肾上腺髓质素对大鼠心肌成纤维细胞胶原合成的影响

肾上腺髓质素对大鼠心肌成纤维细胞胶原合成的影响
任芳;李家富;汪克纯
【摘要】目的:观察肾上腺髓质素(ADM)对大鼠心肌成纤维细胞(FBC)胶原合成的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:用差速贴壁分离法获得心肌成纤维细胞为材料,用放射免疫法测定细胞培养上清液中Ⅰ及Ⅲ型前胶原末端肽(PINP、PCⅢ)的含量.结果:①ADM呈浓度依赖性抑制FBC的PINP、PCⅢ分泌;②在AngⅡ存在的情况下,PKA抑制剂能完全阻断ADM抑制细胞PINP、PCⅢ分泌的作用;③在基础状态和AngⅡ刺激下,PKC及酪氨酸蛋白激酶抑制剂均能增强ADM作用.结论;①ADM 能够抑制FBC胶原合成;②ADM抑制FBC胶原合成是通过PKA途径介导.
【期刊名称】《长江大学学报（自科版）医学卷》
【年(卷),期】2007(004)002
【总页数】4页(P114-117)
【关键词】肾上腺髓质素;胶原合成;蛋白激酶抑制剂
【作者】任芳;李家富;汪克纯
【作者单位】重庆市中山医院急诊科,重庆,400013;泸州医学院附属医院心内科,四川,泸州,646000;长江大学附属第一医院,荆州市第一人民医院心内科,湖北,荆
州,434000
【正文语种】中文
【中图分类】R329.3
高血压左室肥厚的防治已成为当今高血压防治的热点问题，心肌纤维化是高血压性心脏病心肌重塑的关键性病理特征之一。

心肌中I型和III型胶原异常堆积在间质
和血管周围，助长了心功能﹑冠脉储备和心电活动的异常，导致高血压患者的转归不良。

本实验应用细胞培养技术，用放射免疫法测定细胞培养上清液中I及III型
前胶原末端肽(PINP、PCIII)的含量，以观察肾上腺髓质素(ADM)[1]对胶原合成的
影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物选用出生1～4 d雄性Wistar大鼠，泸州医学院实验标准动物中心提供。

1.1.2 主要实验试剂和仪器 DMEM培养基(GIBCO公司)。

胰蛋白酶， ADM，AngII,H-89，Staurosporine(Stau),Genistein(Gen)，小牛血清等均为Sigma公
司产品。

PINP及PCIII由上海海军生物研究所提供。

CO2孵箱(SHELL/JBTC2323型)，倒置显微镜(重庆光学仪器厂)。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养及鉴定取下1～4 d龄雄性Wistar大鼠心室，采用胰蛋白酶消化，差速贴壁分离法去除心肌细胞，获得心肌成纤维细胞(FBC)，经倒置显微镜和免疫
组化波形蛋白染色阳性鉴定为FBC，选用第二代细胞用于实验。

1.2.2 实验分组及处理
1)观察ADM对FBC胶原合成的影响实验共分10组，每组重复3孔，取平均数。

每孔均加入含10%血清的DMEM。

空白对照组：不加药物；不同剂量ADM组：分别加入10-8M ADM﹑10-7M ADM﹑10-6M ADM﹑10-5M ADM；AngII组：加入10-6M AngII；AngII+不同剂量ADM组：分别加入10-8M ADM、10-7M
ADM、10-6M ADM、10-5M ADM以及10-6M AngII。

2) ADM影响FBC胶原合成的胞内信号转导途径的研究分别采用PKA抑制剂(H-89)、PKC抑制剂(staurosporine)、酪氨酸蛋白激酶抑制剂(Genistein)进行干预研究。

每种抑制剂组各设8组。

设置：空白对照组：不加药物；ADM对照组：加入10-7M ADM；AngII对照组：加入10-6M AngII；AngII+ADM对照组：加入10-7M ADM和10-6M AngII；抑制剂对照组：加入10-5M H-89/10-6M Stau/10-5M Gen；抑制剂+AngII组：加入10-5M H-89/10-6M Stau/10-5M Gen和10-6M AngII；抑制剂+ADM组：加入10-5M H-89/10-6M Stau/10-5M Gen和10-7M ADM；抑制剂+AngII+ADM组：加入10-5M H-89/10-6M Stau/10-5M Gen和10-6M AngII以及10-7M ADM。

