sKlotho对高糖状态下小鼠成骨细胞增殖与分化的影响

山东医药2019年第59卷第25期
sKlotho对高糖状态下小鼠成骨细胞
增殖与分化的影响
吕秀娟1，陈新打王艳1，马小羽2
（1沈阳市第四人民医院，沈阳110031；2中国医科大学附属第一医院）
摘要：目的探讨sKlotho对高糖状态下小鼠成骨细胞增殖与分化的影响。

方法常规培养小鼠成骨细胞（MC3T3-E1细胞）将其随机分为高糖组、高糖+0.01ig/mL sKlotho组、高糖+0.02ig/mL sKlotho组、高糖+0.1 ig/mL sKlotho组、高糖+0.2ig/mL sKlotho组,分别加35mmol/L葡萄糖与相应浓度sKlotho进行培养。

用CCK-8实验检测MC3T3-E1细胞增殖能力，用Western blotting实验检测MC3T3-E1细胞内分化蛋白Runx2、0C、ALP表达。

结果干预72h后，随着sKloth o浓度升高,细胞增殖能力（0D值）逐渐升高，高糖+0.2ig/mL sKlotho组0D值最高，与高糖组比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

随着sKloth。

浓度升高,Runx2蛋白、0C蛋白、ALP蛋白表达逐渐升高，高糖+0.2ig/mL sKlotho组Runx2蛋白、0C蛋白、ALP蛋白表达最高，与高糖组比较差异有统计学意义（P 均＜0.05）。

结论sKlotho能改善高糖状态下小鼠MC3T3-E1细胞的增殖与分化功能，且该作用呈浓度依赖性。

关键词：sKlotho蛋白；高糖;成骨细胞;MC3T3-E1细胞;细胞增殖;细胞分化;小鼠
doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2019.25.010
中图分类号:R-332文献标志码:A文章编号:1002-266X（2019）25-0039-03
Effects of sKlotho on proliferation and differentiation of osteoblasts
in mice under high glucose
LYU Xiujuan1,CHEN Xin,WANG Yan,MA Xiaoyu
(1The Fourth People's Hospital of Shenyang,Shenyang110031,China)
Abstract:Objective To investigate the effects of sKlotho on the proliferation and differentiation of osteoblasts in mice under high glucose.Methods The routine cultured osteoblasts(MC3T3-E1cells)were randomly divided into four groups:high glucose group(35mmol/L glucose),high glucose+0.01ig/mL sKlotho group(35mmol/L glucose+0.01 ig/mL sKlotho),high glucose+0.02ig/mL sKlotho group(35mmol/L glucose+0.02ig/mL sKlotho),and high glu­cose+0.2ig/mL sKlotho group(35mmol/L glucose+0.2ig/mL sKlotho).CCK-8was used to detect the proliferation ability of MC3T3-E1,and Western blotting was used to detect the expression levels of Runx2,OC,and ALP.Results After intervention for72h，with the increasing concentrations of sKlotho，the0D value increased，with the highest in the high glucose and0.2ig/mL sKlotho group,and significant difference was found between the high glucose group and high glucose and0.2ig/mL sKlotho group(all P<0.05).As the concentration of sKlotho increased,the expression of Runx2 protein,OC protein and ALP protein increased gradually,with the highest in the high glucose+0.2ig/mL sKlotho group, and significant difference was found between the high glucose group and high glucose and0.2ig/mL sKlotho group(all P
<0.05).Conclusion The sKlotho can improve the proliferation and differentiation of MC3T3-E1in mice under high glu­
cose in a concentration-dependent manner.
Key words:sKlotho protein；high glucose;osteoblasts;MC3T3-E1cells;cell proliferation；cell differentiation；mice
糖尿病患者存在钙磷代谢紊乱,膳食不当进一步导致钙的不足。

国内研究显示，糖尿病患者普遍存在骨密度降低，骨质疏松发病率升高［,2］。

糖尿病性骨质疏松症是一种继发性骨质疏松，是糖尿病患者发生的骨骼系统严重并发症。

糖尿病患者常见的髓部骨折、腕部骨折及无明显临床症状的脊椎骨折,绝大多数是由骨质疏松所致⑶。

因此探讨糖尿病性骨质疏松症的分子发病机制有重要意义。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81600693）。

