超亲筛选标准
2011年将BC3F2种子按株系播种于黑龙江省农垦科研育种基地试验田，小区行
长2m，行距60cm，株距5cm，2011年10月进行单株脱粒，2012年将收获的种子BC3F3以每株种子40粒进行行播，播种标准同2011年，共170行。

2012年10月将每行单株挂牌收获，同时收获亲本绥农14共10株进行考种。

通过严
格的筛选去除熟期晚、熟期分离、成熟度未确定的株行，得到114个完全成熟株
行用于研究。

利用近红外品质分析仪测定蛋白质含量，并以亲本绥农14平均值
±2倍标准差为标准(样本服从正态分布，本实验利用平均值±2倍标准差作为95%的阈值标准)，小于或大于标准均为超亲(特异材料)。

1.3 基因型分析
2011年6月，待BC3F2世代的个体幼苗长出4～5片三出复叶时，单株挂牌取叶片，分别提取基因组DNA。

本研究选择了Song等[16]整合其他图谱标记形成的
高密度遗传连锁图Soymap2 作为公共图谱，筛选1 000对SSR引物，从中选出
双亲间存在多态性并在大豆20条连锁群均匀分布的SSR标记122对，对BC3F2
株系进行SSR标记检测，122对SSR标记在后代群体中都具有多态性。

本研究以BC3F3株行所有个体表型值的平均数作为上代植株的表型值并与上代植株基因型
进行分析。

1.4 数据统计分析
利用Windows QTL Cartographer V. 2.5进行复合区间作图扫描蛋白质含量性状的QTL，以似然比LR(likelihood ratio)大于11.5，即对应LOD值大于2.5作为QTL存在的阈值，根据LOD值的峰值两侧各下降1个LOD值为置信区间。

利用获得的基因型数据对各个区段供体等位基因频率与BC3期望值(1/16)及随机
群体的偏离情况进行计算，本研究采用基于“遗传搭车作图”的卡方测验作近似的显著性检测，显著水平为0.05，属于单标记方法定位QTL[17～19]。

1.5 QTL命名原则
按照McCouch[20]等提出的QTL命名法。

2 结果与分析
2.1 蛋白质含量在群体中的表现
回交导入系群体的蛋白质含量呈现近似正态分布(图1)。

2.2 复合区间作图法定位蛋白质含量QTL
利用复合区间作图法(CIM)定位了16个QTL(表1)，分别位于A2、C1、D1a、E、F、I、K、M、N等9个连锁群，单个QTL的阈值(LOD)范围是2.60～6.13，加性效应的范围是0.018～2.857之间(加性效应的正值负值分别表示遗传正效应来源
于绥农14和ZYD00006)，对性状贡献率范围是0.002%～28.764%。

在A2、C1、D1a、F、K等5个连锁群上各定位了1个QTL，LOD值分别为2.76、3.64、
4.04、3.61、3.22，贡献率分别为0.178%、0.002%、3.333%、20.705%、
6.954%，加性效应分别为-0.152、0.018、-0.53、-2.667、2.741。

在E连锁群
上定位的3个QTL，LOD值分别为5.73、6.13、2.83，贡献率分别为11.906%、24.005%、3.601%，加性效应分别为-1.116、-1.943、-0.772。

在I连锁群上定
位的3个QTL，LOD值分别为4.06、4.6、2.98，贡献率分别为14.542%、
28.764%、1.528%，加性效应分别为-1.931、-2.37、-0.326。

在M连锁群上定
位的3个QTL，LOD值分别为5.18、5.05、2.6，贡献率分别为20.278%、
20.358%、9.997%，加性效应分别为-2.479、-2.547、-1.208。

在N连锁群上定位的2个QTL，LOD值分别为3.83、4.64，贡献率分别为17.954%、3.15%，
加性效应分别为-2.857、-0.876。

图1 大豆蛋白质含量频率分布图Fig.1 Frequency distribution of soybean protein content
表1 蛋白质含量QTL分析结果Table 1 QTL results of protein
content(CIM)QTL连锁群LG置信区间C.I.标记区间Marker intervalQTL位置QTL position阈值LOD加性效应Additive effect贡献率R2/%qPC-a2-
1A224.9～36.7sat_212-satt37727.212.76-0.1520.178 qPC-c1-1C16.3-～
19.0satt565-satt19414.013.640.018 0.002qPC-d1a-1D1a0.6～5.3satt531-
satt5482.014.04-0.530 3.333 qPC-e-1E0～4.3satt411-satt6912.015.73-1.116 11.906 qPC-e-2E13.6～21.3satt720-satt60617.516.13-1.943 24.005 qPC-e-
3E39.7～45.1satt685-sat_38143.112.83-0.772 3.601 qPC-f-1F64.0～
87.4sat_317-satt55476.413.61-2.667 20.705 qPC-i-1I0.6～11.9satt419-
satt7008.014.06-1.931 14.542 qPC-i-2I11.9～19.8satt700-sat_28615.814.6-2.370 28.764 qPC-i-3I56.2～62.3sat_324-satt44058.912.98-0.326 1.528 qPC-k-1K0～23.5satt242-satt5440.013.222.741 6.954 qPC-m-1M12.1～
22.1satt636-satt56718.015.18-2.479 20.278 qPC-m-2M25.2～51.6satt567-sat_25629.315.05-2.547 20.358 qPC-m-3M85.0～100.2satt250-
satt33691.412.6-1.208 9.997 qPC-n-1N35.8～48.4satt125-
satt52141.813.83-2.857 17.954 qPC-n-2N51.2～60.7satt521-
sat_30654.514.64-0.876 3.150
2.3 获得超亲株系
经过对BC3F3 114株行材料和10株绥农14进行蛋白含量测定，10株亲本绥农14蛋白质含量平均值为41.3%，标准差为1.25，平均值±2倍标准差的范围为38.80～43.80%。

