餐饮高浓度含油废水降解菌筛选及降解特性研究

餐饮高浓度含油废水降解菌筛选及降解特性研究
卢永昌1,张继龙2,张建栋3,高丽丽1
(1.太原理工大学环境科学与工程学院,山西太原030024;2.太原理工大学矿业工程学院,
山西太原030024;3.太原理工大学生物医学工程学院,山西太原030024)
[摘要]通过富集培养从下水道污泥中分离出一株高效油脂降解菌LYC46-2。

16S rDNA 测序发现其与莴苣不动杆菌(Acinetobacter dijkshoorniae )有99%的一致性。

分析该菌的油脂降解性能和影响因素,结果表明:在pH 为7.0~10.0、温度为30~35℃、200r/min 条件下培养3d,对体积分数为2%的花生调和油的降解率达95.7%,体积分数分别为4%、6%时对应的降解率达84.5%、59.7%。

对其他餐厨油脂也有较高降解率,如对体积分数为2%的芝麻油、亚麻
籽油降解率可达95%以上,对花生油、菜籽油、大豆油、葵花籽油甚至地沟油的降解率也在90%以上。

[关键词]微生物;餐饮含油废水;生物处理;降解菌[中图分类号]X703
[文献标识码]A
[文章编号]1005-829X(2019)12-0064-05
Bacterial screening for degradation of high concentration oily wastewater in catering industry and its degradation characteristics
Lu Yongchang 1,Zhang Jilong 2,Zhang Jiandong 3,Gao Lili 1
(1.College of Environmental Science and Engineering ,Taiyuan University of Technology ,Taiyuan 030024,China ;
2.College of Mining Engineering ,Taiyuan University of Technology ,Taiyuan 030024,China ;
3.College of Biomedical Engineering ,Taiyuan University of Technology ,Taiyuan 030024,China )Abstract:A high⁃efficiency oil⁃degrading strain LYC46-2is screened from oily sludge of sewer via enrichment cul⁃ture technique.16S rDNA analysis shows that the 99%identity of the strain is the same with Acinetobacter dijkshoo⁃rniae .The oil⁃degradation efficiency and influence factors of strain LYC46-2on oil are also investigated.Under the conditions of pH 7.0-10.0,30-35℃,200r/min and 72h of culture time ,the oil⁃degradation efficiencies of the pea⁃nut blend oil with the volume fractions of 2%,4%and 6%reach 95.7%,8
4.5%and 59.7%,respectively.Furthermore ,the strain LYC46-2shows high oil⁃degradation efficiency for different kinds of oil.The oil⁃degradation efficiency of the sesame oil and linseed oil (2%volume fraction )is higher than 95%,and the efficiencies of peanut oil ,rapeseed oil ,soybean oil ,sunflower oil ,even illegal cooking oil with concentration of 2%(volume fraction )are also higher than 90%.
Key words:microorganism ;restaurant oily wastewater ;biological treatment ;degrading bacteria [基金项目]山西省重点研发计划(社会发展方面)项目(201703D321009-4);山西省面上自然科学基金(201601D102013);山西省研究生联合培
养基地人才培养项目(2018JD17);山西省重点研发计划(社会发展方面)(201803D31050)
餐饮含油废水通常含有大量动植物油脂、蛋白质等大分子颗粒,有机物含量极高〔1-5〕。

将其直接排放会导致水体富营养化,危害水体生物及人体健康。

含油废水的处理一般分为物理法、化学法及生物法,其中物化法只能去除浮油、乳化油及分散油,溶解油和水中其他大部分有机物仍需要借助生化法处理才能达标排放〔6-8〕。

对于餐饮高浓度含油废水,其可生
化性较差,一般的生化处理工艺处理该废水出水指标不稳定,处理效果不理想。

因此,高浓度餐饮含油废水的高效降解菌的筛选及降解特性研究迫在眉睫〔9-11〕。

生物处理技术和生物修复技术因高效、经济、生态友好等特点,成为近年来废水处理领域研究的热点〔12〕。

目前,从自然界筛选微生物来处理不同环境污
DOI:10.11894/iwt.2018-1059
第39卷第12期2019年12月工业水处理
Industrial Water Treatment
Vol.39No.12Dec.,2019
染的研究已屡见不鲜。

M.K.Awasth等〔13〕用嗜热菌处理油性食物废料,可将体积分数为2%的植物油降解65%;E.H.Lee等〔14-15〕采用Rhodococcus sp.完全降解
体积分数为1%的环己烷;H.S.Joo等〔16〕从石油污染土壤中筛选出念球菌,对体积分数为2%的柴油的降解率为65%;M.M.A.A.El⁃Gendy等〔17〕用Nocar⁃diopsis sp.MORSY1948处理100mL实际废水,可100%吸附降解Ni2+和Cr6+。