第一作者简介：吕秀娟（1982-），女，硕士，主治医生,主要研究方向为糖尿病与骨代谢的关系。

E-mail：wlhgood2000@
通信作者简介:马小羽（1981-），女，博士，副主任医师，主要研究方向为糖尿病与骨代谢的关系。

E-mail：290426403@
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Kloth。

是抗衰老基因,Klotho蛋白以两种形式存在,一种是存在于细胞内的膜型Klotho蛋白（mKlotho 蛋白），另一种是存在于血、尿和脑脊液中的分泌型Klotho蛋白（sKlotho蛋白）°mKlotho蛋白只在表达Klotho的器官中发挥作用，其主要作用是作为纤维生长因子23的辅因子调节机体内钙磷代谢,从而影响骨代谢。

sKlotho在肿瘤、心血管及神经系统中具有抗氧化应激作用，在血管内皮细胞中能抑制P53/ P21通路发挥抗衰老作用［，］°但对于sKlotho在骨代谢中的作用及机制尚无相关报道。

因此,017年1月~2018年12月，本研究对sKlotho在高糖状态下成骨细胞的作用进行探讨，为研究糖尿病性骨质疏松症发病机制及防治提供新靶点°
1材料与方法
1.1细胞、试剂及仪器小鼠成骨细胞株MC3T3- E1（中国科学院细胞库）°改良型a-MEM培养基、1640培养基（美国Hyclone公司）,胎牛血清（德国PAN公司），胰蛋白酶（美国GIBC0公司）DMSO （美国Sigma公司）sKlotho重组蛋白（美国CLOUD­CLONE CORP）,Lipofectamine2000（美国Invitro-gen）CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所）RIPA 裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京碧云天生物技术研究所），兔抗小鼠ALP多抗、兔抗小鼠骨钙素（0C）多抗、兔抗小鼠Runt相关转录因子2（Runx2）多抗（美国Biotechnology）细胞培养箱（美国Thermo Forma Company）低温离心机（科大创新股份有限公司），低温高速离心机（美国Sigma公司），高温灭菌器（本Sanyo）低（本Sanyo），器
（德国Ependoff），倒置显微镜（日本Olympus:酶标仪（美国BIOTEK）,电泳仪（美国BIO-RAD），凝胶成像系统（美国MicroChemi）°
1.2溶液配制高糖培养基:将葡萄糖溶解于100 mL含10%胎牛血清的改良型a-MEM培养基中，过滤，获得浓度为35mmol/L的D-葡萄糖培养基。

sKlotho重组蛋白原液:分别将0.01,0.02,0.1,0.2隅的sKloth。

晶体粉末溶解于1mL双蒸水中，过滤后，得到相应浓度溶液，于-20°C保存。

1.3细胞培养及分组取MC3T3-E1细胞放于含10%胎牛血清改良型a-MEM培养基中，于37C、5%C02培养箱中培养，培养至融合度为50%~ 70%用于后续实验。

将细胞随机分为高糖组、高糖+0.01»g/mL sKlotho组、高糖+0.02pig/mL sK­lotho组、高糖+0.1p g/mL sKlotho组、高糖+0.2 p g/mL sKlotho组,分别加35mmol/L的葡萄糖与相应浓度sKloth。

进行培养，观察sKlotho对高糖状态40下MC3T3-E1细胞增殖与分化功能的影响。

1.4MC3T3-E1细胞增殖能力检测采用CCK-8实验°取各组细胞制成细胞悬液后接种于96孔板
（每孔细胞悬液100mL）,将细胞调整为每孔（6~ 10）X103个，每孔加入PBS200p L,每组设置5个复孔°于37C、5%CO2培养箱中培养24h,加入相应药物干预后，加入CCK-8试剂10p L/孔，继续孵育2h°用酶标仪测定波长450nm处吸光度值（OD）,用OD表MC3T3-E1细胞增能力。

1.5MC3T3-E1细胞内分化蛋白Runx2、OC、ALP 检测采用Western blotting实验。

裂解细胞并收集蛋白样品，用BCA法检测蛋白质浓度，制备上样样本，电泳，转模后将PVDF膜浸入TBST缓慢洗膜3次，每次10min°将PVD F膜浸入封闭液（5% BSA）中，封闭2h°用兔抗小鼠Runx2、OC、ALP、GAPDH孵育PVDF膜，均为1：500，过夜（4C）取出PVDF膜，加入TBST缓慢洗膜3次，每次10min；加入二抗（1：8000）孵育2h,取出PVDF膜，加入TBST缓慢洗膜3次海次10min°检测目的蛋白的表达°
1.6统计学方法采用SPSS2
2.0统计软件。