将BC3F2的114株行的蛋白质含量平均值与亲本范围进行比较，将大于43.80%定义为超亲高蛋白质材料，小于38.80%定义为超亲低蛋白质材料。

最终获得11个超亲表现的株行植株，其中高蛋白质材料共10个株行(来自
BC2F15个家系)。

由于定向选择的作用，供体等位基因导入频率与蛋白质含量相关的SSR标记位点
具有一致性。

供体基因的导入导致定向选择群体(高蛋白质含量)相对于轮回亲本绥农14具有超亲表现，但由于材料回交世代较高，遗传背景回复率较高，选择群体中供体等位基因导入频率平均值较低，略高出理论值(0.062 5)，但较之随机群体，选择群体的导入频率变异幅度更大(表2)。

表2 蛋白质含量导入系的供体等位基因频率及其偏离Table 2 Frequency and deviation of donor alleles in introgression lines for protein content群体Population个体数Number 平均Mean±SD 变幅 Range 频率Frequencyχ2频率Frequency χ2选择群体 Selected
population100.123±0.138 64.744 4±0.070～0.3720～70.34随机群体Random population100.061 1±0.107 63.926±8.3120～0.360～65.1
2.4 卡方分析定位蛋白质含量QTL
结合基因型分析，利用卡方检测作近似检验，根据等位基因导入频率相应位点在选择群体中的总体表现，设置检测阈值为0.05。

20个连锁群中，B2、C1、C2、
D1a、D2、E、I、J、N 和O这10个连锁群上的17个位点：Satt577、Satt565、Satt194、Satt640、Satt422、Staga001、Satt531、Satt548、Satt669、
Satt411、Satt691、Satt720、Satt700、Satt440、Satt547、Sat_306和
Satt492呈现选择后导入频率的显著变化。

这些位点的供体片段导入频率相对于随机群体中的供体片段导入频率显著增大，即表现为供体片段的超导入，可见这些位点上的供体片段对蛋白质含量性状是有贡献的(表3)。

表3 基于遗传搭车原理的卡方测验所检测到的蛋白质含量性状位点分布Table 3 Distribution of protein content loci by χ2 test on genetic hitch-hikingQTL
连锁群LG区间/cMRange随机群体(RP) Random population 选择群体(SP) Selective population 选择群体相对随机群体(SP to RP)频率Frequencyχ2频率Frequencyχ2χ2Satt577B23.0～9.30.10.440.421.0310.57 Satt565C10～
13.100.020.421.0318.12 Satt194C113.1～51.300.110.3515.3125.43
Satt640C215.2～36.500.240.256.6016.16 Satt422C243.4～
50.600.080.4523.2020.43 Staga001C2116.1～119.900.040.310.518.09
Satt531D1a20.4～46.00.10.940.421.038.09 Satt548D1a45.9～
60.50.10.000.310.5110.98 Satt669D260.7～79.901.850.421.035.89
Satt411E6.4～16.300.340.4523.2015.32 Satt691E16.3～
20.300.440.3515.317.37 Satt720E20.2～30.300.120.421.0314.18
Satt700I28.4～45.100.070.421.0325.79 Satt440I98.5～
112.700.790.421.038.64 Satt547J60.7～71.50.11.830.526.2211.28
Sat_306N79.2～93.10.10.540.310.514.37 Satt492O8.6～
28.300.540.4523.2013.44
2.5 两种定位QTL方法共同检测到的蛋白质含量QTL
利用复合区间作图法和卡方分析法定位的QTL，其中在C1、D1a、E、I、N等5
个连锁群上都有定位(图2)，在C1连锁群上，复合区间作图法定位到的1个
QTL(qPC-c1-1)，标记区间为Satt565-Satt194，卡方分析定位的2个QTL分别
为Satt565、Satt194，这2个单标记QTL在连锁群上相邻，并且与qPC-c1-1区间上重合，两种方法在C1连锁群上共同检测到1个QTL。

在D1a连锁群上，复
合区间作图法定位到的QTL(qPC-d1a-1)与卡方分析定位到的2个QTL(Satt531、Satt548)区间上重合，两种方法在D1a连锁群上共同检测到1个QTL。

