米曲霉木糖醇脱氢酶的分子模建与对接
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+ ICM-Pro ， Zn 2 + 作用的相关残基 。 寻找底物木糖醇与 XDH 结合的 对辅因子进行对接， 预测了 XDH 与 NAD 、
可能活性口袋， 用 Molsoft 模拟 XDH 与木糖醇的对接， 预测了酶与底物作用的关键氨基酸残基。【结果 】 结构 分析显示， 米曲霉 XDH 含有醇脱氢 酶 家 族 锌 指 纹 结 构 和 典 型 醇 脱 氢 酶 Rossmann 折 叠 的 辅 酶 结 合 域， 属于
木糖醇脱氢酶 （ XDH ，EC1. 1. 1. 9 ） 是 真 核 微 生 物木糖代谢的关键 酶 之 一， 酵母和真菌主要通过氧 化还 原 途 径 吸 收 利 用 木 糖 。 即 木 糖 首 先 由 依 赖 NAD （ P ） H 的 木 糖 还 原 酶 （ XR ，EC1. 1. 1. 21 ） 还 原
2+ 拟 XDH 与底物木糖醇 、 辅酶和 Zn 发 生 作 用， 寻找
探讨酶与底物的作用机制， 潜在的活性氨基酸残基， 为后续的米曲霉 XDH 定向改造提供依据 。
1
1. 1
材料和方法
材料 菌种和质粒： Aspergillus oryzae 2120 和 2012 ，
Zn 2 + 相 结 合 的 复 合 物 。 用 LPC 程 序 分 析 模 板 1pl8
2
2. 1
结果和讨论
米曲霉木糖醇脱氢酶基因同源比对分析 A． oryzae 2120 和 2012 XDH 基因克隆后测序结
果 如 图 1 所 示，NCBI 登 录 号 为 GQ222266 和
950
Hongwen Chen et al． / Acta Microbiologica Sinica （ 2011 ） 51 （ 7 ）
陈宏文等： 米曲霉木糖醇脱氢酶的分子模建与对接 ． / 微生物学报（ 2011 ） 51 （ 7 ）
949
有极高的食品安全性 。 米曲霉能分泌大量的胞外木 聚糖 降 解 酶
［10］
T 载体连接， 连 接 产 物 转 化 E． coli DH5 α 感 受 态 细 胞 以 及 阳 性 克 隆 子 鉴 定。 测 序 由 上 海 英 骏 （ Invitrogen ） 生物技术 公 司 完 成， 返回的测序结果翻 译成蛋白质与不同来源的木糖醇脱氢酶氨基酸进行 序列比对 。 1. 3 同源建模 通过同源建模 服 务 器 SWISS-MODEL 自 动 返 回 一 个 目 标 模 型 。 选 择 Swiss-Model 返 回 的 SWISS MODEL WORKSPACE 中同源性较高的 3 个模板， 在 软件 Modeller9v4 环 境 下 手 动 建 模 得 到 另 外 3 个 目 标模型 。 1. 4 模型评价 用在线评价 服 务 器 PROCHECK 对 2 种 方 法 所 评 价 模 型 质 量； 同 时 用 Prosa2003 建模型进行 分 析， 对所建模型进行残 基 能 量 分 析， 确定质量最好的模 型进行 后 续 对 接 研 究 。 通 过 VAST 搜 索 XDH 结 构 域， 再通过 CDD 搜索可能含有的家族结构域 。 1. 5 模型与辅助因子的对接 最终模型 所 用 的 模 板 1pl8 （ PDB 登 陆 号 ） 是 一
+ 为木糖醇， 然后 木 糖 醇 由 依 赖 NAD 的 木 糖 醇 脱 氢
（ 源于木糖的最主要化学 品 ） 方 面， 研究通过分子手
［6］ 段抑制 XDH 酶活力 提 高 木 糖 醇 得 率 等 。 目 前 微
生物来源的只有 Gluconobacter oxydans 的 XDH 有 晶 体结构和功 能 研 究
图1
Fig． 1
不同来源 XDH 多序列比对
Multiple sequence alignment of XDH from different origins． The residues involved in the coenzyme ，catalytic zinc and xylitol and triangles （ ▼ ） ． Rectangular pane represents Zinc-containing alcohol