1.2.3 放射免疫法测定细胞培养上清液中PINP、PCIII含量取对数生长期FBC稀释成5×104 细胞/孔，均匀接种于96孔培养板上，37℃、5%CO2 及饱和湿度条件下培养，24 h后换成含1%血清DMEM培养基。

37℃继续孵育24 h，使细胞进入生长静止期，弃上清，每孔加入含10%血清DMEM培养基，再分别加入各干预药物，继续培养48 h，收集每孔上清液，根据PINP(μg/L)、PCIII(μg/L)的RIA Kit提供的说明书进行操作。

1.3 统计学处理所有数据用表示。

用SPSS10.0软件包单因素方差分析进行统计学处理。

两两比较采用LSD法。

P<0.05为有统计学意义。

2 结果
2.1 ADM对FBC培养上清液中PINP、PCIII含量的影响 AngII明显刺激PINP、PCIII的分泌。

ADM对基础状态及AngII刺激下的PINP、PCIII分泌有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性，尤其10-5M浓度的ADM几乎能完全抑制AngII刺激的PINP、PCIII分泌。

见表1。

表1 ADM对FBC培养上清液中PINP、PCIII含量的影响组别PINP含量抑制率
/%PCIII含量抑制率/%空白对照组1 20±0 04270 04±2 4310-5MADM组0 17±0 15a85 59168 42±9 75a33 5310-6MADM组0 41±0 02a65 59177
29±6 62a30 0310-7MADM组0 58±0 02a52 04203 57±11 50a19 6610-
8MADM组0 87±0 06a28 01231 61±9 78a8 59AngII组3 40±0 09a411
00±14 64a10-5MADM+AngII组1 31±0 10b95 00257 15±11 38b97 6010-6MADM+AngII组1 60±0 11ab82 13294 55±12 39ab73 8810-
7MADM+AngII组1 99±0 12ab64 35311 05±11 11ab63 4110-
8MADM+AngII组2 53±0 14ab39 70362 09±25 33ab31 03注：与空白对照组比较，aP<0.01；与AngII组比较，bP<0.01。

2.2 ADM抑制PINP、PCIII分泌作用的细胞内信号转导途径
2.2.1 PKA抑制剂H-89的影响在基础状态和AngII刺激状态下，H-89(10-5M)与ADM(10-7M)共同孵育均能完全拮抗ADM对PINP、PCIII分泌的抑制作用。

见表2和表3。

表2 H-89对基础状态下FBC分泌PINP/PCIII的影响组别PINPPCIII空白对照组1 15±0 07251 38±16 0010-7MADM组0 66±0 03a203 70±16 13aH⁃89组1 17±0 06257 02±7 09ADM+H⁃89组1 15±0 07b249 71±9 51b注：与空白对照组比较，aP<0.01；与ADM组比较，bP<0.01。

表3 H-89对AngII刺激下FBC分泌PINP/PCIII的影响组别PINPPCIII空白对照组1 15±0 07251 38±16 00AngII组2 94±0 17407 40±20 67AngII+H⁃89组2 98±0 139412 65±7 80AngII+ADM组1 96±0 176a312 48±5
70aAngII+ADM+H⁃89组2 95±0 05b408 29±4 16b注：与AngII组比较，aP<0.01；与AngII+ADM组比较，bP<0.01。

2.2.2 PKC抑制剂Stau的影响在基础状态和AngII刺激下，Stau(10-6M)与ADM(10-7M)共同孵育均能显著抑制细胞PINP和PCIII的分泌，且二者合用组的
作用明显强于二者单独作用组，提示在细胞PINP、PCIII的分泌上，Stau与
ADM有协同作用。

见表4，表5。

表4 Stau对基础状态下FBC分泌PINP/PCIII的影响组别PINPPCIII空白对照组1 15±0 07251 38±16 0010-7MADM组0 66±0 03ab203 70±16 13abStau组0 73±0 04ab212 43±11 53abADM+Stau组0 37±0 06a167 23±6 43a注：与空白对照组比较，aP<0.01；与ADM+Stau组比较，bP<0.01。