生物技术已成为治理和修复环境污染的最佳手段之一。

但对高浓度餐饮含油废水的生物降解研究仍然较少;在已有研究中,筛选出的微生物对油脂的降解处理存在降解效率低、降解周期长等缺陷。

针对以上问题,笔者对降解高浓度油脂微生物的筛选、分离及降解特性进行了研究,最终分离出多株高效降解油脂的菌株,其中LYC46-2菌株表现出较好的生长和降解活性,同时进行了一系列相关实验,以期为今后的实践应用提供理论依据和技术支撑。

1材料与方法
1.1实验材料
筛选油脂降解菌所用实验样品来自太原理工大学明向校区餐厅排污下水道的油性污泥。

实验用植物油主要于市面采购,包括金龙鱼花生调和油、花生油、大豆油、菜籽油、芝麻香油、亚麻籽油和葵花籽油,地沟油由实验室自行收集。

将不同油脂于121℃灭菌,室温下保存备用。

Ezup柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司),用于细菌基因组提取。

MBSM培养基配方〔18〕:1.0g NH4NO3,0.5g KH2PO4, 5.24g K2HPO4·3H2O,0.2g MgSO4·7H2O,2.0mL1% (质量分数,下同)CaCl2,200μL5%NaCl,200μL1% FeCl3,5.0mL1%酵母提取物,5.0mL微量离子溶液,蒸馏水1000mL,121℃灭菌30min。

1.2实验方法
1.2.1油脂降解菌株的筛选与分离
初筛:称取0.3g油性污泥样品于30.0mL MBSM 培养基中,加入1.0mL金龙鱼花生调和油(此油在日常餐饮中应用较普遍,由花生油、芝麻油、玉米油、葵花籽油、菜籽油、大豆油、亚麻籽油、红花籽油等调和而成,可增加非特异油脂降解微生物筛选的比例)作为唯一碳源,在30℃、200r/min的摇床中培养72h。

移取2.0mL富集液于新鲜MBSM培养基中(之后每次培养基中的油脂添加量较之前多1.0mL),连续富集培养3次,通过稀释涂布平板法进行初筛。

复筛:将初筛得到的菌落种子液分别接种于含有2%(体积比)金龙鱼花生调和油的10.0mL MBSM 培养基中,在30℃、200r/min的摇床中培养12h,考察初筛菌落对花生调和油的降解率,选择降解率>
35%的优势菌落。

分离纯化:对复筛得到的优势菌落进行多次平板划线分离纯化,最终得到单一菌株,依次进行编号。

1.2.2菌种鉴定
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒分别对6株菌的基因组进行提取,通过细菌16SrDNA 通用引物(上游引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTG⁃GCTCAG-3’和下游引物1492R:5’-GGTTACCTT⁃GTTACGACTT-3’)进行PCR扩增,PCR条件:5.0μL 10×Taq缓冲液、1.0μL上下游引物、1.0μL模板DNA、1.0μL dNTP和1.0μL DNA聚合酶,最后加40.0μL无菌水补足至50μL,在以下条件下进行PCR:95℃预变性5min,95℃变性30s、55℃退火30s、72℃引物延伸1.5min循环30次,72℃延伸10min。

最后将PCR纯化产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序,将测序产物在NCBI基因文库中进行序列比对与登记。

1.2.3菌株的细胞密度与乳化能力测试
移取1.0mL菌株种子液(OD600=1.0)接种至含2%金龙鱼花生调和油的50.0mL MBSM培养基中, 30℃、200r/min下震荡培养72h,在波长600nm处用紫外分光光度计测其吸光度即为细胞密度。

将培养好的反应液于10000g离心15min,取1.0mL上清液与5.2mL的磷酸钾缓冲液(pH7.0)和0.2mL的油脂混合,震荡2min后静置10min,在540nm处测其吸光度即为菌株的乳化油脂能力〔16〕。

1.2.4油脂降解率的测定
将培养24h的菌株种子液于10000g下离心15min,用质量分数为0.85%的NaCl溶液冲洗沉淀细胞2次以洗去残余碳源,然后用MBSM培养基将细胞沉淀制成OD600=1.0的细胞悬液。