， 利 用 模 型 预 测 XDH 结 构 和
［7］ 功能， 所 报 道 的 菌 种 主 要 有 Candida tropicalis 、
Rhizobium etli［8］ 、 Pichia angusta［9］ 等 。 米曲霉（ Aspergillus oryzae ） 是一种重要工业微生 物， 应用于食品加工和发酵工业已有几千年历史， 具
Ile349 、 Lys350 和 Thr351 ， 催化域， 与天然底物木糖醇形成氢 键 的 氨 基 酸 有 Ile46 、 位 于 催 化 域。 【结 论 】 所得 信息对 XDH 分子定向改造 、 拓展米曲霉工业应用范围有重要意义 。 关键词 ： 木糖醇脱氢酶， 米曲霉， 同源建模， 分子对接 中图分类号 ： 文献标识码 ： A 6209 （ 2011 ） 07094808 文章编号 ：0001［1 － 2］ ， 酒酵母中异源过量 表 达 XDH 通过分子改造改 ［3 － 5］ 变 XDH 的 辅 酶 依 赖 性 等； 在 木 糖 转 化 木 糖 醇
+ 种来源于人的琥珀酸脱氢酶与辅酶 NAD 以及配体
— — — β1， 4-D-内 切 木 聚 糖 酶 、 1， 4β［11］
D-木糖苷酶和 α -L-阿拉 伯 呋 喃 糖 苷 酶， 而且近年发 — — XDH 现其 胞 内 也 含 有 木 糖 代 谢 的 关 键 酶 — 。 2005 年破译的米曲霉基因 组 数 据 显 示， 米曲霉的碱 基对数在当时已破 译 基 因 组 的 微 生 物 中 是 最 多 的， 基因数量也比相近的曲 霉 多 出 30% 左 右， 具有许多 独特的生物特征
［12］
， 这为拓宽米曲霉的工业应用范
围提供了可能， 即米 曲 霉 不 仅 可 用 于 酿 酒 业 淀 粉 糖 化， 还有可能用 于 木 质 纤 维 素 的 多 元 糖 醇 生 产 。 目 前国内外关于米曲 霉 XDH 结 构 和 功 能 的 研 究 鲜 有 报道， 本文在克隆 米 曲 霉 XDH 基 因 基 础 上， 通过序 XDH 三 级 结 构 同 源 建 模 、 列比对 、 利用分子对接模
+ Medium-chain 脱氢酶（ MDR ） 家族 。 通过对接研究， 预测了 XDH 与 NAD 之间形成氢键的氨基酸有 Asp206 、 2+ Arg211 、 Ser255 、 Ser301 和 Arg303 ， 这些氨基酸位于结合域， 与 Zn 形成氢键的氨基酸有 His72 和 Glu73 ， 位于
基金项目：国家自然科学基金（ （ 20676048 ） ；教育部留学回国人员科研启动基金（ 2010 ） ；福 建 省 自 然 科 学 基 金 （ D0810015 ） ；福 建 省 高 等 学 2R1112 ） 校新世纪优秀人才支持计划（ 07 FJRC03 ） ；华侨大学基本科研业务费专项基金（ JB*
592 2185869 ； E-mail ： fbs@ xmu． edu． cn 通信作者 。 Tel ： + 86 -
595 22692447 ； E-mail ： chenhw@ 作者简介 ： 陈宏文（ 1969 － ） ， 女， 浙江德清人， 副教授， 博士， 研究方向生物代谢工程和酶工程 。 Tel ： + 86hqu． edu． cn 收稿日期 ：2011 -01 -25 ； 修回日期 ：2011 -03 -29
研究报告
米曲霉木糖醇脱氢酶的分子模建与对接
1 1 1 2* 陈宏文 ，苟元波 ，张卡 ，方柏山
1 2
华侨大学化工学院生物工程与技术系， 厦门 厦门大学化学化工学院， 厦门 361005
361021
摘要： 【目的 】 研究米曲霉木糖醇脱氢酶基因的结构与功能。【方法 】 克隆测序来源于米曲霉的木糖醇脱氢 酶 （ XDH ） 基因， 利用 Swiss-MODEL 和 Modeller 对 XDH 进行三级结构模建， 通过 PROCHECK 和 Prosa2003 对得 到的 4 个目标模型 进 行 评 价， 从 中 得 到 一 个 最 佳 模 型 。 在 同 源 建 模 的 基 础 上， 通 过 分 子 对 接 软 件 Molsoft