表5 Stau对AngII刺激下FBC分泌PINP/PCIII的影响组别PINPPCIII空白对照组1 15±0 07251 38±16 00AngII组2 94±0 17407 40±20 67AngII+Stau组2 09±0 05ab336 92±4 99abAngII+ADM组1 96±0 18ab312 48±5
70abAngII+ADM+Stau组1 14±0 05a245 06±12 68a注：与AngII组比较，aP<0.01；与AngII+ADM+Stau组比较，bP<0.01。

2.2.3 酪氨酸蛋白激酶抑制剂Gen的影响在基础状态和AngII刺激下，Gen(10-
5M)与ADM(10-7M)共同孵育均能显著抑制细胞PINP、PCIII的分泌，且二者合
用组的作用明显强于二者单独作用组,提示在细胞PINP、PCIII的分泌上，Gen与ADM有协同作用。

见表6，表7。

表6 Gen对基础状态下FBC分泌PINP/PCIII的影响组别PINPPCIII空白对照组
1 153±0 07251 38±16 0010-7MADM组0 664±0 003bc203 70±16
13bcGen组0 810±0 01bc226 50±7 69adADM+Gen组0 467±0 05b176
87±3 48b注：与空白对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与ADM+Gen组比较，cP<0.05，dP<0.01。

表7 Gen对AngII刺激下FBC分泌PINP/PCIII的影响组别PINPPCIII空白对照组1 153±0 07251 38±16 00AngII组2 939±0 17407 40±20 67AngII+Gen组2 221±0 09ab349 08±4 78ab AngII+ADM组1 957±0 18ab312 48±5
70abAngII+ADM+Gen组1 365±0 05a265 23±8 15a注：与AngII组比较，
aP<0.01；与AngII+ADM+Gen组比较，bP<0.01。

3 讨论
心肌间质为纤维结缔组织，由成纤维细胞、肌成纤维细胞、瓣膜间质细胞等多种细胞及细胞外基质组成。

基质中主要为胶原，存在于心脏的胶原可以分为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ五型。

其中Ⅰ型占80%，Ⅲ型占12%，二者均主要由成纤维细胞产生和分泌。

正常人体，心肌胶原的合成和降解是一个动态平衡过程，一旦平衡打破，胶原在间质中异常堆积即引起心肌纤维化，胶原的堆积以Ⅰ、Ⅲ型胶原意义较大，特别是I型胶原。

I、III型胶原是以含有一个氨基端和一个羧基端的前胶原的形式在成纤维细胞中合
成的。

当被分泌到细胞外后，在特异性蛋白酶催化下切去前体序列，进而形成胶原小纤维及胶原纤维。

被切下的前体序列(PCI/PCIII和PINP/PIIINP)被释放进入血流。

前体序列与Ⅰ、Ⅲ型胶原之间存在化学计量上的1∶1的关系，故测定
PCI/PCIII和PINP/PIIINP水平可反映组织纤维化状况。

在培养的细胞中，Ⅰ、Ⅲ型胶原前体序列的测定被证实是一种准确，快速，简便易行的评估纤维化的方法[2]。

目前，已在实验室广泛采用。

本实验结果显示ADM在基础状态和AngII刺激下均能呈浓度依赖性抑制FBC的PINP、PCIII分泌。

特别是10-5M浓度的ADM几乎完全抑制了AngII刺激下的PINP、PCIII分泌。

提示ADM可作为心肌纤维化的抑制因子，通过抑制胶原的合成而发挥其抗纤维化作用，且随着ADM浓度的增大，其抑制作用增强。

目前对ADM作用途径的研究较多，但各种报道不一，主要集中在cAMP/PKA、PLC/PKC、酪氨酸蛋白激酶(TPK)三条途径上。

本实验采用PKA抑制剂H-89、PKC抑制剂Stau、TPK抑制剂Gen进行干预试验。

结果显示在AngII存在的情
况下，H-89能完全阻断ADM抑制细胞PINP、PCIII分泌的作用，提示ADM在FBC上抑制胶原合成的作用是通过PKA介导的。

PKC及TPK抑制剂与ADM共同
作用，并未阻断ADM的作用，反而有所增强，提示ADM在FBC上抑制胶原合成的作用并非通过PKC及TPK途径介导。

[参考文献]
[1]Kitammura K, Kangwa K, Kawamoto M,et al.Adrenomedullin, a novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma[J].Biophys Res COMMUN, 1993, 192: 553-560.
[2] 孙少俐.高血压心肌纤维化与药物干预[J].医学综述, 2004, 10(7)：409-412.。