计量资料经正态检验及方差齐性检验，用X±S表示，多组比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验°P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1sKlotho对高糖状态下MC3T3-E1细胞增殖能力的影响干预72h后，高糖组、高糖+0.01p g/ mL sKlotho组、高糖+0.02pg/mL sKlotho组、高糖+0.1p g/mL sKlotho组、高糖+0.2p g/mL sKlotho 组OD值分别为0.720±0.041,0.824±0.037, 0.917±0.025,1.109±0.032、1.204±0.026°随着sKloth。

浓度升高，OD值逐渐升高，高糖+0.2pg/ mL sKlotho组OD高,与高组异统计学意义（P<0.05）°
2.2不同浓度sKlotho对高糖状态下MC3T3-E1细胞分化能力的影响随着sKloth0浓度升高,Runx2蛋白、0C蛋白、A LP蛋白表达水平逐渐升咼,咼糖+ 0.2pg/mL sKlotho组Runx2蛋白、0C蛋白、ALP蛋白表达水平最高，与高糖组比较差异有统计学意义（P均<0.05）°见表1°
3讨论
骨质疏松的生与体骨关°骨
体积内骨组织（钙、磷等矿物质）、骨基质（如骨胶原、蛋白质、无机盐等）的含量。

骨量越多，骨骼越强壮、坚硬，反之骨骼越脆，越容易断裂。

成骨细胞
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表1不同浓度sKlotho对高糖状态下MC3T3-E1细胞骨分化蛋白表达的影响（珔±s）
组别Runx2蛋白0C蛋白ALP蛋白
高糖组0.647±0.1150.706±0.1400.751±0.135高糖+0.01i g/mL sKlotho组0.910±0.1720.815±0.1150.883±0.205高糖+0.02i g/mL sKlotho组 1.146±0.203 1.204±0.203 1.175±0.216高糖+0.1i g/mL sKlotho组 1.201±0.183 1.373±0.130 1.240±0.169高糖+0.2i g/mLsKlotho组 1.337±0.152 1.564±0.118 1.631±0.246可促进骨骼形成，而破骨细胞破坏旧骨骼。

成骨细胞表面存在胰岛素受体，胰岛素对骨代谢可能有直接作用，胰岛素通过多种途径间接影响骨骼的重建。

胰岛素生长因子（IGF）为多肽类生长因子，与成骨细胞与破骨细胞关系密切。

IGF可作用于骨原细胞，刺激DNA合成,增加成骨细胞数目；调节成骨细胞的分化功能，增加成骨细胞的活性;调节骨吸收,抑制骨胶原的降解。

前期研究发现，糖浓度在35 mmol/L时对MC3T3-E1细胞增殖及分化的抑制作用最强，高糖可显著抑制成骨细胞的增殖与分化。

成骨细胞在成骨过程中经历增殖期、分细胞外基质成熟期及矿化期、凋亡期,在增殖与分化过程中，细胞内一系列基因会参与该过程,调控成骨细胞的增殖与分化。

Runx2基因参与成骨细胞分化过程，调控骨钙素、骨桥蛋白、胶原酶3等基因的转录［6'7］；ALP是骨形成必需的酶,ALP基因在成骨细胞分化早期即开始表达，可作为成骨细胞外基质成熟的标志,是成骨细胞表型和分化的标志;矿化期为成骨细胞分化的晚期，此时0C等开始表达,0C是目前惟一只由成骨细胞产生的基质蛋白，是成骨细胞分化和成熟的标志蛋白。