［5］
酶氧化成木酮糖， 后 者 再 被 磷 酸 化 成 5-磷 酸 木 酮 糖 进入戊糖磷酸途径 。 木糖是可再生木质纤维素中仅 次于葡萄糖的第二 大 糖 类， 其有效利用已日益成为 工业生物 技 术 研 究 热 点 。 XDH 的 相 关 研 究 具 有 重 要的应用价值， 如在木糖转化燃料酒精方面， 研究酿
米曲霉能分泌大量的胞外木聚糖降解酶1014d内切木聚糖酶14d木糖苷酶和l阿拉伯呋喃糖苷酶而且近年发现其胞内也含有木糖代谢的关键酶xdh112005年破译的米曲霉基因组数据显示米曲霉的碱基对数在当时已破译基因组的微生物中是最多的基因数量也比相近的曲霉多出30左右具有许多独特的生物特征12这为拓宽米曲霉的工业应用范围提供了可能即米曲霉不仅可用于酿酒业淀粉糖化还有可能用于木质纤维素的多元糖醇生产
基通过序列比对的 方 式 查 找 在 目 标 模 型 XDH 中 相 对应的残基的相似性 。 通 过 软 件 Molsoft ICM-Pro （ Version 3. 5 a ） 对 同 近 源建 模 得 到 的 最 佳 模 型 与 模 板 1 pl8 进 行 重 叠 ， 似确定辅 助 因 子 的 大 概 位 置。 去 掉 模 板 链， 留下 目标模型中 模板链的 辅 因 子。若 重 叠 效 果 较 好， 辅助因子的大概位置也就在模板链辅 因 子 位 置 附 近。再以当前辅因子周围的氨基 酸 为 可 能 结 合 位 进行分子对接， 找到目标模型与辅因子的结合 点， 位点。 1. 6 模型与底物的对接 底物分子木糖醇（ Xylitol ） 化学结构文件 可 以 从 KEGG 获 取 。 辅 酶 对 接 好 后，用 Molsoft 中 的 icmPocketFinder 程序搜索活性口袋；模拟 XDH 与 木 糖醇对接， 分析对接结果 。
+ Zn 2 + 发生作用的残基， 中与 NAD 、 将分析得到的残
1. 1. 1
购自中 国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 。 E． coli DH5 α 实验室保 存； pUC19 质 粒 购 自 大 连 宝 生 物 有 限公司； pUCm-T 多 克 隆 载 体 购 自 上 海 生 物 工 程 有 限公司 。 1. 1. 2 主 要 试 剂 和 仪 器： Taq DNA polymerase 、 Rnase A 、 dNTP 、 Taq Plus DNA polymerase 、 EZ Spin Column DNA Gel Extraction KIT 、 EZ Column Plasmid T 4 连接酶 购 自 上 海 生 物 工 程 有 限 公 Mini-Preps Kit 、 司；所用限制性内切酶 、 分子质量标准购自大连宝生 物有限公 司； 引 物 由 上 海 生 物 工 程 有 限 公 司 合 成 。 PCR 仪 （ DNA Engine ） ， BIO-RAD ； 电 泳 仪 （ DYY8C ） ， 北 京 市 六 一 仪 器 厂； 凝 胶 成 像 系 统 （ GIS2008 ） ， 上海天能公司 。 1. 1. 3 主要数 据 库 和 软 件： 国 际 互 联 网 上 的 生 物 Chimera 、 VMD 信息 学 数 据 库； 可 视 化 软 件 Rasmol 、 等； 对 接 软 件 Molsoft ICM-Pro ； 分 析 编 辑 软 件 BioEdit 、 Modeller9v4 、 Clustal X 、 TreeView 、 Prosa2003 等。 1. 2 米曲霉木糖醇脱氢酶基因克隆 基因 克 隆 按 分 子 生 物 学 手 册 操 作， 主要包括米 PCR 扩增 xdh ， xdh 与 pUCm曲霉基因组 DNA 提取，ta Microbiologica Sinica 51 （ 7 ） ：948 － 955 ； 4 July 2011 ISSN 0001 － 6209 ； CN 11 － 1995 / Q http ： / / journals． im． ac． cn / actamicrocn