取1.0mL细胞悬液接种于含有一定浓度油脂的50mL MBSM培养基中,在30℃、200r/min的摇床中培养72h。

以正己烷为溶剂,萃取培养基里残余的油脂,用旋转蒸发仪于35℃下蒸发,真空干燥后收集剩余油脂,冷却至室温后称重。

以同步不接种菌株的MBSM培养基为空白对照,降解率按式(1)计算。

降解率=(m1-m2)/m1×100%(1)
2019-12,39(12),:
式中:m1———对照组的残余油脂质量,g;
m2——接种菌株的残余油脂质量,g。

1.3油脂降解菌株降解特性研究
1.3.1分离纯化的6株菌株的油脂降解能力测试分别取1.0mL(OD600=1.0)6株单一菌株的细胞悬液置于含2%(体积比)金龙鱼花生调和油的50.0mL MBSM培养基中,在30℃、200r/min条件下震荡培养72h,测量其残余油脂质量。

1.3.2LYC46-2降解油脂能力的影响因素
分析了不同因素(培养基初始pH、培养温度、培养时间、油脂浓度及油脂种类)对菌株降解率的影响:(1)用10.0mol/L的HCl溶液和NaOH溶液分别调节50.0mL MBSM培养基的pH至4.0、6.0、8.0、10.0(原MBSM培养基pH为7.1±0.5),接种OD600= 1.0的LYC46-2菌株细胞悬液于不同初始pH的50.0mL含花生调和油(体积比2%)的MBSM培养基中,30℃、200r/min下震荡培养72h,测量残余油脂质量。

(2)将接种LYC46-2菌株悬液(OD600=1.0)的50.0mL含2%(体积比)花生调和油MBSM培养基(pH为7.0)置于摇床中,分别设置摇床温度为20、25、30、35、40、45℃,在200r/min下震荡培养72h,测量残余油脂质量。

(3)将接种LYC46-2菌株的50.0mL 含2%(体积比)花生调和油的MBSM培养基(pH为7.0)在30℃、200r/min摇床中连续培养,培养时间分别为6、12、18、24、30、36、48、72h,取样测量残余油脂质量,计算降解率。

(4)在50.0mL MBSM培养基(pH 为7.0)中分别加入2%、4%、6%、8%、10%(体积比)的花生调和油,然后接种OD600=1.0的LYC46-2菌株细胞悬液,在30℃、200r/min摇床中震荡培养72h,测量残余油脂质量。

(5)分别添加体积比为2%的花生油、地沟油、大豆油、菜籽油、芝麻香油、亚麻籽油和葵花籽油于50.0mL MBSM培养基(pH为7.0)中,然后接种OD600=1.0的LYC46-2菌株细胞悬液,在30℃、200r/min摇床中震荡培养72h,测量残余油脂质量。

2结果与讨论
2.1菌株油脂降解能力分析
经富集培养后,从油性污泥样品中初步筛选出75个菌落,其对金龙鱼花生调和油的降解率如图1 (a)所示,其中有6个菌落的降解率>35%。

对这6个菌落进行平板划线,分离纯化出6株单一菌株,依次编号为LYC46-1、LYC46-2、LYC46-3、LYC49-2、LYC73-5及LYC129-3,其对体积分数为2%的金龙鱼花生调和油的降解率如图1(b)所示。

各菌株对调和油的降解率均>90%,其中LYC46-2菌株的降解率最高,可达95.7%。

(a)初筛得到的75个菌落对调和油的降解率(30℃、200r/min摇
床中培养12h);(b)分离纯化的6株单一菌株对调和油的降解率(30℃、200r/min摇床中震荡培养72h)。

图1菌落和单一菌株对2%金龙鱼花生调和油的降解率2.2菌株鉴定
对分离纯化出的6株菌株进行16S rDNA序列测序并与NCBI基因库进行比对,结果如表1所示。

表1分离菌株的鉴定结果
由表1可见,6株菌均与不动杆菌属(Acineto⁃bacte sp.)中的莴苣不动杆菌(Acinetobacter dijkshoo⁃rniae)有99%的相似性,可基本认定此6株菌均为莴苣不动杆菌(Acinetobacter dijkshoorniae)。