在E连锁群上，卡方分析法定位到的3个QTL(Satt411、Satt691、Satt720)与复合区间作图法定位到的2个QTL(qPC-e-1、qPC-e-2)区间上有重合，两种方法在E连锁群上共同检测到2个QTL。

在I连锁群上，复合区间作图法定位到的2个QTL(qPC-i-1、qPC-i-2)和1个QTL(qPC-i-3)分别与卡方分析定位到的2个QTL(Satt770、Satt440)有重合，两种方法在I连锁群上共同检测到2个QTL。

在N连锁群上，
复合区间作图法定位到的1个QTL(qPC-n-2)与卡方分析定位到的QTL(Sat_306)
区间上有重合，两种方法在N连锁群上共同检测到1个QTL。

两种方法共同检测到7个QTL分布，在C1、D1a、E、I、N5个连锁群上。

3 讨论
3.1 统计分析方法的选择
大豆蛋白质含量是数量性状，受多基因控制，并且容易受环境变化的影响。

随着分子遗传学的发展和RFLP、RAPD、SSR、AFLP 等分子标记技术的完善，尤其是高密度遗传连锁图谱的构建，大豆蛋白质含量QTL 基因定位和确定其在染色体上的
位置变成了现实。

Zeng探讨了将多元回归用于QTL 作图的理论问题，提出了多
元线性回归与区间作图法相结合的复合区间作图法(CIM)[21]。

复合区间定位法由
于直观性较好、计算上易于自动化而被普遍接受和广泛应用。

导入系材料经严格筛选后，得到蛋白质含量明显大于轮回亲本的超亲导入系材料。

由于该过程为定向选择，会导致群体规模小，等位基因偏离严重，根据群体遗传学
原理，当群体中发生与选择相关的等位基因替代时，由于选择压力的作用，有利基因及其连锁位点频率上升，而不利基因及其连锁位点下降，这一现象称为“遗传搭车”(Genetic hitchhiking)效应[22]。

利用这一原理更能快速有效地获得优良材料及相关的QTL位点，对于材料的选择准确性和目的性更强。

图2 检测到的QTL在连锁群上的分布Fig.2 Location of QTLs on linkage groups
3.2 QTL分析
复合区间作图法定位的qPC-c1-1与卡方分析定位的Satt565、Satt194位置相同，属于两种方法共同检测到的QTL，但两种方法检测的效应相反，有待于进一步验证，其他6个共同检测到的QTL表现效应一致。

CIM法定位的16个QTL中，在C1和K连锁群上分别定位的qPC-c1-1、qPC-k-1加性效应值为正，即野生导入
片段对蛋白质含量的增加表现为减弱效应，其他14个QTL为野生导入片段对蛋
白质含量增加表现增强效应，由此可见，决定高蛋白质含量的位点主要来自于野生大豆。

在高蛋白质含量选择群体中，根据“遗传搭车”原理，卡方检验所检测到的野生豆导入片段均与选择群体的性状直接相关，因此这些野生豆导入片段对蛋白质含量增加表现增强效应。

本研究定位到的QTL中，C1连锁群上的Satt194、C2连锁群上的Staga001、E 连锁群上的qPC-e-3、F连锁群上的qPC-f-1、I连锁群上的Satt700、K连锁群
上的qPC-k-1、M连锁群上的qPC-m-2和N连锁群上的qPC-n-2及Sat_306
与齐照明等收集和整合近20年国内外不同试验中的大豆蛋白质含量QTL相一致。

I连锁群上的qPC-i-1、qPC-i-2对蛋白质含量的贡献来自于野生大豆ZYD00006。

国外许多学者 [23～29]在野生大豆和栽培大豆中都检测到相同的位点，说明这两
个位点并不是野生大豆特有的，但qPC-i-1、qPC-i-2的贡献率均很大，推测这两个QTL可能为影响大豆蛋白质含量的主效位点。

3.3 野生大豆高世代回交材料的利用
现代栽培的作物都是由它们的野生种驯化而来。

在物种驯化过程中，产量的提高伴随着植物遗传基础的日益狭窄。

目前栽培作物仅含有野生资源小部分的遗传变异[30]。

本研究利用野生大豆与栽培大豆回交获得高世代导入系群体大大拓宽了栽培品种的遗传基础。

高世代回交材料遗传背景基本一致，极大地降低了遗传背景对表型鉴定的干扰，因此，通过对高世代回交材料蛋白质含量的鉴定筛选，可以提高表型鉴定的准确性，进而有效鉴定出控制蛋白质含量的QTL。

导入系群体经过表型鉴定获得高蛋白质含量的材料，蛋白质含量均在45.6%以上，最高可达48%，为分子辅助育种提供了材料基础。

4 结论
利用复合区间作图法和基于遗传搭车原理的卡方测验实现了大豆蛋白质含量QTL
定位，两种方法共定位到26个QTL，其中两种方法共同检测到了7个QTL。

分
布在C1、C2、E、F、I、K、M和N这8个连锁群上的9个QTL位点与前人定位的QTL位点相一致，其他17个QTL位点则为本研究新发现的，这些相关标记将
为大豆品质改良育种辅助选择提供有用的信息。

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