可能活性口袋， 用 Molsoft 模拟 XDH 与木糖醇的对接， 预测了酶与底物作用的关键氨基酸残基。【结果 】 结构 分析显示， 米曲霉 XDH 含有醇脱氢 酶 家 族 锌 指 纹 结 构 和 典 型 醇 脱 氢 酶 Rossmann 折 叠 的 辅 酶 结 合 域， 属于
木糖醇脱氢酶 （ XDH ，EC1. 1. 1. 9 ） 是 真 核 微 生 物木糖代谢的关键 酶 之 一， 酵母和真菌主要通过氧 化还 原 途 径 吸 收 利 用 木 糖 。 即 木 糖 首 先 由 依 赖 NAD （ P ） H 的 木 糖 还 原 酶 （ XR ，EC1. 1. 1. 21 ） 还 原
2+ 拟 XDH 与底物木糖醇 、 辅酶和 Zn 发 生 作 用， 寻找
探讨酶与底物的作用机制， 潜在的活性氨基酸残基， 为后续的米曲霉 XDH 定向改造提供依据 。
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材料和方法
材料 菌种和质粒： Aspergillus oryzae 2120 和 2012 ，
Zn 2 + 相 结 合 的 复 合 物 。 用 LPC 程 序 分 析 模 板 1pl8
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结果和讨论
米曲霉木糖醇脱氢酶基因同源比对分析 A． oryzae 2120 和 2012 XDH 基因克隆后测序结
果 如 图 1 所 示，NCBI 登 录 号 为 GQ222266 和
950
Hongwen Chen et al． / Acta Microbiologica Sinica （ 2011 ） 51 （ 7 ）
陈宏文等： 米曲霉木糖醇脱氢酶的分子模建与对接 ． / 微生物学报（ 2011 ） 51 （ 7 ）
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有极高的食品安全性 。 米曲霉能分泌大量的胞外木 聚糖 降 解 酶
［10］
T 载体连接， 连 接 产 物 转 化 E． coli DH5 α 感 受 态 细 胞 以 及 阳 性 克 隆 子 鉴 定。 测 序 由 上 海 英 骏 （ Invitrogen ） 生物技术 公 司 完 成， 返回的测序结果翻 译成蛋白质与不同来源的木糖醇脱氢酶氨基酸进行 序列比对 。 1. 3 同源建模 通过同源建模 服 务 器 SWISS-MODEL 自 动 返 回 一 个 目 标 模 型 。 选 择 Swiss-Model 返 回 的 SWISS MODEL WORKSPACE 中同源性较高的 3 个模板， 在 软件 Modeller9v4 环 境 下 手 动 建 模 得 到 另 外 3 个 目 标模型 。 1. 4 模型评价 用在线评价 服 务 器 PROCHECK 对 2 种 方 法 所 评 价 模 型 质 量； 同 时 用 Prosa2003 建模型进行 分 析， 对所建模型进行残 基 能 量 分 析， 确定质量最好的模 型进行 后 续 对 接 研 究 。 通 过 VAST 搜 索 XDH 结 构 域， 再通过 CDD 搜索可能含有的家族结构域 。 1. 5 模型与辅助因子的对接 最终模型 所 用 的 模 板 1pl8 （ PDB 登 陆 号 ） 是 一
+ 为木糖醇， 然后 木 糖 醇 由 依 赖 NAD 的 木 糖 醇 脱 氢
（ 源于木糖的最主要化学 品 ） 方 面， 研究通过分子手
［6］ 段抑制 XDH 酶活力 提 高 木 糖 醇 得 率 等 。 目 前 微
生物来源的只有 Gluconobacter oxydans 的 XDH 有 晶 体结构和功 能 研 究
图1
Fig． 1
不同来源 XDH 多序列比对
Multiple sequence alignment of XDH from different origins． The residues involved in the coenzyme ，catalytic zinc and xylitol and triangles （ ▼ ） ． Rectangular pane represents Zinc-containing alcohol