2.3油脂降解菌的细胞密度及乳化能力测试
用紫外分光光度计分别在波长600、540nm处测量6株单一菌株的细胞密度及乳化能力,如图2所示。

图26
株单一菌株的细胞密度和乳化能力
分离菌株菌株(一致性)NCBI序列号LYC46-1Acinetobacter dijkshoorniae(99%)MH880843 LYC46-2Acinetobacter dijkshoorniae(99%)MH880844 LYC46-3Acinetobacter dijkshoorniae(99%)MH880845 LYC49-2Acinetobacter dijkshoorniae(99%)MH880846 LYC73-5Acinetobacter dijkshoorniae(99%)MH880847 LYC129-3Acinetobacter dijkshoorniae(99%)MH880848
由图2可见,6株不动杆菌属可在MBSM 培养基中较好地生长,OD 600高达2.4~2.9,乳化能力可达0.72~0.88,这一结果与H.S.Joo 等的研究结果一致,且比文献报道的乳化能力更强〔13,16〕。

LYC46-2菌株的细胞密度及乳化能力较其他菌株都高,与其表现出的对油脂的降解能力一致(见图1)。

本研究筛选的莴苣不动杆菌(Acinetobacter dijkshoorniae )具有很高的油脂降解活力,与不动杆菌属具有降解油脂能力的相关研究相符。

且与D.Sugimori 等研究的Acineto ⁃bacte sp.降解油脂特性相比,Acinetobacter dijkshoor ⁃niae LYC46-2显示出更高的降解活性(见表2)〔19-22〕。

因此,后续实验中主要针对LYC46-2进行研究。

表2
不同菌株的油脂降解能力
2.4反应条件对LYC46-2油脂降解率的影响
培养环境将直接影响微生物的降解活性,考察了LYC46-2在不同培养条件下(培养基初始pH、培养温度、培养时间、油脂体积分数及种类)对油脂的降解率,如图3和表2所示。

分别得到以下结论:(1)pH 为4.0~6.0时,菌株对油脂的降解率<30%,当pH 为7.0~10.0时,油脂降解率>90%,降解活性几乎不受pH 影响。

这是由于酸性条件限制了细胞生长,导致菌株在酸性条件下活性较弱;但在碱性条件下菌株活性依然较强,说明其具有抗碱性特点,这一结论与M.K.Awasthi 等的研究一致〔13,23〕。

(2)培养温度为30~35℃时,菌株对油脂的降解率最高达95%;低于30℃时,油脂降解率<70%;高于40℃时,降解率降低至15%~45%。

(3)培养6h 时,培养基中的油脂几乎未被菌株降解;培养18h 时,65%的油脂被降解;反应30h 时,超过90%的油脂被菌株降解。

随着培养时间的增加,菌株对油脂的降解率不断提高;培养30h 后,油脂降解趋势变化缓慢。

由此推测培养30h 左右时油脂基本被菌株降解完全。

由表2看出,当油质量浓度为
图3不同pH (a )、温度(b )、培养时间(c )、油脂体积分数(d )下LYC46-2菌株对油脂的降解率
3000mg/L、培养24h 时,Acinetobacter sp.菌株对油脂的降解效果仍低于85%;采用Acinetobacter sp.降解质量浓度为8000~10000mg/L 的植物油时,培养时间超过72h 微生物依然不能将油脂完全降解。

对于2%的金龙鱼花生调和油,LYC46-2菌株降解24h 后的降解率高达85%;反应时间为30h 时,油脂几乎被完全降解。

本研究分离出的莴苣不动杆菌LYC46-2在降解速率上有极大优势〔19-22〕。

(4)培养基中的植物油为2%时,菌株LYC46-2可以降解95%的油脂;增加油脂至4%、培养72h 后,该菌株对油脂的降解率仍高达85%左右;但当培养基中的油脂增至8%~10%时,菌株对油脂的降解率低于50%。

随着油脂含量的增加,LYC46-2菌株的油脂降解率逐渐降低。

这可能是由于油脂增加导致培养基表面形成的油膜厚度增加,阻断了微生物生长所需氧气的摄入。

这一结果与M.K.Awasthi 等的研究一致〔13〕。

由表2可知:K.Tano⁃Debrah 等采用混合菌株对2%的油脂进行降解,反应时间为72~168h 时降解率最高才达到65%。

而本研究中当油脂为6%、反应72h 时,单一菌株Acinetobacter dijkshoorniae LYC46-2的降解率可以达到60%。

显然,筛选出的LYC46-2菌株在处理较高浓度含油脂废水方面具有更明显的优势〔13,23〕。

2.5菌株LYC46-2对不同类型油脂的降解
由于各种食用油在不饱和脂肪酸含量及化学组成方面存在差别,且油脂对微生物的敏感程度也不同,因此研究菌株LYC46-2对不同种类植物油的降
菌株
油脂与质量浓度温度与时间降解
率/%参考文献Acinetobacter sp.
Strain SOD-1色拉油,3000mg/L
35℃,24h 83〔20〕Acinetobacter sp.
食用油,8000mg/L 28℃,72h 60~65〔21〕Acinetobacter sp.SS-192
混合油,3000mg/L 37℃,24h
77.5
〔19〕Acinetobacter sp.UD-4
食用油,10000mg/L 25℃,168h 60~96〔22〕Bacterial consortium (BC)
植物油,2%(体积比)55℃,72h 65.47〔13〕JAT inoculum
花生油,2%(质量比)30℃,168h 57
〔23〕
Acinetobacter
dijkshoorniae LYC46-2调和油,2%(体积比)
30℃,30h
>90
本研究
2019-12,39(12),:
解率是必要的。