本研究发现，高糖干预后,MC3T3-E1细胞内Runx2蛋白、0C蛋白、ALP蛋白表达降低，高糖能够抑制MC3T3-E1细胞分化功能。

研究发现,糖尿病患者与大鼠中sKlotho表达减少。

sKlotho基因变异小鼠寿命明显缩短，出现早衰现象，如发育迟缓、认知障碍、运动神经元退化、听力下降及骨量减少,且发生多种钙磷代谢紊乱。

sK­loth。

是一种细胞因子,可通过调节多条细胞通路发挥作用，如抗OS、抗炎,而敲除sKlotho基因后小鼠发生骨代谢异常［8>9］
目前关于sKlotho的研究多集中于心血管疾病、慢性肾疾病、肿瘤及神经系统疾病等,sKloth。

可调节钙离子通道活性［10］,调节胰岛素/IGF-1信号通路［11］，抗氧化应激［12］,调节Wnt信号通路［13］及炎症细胞因子［14］,而在骨代谢中的研究较少。

因此,本研究探讨高糖状态下sKlotho对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖与分化的影响。

为观察高糖状态下MC3T3-E1细胞增殖及分化的变化,本研究设置了0.01、0.02、0.1、0.2i g/mL四个浓度的sKlotho,发现随着sKloth。

浓度升高，其对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖与分化的改善作用越强,sKlotho浓度为0.2i g/mL时作用最强。

说明一定浓度的sK­lotho对高糖状态下MC3T3-E1细胞的增殖能力、分化能力 作用。

综上所述,sKlotho对高糖状态下MC3T3-E1细胞的增殖与分化有改善作用，为糖尿病性骨质疏松症的临床诊治提供了新靶点。

但本研究也有不足之处,未进一步探讨sKlotho的作用机制，仅探讨4组浓度sKlotho的干预效果，将来可扩大浓度范围并进探讨其作用。

参考文献：
[1]朱秋静，余运贤.2型糖尿病伴骨质疏松患者健康素养状况及
影响因素分析[J].中国骨质疏松杂志,2018,24(7)：926-929, 953.
[2]吕志明.2型糖尿病与骨质疏松的关系和临床意义分析[J].中
国现代药物应用,019,13(10)：55-56.
[3]蔡艳，倪梅，廖红芳，等.2型糖尿病患者骨质疏松及骨代谢特
征临床研究[J].实用糖尿病杂志,019,15(2)：9-10. [4]孙虹燕.Survivin及Klotho在胃肠道神经内分泌癌组织及癌旁
组织中的临床表达[J]实用癌症杂志,019,34(5)：724-726.
[5]符千里，潘达亮•成纤维细胞生长因子23与Klotho在血管钙化
相关性的研究进展[J].临床肾脏病杂志,019,19(4)：293-297.
[6]马慧，赵红斌.Runx2蛋白与成骨细胞分化信号[J].医学综述,
2007,13(24)：1959-1962.
[7]廖萌,严孙杰•成骨细胞Toll样受体4信号通路研究进展[J].
中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,013,(3)：260-265. [8]Lin Y,Sun Z.In vivo pancreatic p-cell-specific expression of anti­
aging gene Klotho:a novel approach for preserving p-cells in type 2diabetes[J].Diabetes,2015,64(4)1444-1458.
[9]Liu JJ,Liu S,Morgenthaler NG,et al.Association of plasma solu­
ble a-klotho with pro-endothelin-1in patients with type2diabetes [J].Atherosclerosis,2014,233(2)：415-418.
[10]Chang Q,Hoefs S,van der Kemp AW,et al.The beta-glucuroni­
dase klotho hydrolyzes and activates the TRPV5channel[J].Sci­ence,2005,310(5747)：490493.
[11]Hesse M,Fr hlich LF,Zeitz U,et al.Ablation of vitamin D signa­
ling rescues bone,mineral,and glucose homeostasis in Fgf-23de­ficient mice[J].Matrix Biol,2007,26(2)：75-84. [12]Zuo Z,Lei H,Wang X,et al.Aging-related kidney damage is as­
sociated with a decrease in klotho expression and an increase in su­peroxide production[J].Age(Dordr),2011,33(3)：261-274.
[13]Sun H,Gao Y,Lu K,et al.Overexpression of Klotho suppresses
liver cancer progression and induces cell apoptosis by negatively regulating wnt/p-catenin signaling pathway[J].World J Surg On­col,2015,13：307.
[14]Sanchez-Ni o MD,Sanz AB,Ortiz A.Klotho to treat kidney fibrosis
[J].J Am Soc Nephrol,2013,24(5)：687-689
(收稿日期：2019-05-27)
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