， 利 用 模 型 预 测 XDH 结 构 和
［7］ 功能， 所 报 道 的 菌 种 主 要 有 Candida tropicalis 、
Rhizobium etli［8］ 、 Pichia angusta［9］ 等 。 米曲霉（ Aspergillus oryzae ） 是一种重要工业微生 物， 应用于食品加工和发酵工业已有几千年历史， 具
Ile349 、 Lys350 和 Thr351 ， 催化域， 与天然底物木糖醇形成氢 键 的 氨 基 酸 有 Ile46 、 位 于 催 化 域。 【结 论 】 所得 信息对 XDH 分子定向改造 、 拓展米曲霉工业应用范围有重要意义 。 关键词 ： 木糖醇脱氢酶， 米曲霉， 同源建模， 分子对接 中图分类号 ： 文献标识码 ： A 6209 （ 2011 ） 07094808 文章编号 ：0001［1 － 2］ ， 酒酵母中异源过量 表 达 XDH 通过分子改造改 ［3 － 5］ 变 XDH 的 辅 酶 依 赖 性 等； 在 木 糖 转 化 木 糖 醇
+ 种来源于人的琥珀酸脱氢酶与辅酶 NAD 以及配体
— — — β1， 4-D-内 切 木 聚 糖 酶 、 1， 4β［11］
D-木糖苷酶和 α -L-阿拉 伯 呋 喃 糖 苷 酶， 而且近年发 — — XDH 现其 胞 内 也 含 有 木 糖 代 谢 的 关 键 酶 — 。 2005 年破译的米曲霉基因 组 数 据 显 示， 米曲霉的碱 基对数在当时已破 译 基 因 组 的 微 生 物 中 是 最 多 的， 基因数量也比相近的曲 霉 多 出 30% 左 右， 具有许多 独特的生物特征
［12］
， 这为拓宽米曲霉的工业应用范
围提供了可能， 即米 曲 霉 不 仅 可 用 于 酿 酒 业 淀 粉 糖 化， 还有可能用 于 木 质 纤 维 素 的 多 元 糖 醇 生 产 。 目 前国内外关于米曲 霉 XDH 结 构 和 功 能 的 研 究 鲜 有 报道， 本文在克隆 米 曲 霉 XDH 基 因 基 础 上， 通过序 XDH 三 级 结 构 同 源 建 模 、 列比对 、 利用分子对接模
+ Medium-chain 脱氢酶（ MDR ） 家族 。 通过对接研究， 预测了 XDH 与 NAD 之间形成氢键的氨基酸有 Asp206 、 2+ Arg211 、 Ser255 、 Ser301 和 Arg303 ， 这些氨基酸位于结合域， 与 Zn 形成氢键的氨基酸有 His72 和 Glu73 ， 位于
基金项目：国家自然科学基金（ （ 20676048 ） ；教育部留学回国人员科研启动基金（ 2010 ） ；福 建 省 自 然 科 学 基 金 （ D0810015 ） ；福 建 省 高 等 学 2R1112 ） 校新世纪优秀人才支持计划（ 07 FJRC03 ） ；华侨大学基本科研业务费专项基金（ JB*
592 2185869 ； E-mail ： fbs@ xmu． edu． cn 通信作者 。 Tel ： + 86 -
595 22692447 ； E-mail ： chenhw@ 作者简介 ： 陈宏文（ 1969 － ） ， 女， 浙江德清人， 副教授， 博士， 研究方向生物代谢工程和酶工程 。 Tel ： + 86hqu． edu． cn 收稿日期 ：2011 -01 -25 ； 修回日期 ：2011 -03 -29
研究报告
米曲霉木糖醇脱氢酶的分子模建与对接
1 1 1 2* 陈宏文 ，苟元波 ，张卡 ，方柏山
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华侨大学化工学院生物工程与技术系， 厦门 厦门大学化学化工学院， 厦门 361005
361021
摘要： 【目的 】 研究米曲霉木糖醇脱氢酶基因的结构与功能。【方法 】 克隆测序来源于米曲霉的木糖醇脱氢 酶 （ XDH ） 基因， 利用 Swiss-MODEL 和 Modeller 对 XDH 进行三级结构模建， 通过 PROCHECK 和 Prosa2003 对得 到的 4 个目标模型 进 行 评 价， 从 中 得 到 一 个 最 佳 模 型 。 在 同 源 建 模 的 基 础 上， 通 过 分 子 对 接 软 件 Molsoft