K.Tano⁃Debrah等研究了9种常见油脂对JAT混合菌株降解效果的影响,当油脂为2%、反应时间168h时,JAT混合菌株对花生油、菜籽油、混合油脂的降解率分别为57%、56%、70.5%。

在本研究中,当油脂为2%、培养时间为72h时,菌株
LYC46-2对芝麻油、亚麻籽油、调和油的降解率都高达95%(见图4);对另外5种油脂(花生油、菜籽油、大豆油、葵花籽油和地沟油)的降解率也均可达到90%以上。

这些降解差异可归因于参与脂类降解的酶的底物特性,如菌株分泌产生的脂肪酶与β-氧化酶、胞外分泌的脂肪酶对不同油脂的可获得性不同〔19〕,即菌株LYC46-2分泌的酶对芝麻油、亚麻籽油、调和油的可获得性较花生油、菜籽油、大豆油、葵花籽油和地沟油的高;其次,各种油脂对微生物降解的敏感性不同〔23〕,芝麻油、亚麻籽油、调和油对菌株LYC46-2的降解敏感性较其他5种油强。

但总体来看,LYC46-2菌株对2%不同类型油脂降解率均高于90%,且高于其他菌种的降解率,这可能是由于该菌的乳化能力高于其他菌种。

从图2可知,相同条件下测得的LYC46-2乳化能力为0.9(540nm处的吸光度即乳化能力),较D.Sugimori等筛选的菌株Ba-S2-Brevibacillus agri、Bc-S6-Bacillus cereus、Bl-S9-Bacillus licheniformis和Candidacatenulate CM1的乳化能力(540nm处的吸光度为0.4~0.5)高将近1倍〔19-20〕。

据报道,乳化能力与表面活性密切相关,可以降低液体的表面张力,使大油滴破碎分散成小油滴更易溶于水中,增加了油脂与微生物的接触,从而使油脂更容易被菌株吸收代谢〔24〕。

从菌株LYC46-2对不同类型油脂的降解结果可以看出,菌株LYC46-2对油脂的选择性较弱,对大部分油脂的降解活性都较高。

图4菌株LYC46-2对不同类型油脂的降解率3结论
(1)从油性污泥中筛选、分离、纯化出6株油脂降解菌株,经16S rDNA测序比对鉴定出这6株菌均为莴苣不动杆菌(Acinetobacter dijkshoorniae),最终选择1株降解率最高、生长状态最好的菌株LYC46-2研究微生物的降解油脂特性。

(2)LYC46-2降解油脂过程中受不同条件(培养基初始pH、培养温度、培养时间及油脂浓度)的影响。

在pH为7.0~10.0、温度为30~35℃、摇床转速为200r/min的条件下培养72h,该菌株对2%金龙鱼花生调和油的降解率可达95.7%。

(3)当金龙鱼花生调和油为4%时,菌株LYC46-2对油脂的降解率可达84.5%;进一步提升油脂到6%,降解率可达59.7%。

该菌株对2%芝麻油、亚麻籽油的降解率可达95%以上,对花生油、菜籽油、大豆油、葵花籽油和地沟油的降解率也在90%以上。

综上,筛选获得的Acinetobacter dijkshoorniae LYC46-2具有油脂降解效率高,能处理高浓度不同类型油脂餐饮废水的特性。

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[作者简介]卢永昌(1991—),硕士,E⁃mail:159********@。

通讯联系人:高丽丽,博士,副教授。

E⁃mail:420567199@。

张建栋,博士,副教授。

E⁃mail:zhangjiandong@。

[收稿日期]2019-11-10(修改稿)
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[作者简介]黄加昀(1992—),硕士研究生。

电话:181********, E⁃mail:jiayu_3988@。

通讯联系人:黄永炳,副
教授。

电话:189********,E⁃mail:hyb2019@。

[收稿日期]2019-11-01(修改稿)。