［5］
酶氧化成木酮糖， 后 者 再 被 磷 酸 化 成 5-磷 酸 木 酮 糖 进入戊糖磷酸途径 。 木糖是可再生木质纤维素中仅 次于葡萄糖的第二 大 糖 类， 其有效利用已日益成为 工业生物 技 术 研 究 热 点 。 XDH 的 相 关 研 究 具 有 重 要的应用价值， 如在木糖转化燃料酒精方面， 研究酿
米曲霉能分泌大量的胞外木聚糖降解酶1014d内切木聚糖酶14d木糖苷酶和l阿拉伯呋喃糖苷酶而且近年发现其胞内也含有木糖代谢的关键酶xdh112005年破译的米曲霉基因组数据显示米曲霉的碱基对数在当时已破译基因组的微生物中是最多的基因数量也比相近的曲霉多出30左右具有许多独特的生物特征12这为拓宽米曲霉的工业应用范围提供了可能即米曲霉不仅可用于酿酒业淀粉糖化还有可能用于木质纤维素的多元糖醇生产
基通过序列比对的 方 式 查 找 在 目 标 模 型 XDH 中 相 对应的残基的相似性 。 通 过 软 件 Molsoft ICM-Pro （ Version 3. 5 a ） 对 同 近 源建 模 得 到 的 最 佳 模 型 与 模 板 1 pl8 进 行 重 叠 ， 似确定辅 助 因 子 的 大 概 位 置。 去 掉 模 板 链， 留下 目标模型中 模板链的 辅 因 子。若 重 叠 效 果 较 好， 辅助因子的大概位置也就在模板链辅 因 子 位 置 附 近。再以当前辅因子周围的氨基 酸 为 可 能 结 合 位 进行分子对接， 找到目标模型与辅因子的结合 点， 位点。 1. 6 模型与底物的对接 底物分子木糖醇（ Xylitol ） 化学结构文件 可 以 从 KEGG 获 取 。 辅 酶 对 接 好 后，用 Molsoft 中 的 icmPocketFinder 程序搜索活性口袋；模拟 XDH 与 木 糖醇对接， 分析对接结果 。
+ Zn 2 + 发生作用的残基， 中与 NAD 、 将分析得到的残
1. 1. 1
购自中 国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 。 E． coli DH5 α 实验室保 存； pUC19 质 粒 购 自 大 连 宝 生 物 有 限公司； pUCm-T 多 克 隆 载 体 购 自 上 海 生 物 工 程 有 限公司 。 1. 1. 2 主 要 试 剂 和 仪 器： Taq DNA polymerase 、 Rnase A 、 dNTP 、 Taq Plus DNA polymerase 、 EZ Spin Column DNA Gel Extraction KIT 、 EZ Column Plasmid T 4 连接酶 购 自 上 海 生 物 工 程 有 限 公 Mini-Preps Kit 、 司；所用限制性内切酶 、 分子质量标准购自大连宝生 物有限公 司； 引 物 由 上 海 生 物 工 程 有 限 公 司 合 成 。 PCR 仪 （ DNA Engine ） ， BIO-RAD ； 电 泳 仪 （ DYY8C ） ， 北 京 市 六 一 仪 器 厂； 凝 胶 成 像 系 统 （ GIS2008 ） ， 上海天能公司 。 1. 1. 3 主要数 据 库 和 软 件： 国 际 互 联 网 上 的 生 物 Chimera 、 VMD 信息 学 数 据 库； 可 视 化 软 件 Rasmol 、 等； 对 接 软 件 Molsoft ICM-Pro ； 分 析 编 辑 软 件 BioEdit 、 Modeller9v4 、 Clustal X 、 TreeView 、 Prosa2003 等。 1. 2 米曲霉木糖醇脱氢酶基因克隆 基因 克 隆 按 分 子 生 物 学 手 册 操 作， 主要包括米 PCR 扩增 xdh ， xdh 与 pUCm曲霉基因组 DNA 提取，ta Microbiologica Sinica 51 （ 7 ） ：948 － 955 ； 4 July 2011 ISSN 0001 － 6209 ； CN 11 － 1995 / Q http ： / / journals． im． ac． cn / actamicrocn