BIORAD荧光定量PCR原理和方法介绍

分子信标(Molecular Beacons)
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs Taq酶
Molecular Beacon
反应组分
R
Q
Taq
R Q
变
性
l
Q R
5’
3’
退 火
Q
R
Taq
5’ Molecular Beacon 3’
1. 链替换
Taq
R Q 5’ 5’ 3’
2. 聚合完成
Taq
ID





相对杂交探针方法，插入染料法相对较便宜 不需要特别设计探针 SYBR Green I, 最常用的插入染料 SYBR Green 染料插入双链DNA，检测灵敏度 提高1000倍。 和杂交探针方法相比，插入染料法特异性低 。 不能做多重PCR。
插入染料能够和引物二聚体和非特异性扩增产物结合
提
纲
• 荧光定量PCR的原理和应用 • 荧光定量PCR实验的设计和优化 • 引物和探针的设计 • 仪器软件的操作和仪器的维护 • 常见问题及解决方案
荧光定量 PCR的原理
PCR 反应过程
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs
Taq 酶
反应组分
变
性
3’
5’
5’
3’
退
火
3’
Taq
Taq
R
5’
3’
解
Taq
5’
5’ 3’
3. 聚
合
l Taq
5’
R
5’ 3’
4. 检测荧光

产生很强的荧光信号 容易设计和合成 可以做多重检测 能够进行SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 检测
比插入染料贵
Taqman 探针设计
Tm值比引物高10℃ 长度不超过30bp 5’端不能是G
Threshold Baseline Sample
CT
Ct值的设定
扩增产物的相对荧光强度达到设定的阈值时所经过的循 环数。 1) 设定基线 2) 设定阈值 3) CT 值就是扩增曲线和阈值的交点所指示的循环数。
阈值设定的越高， CT值越大 。
Ct值和起始模板量的对应关系
Low Ct, high amount 23.8 23.7 23.6
链替换,荧光熄灭
Taq
5’ 5’
3’
• • • •
特异性好 SNP 检测 难设计 费用昂贵
常用的荧光基团
FAM TET, VIC HEX JOE CY3 TAMRA CY3.5, Redmond Red Texas Red, ROX CY5 LC640 CY5.5, LC705
应 用
• 相对定量 • 绝对定量 • 突变检测 • 等位基因检测
• • • •
• •
• •
•
4. 上下游引物与探针的距离(上下游引物的位置)： 理论上讲，上游引物的3’端离探针的5’端为1-20bp，最佳是1bp，最近为上游引物的3’端离探针的 3’端为4bp;下游引物要与探针有一定的距离，但要保证下游引物的3’端离探针的3’端最为15150bp。整个目的片段的长度最好在50-150bp之间，最长不超过 200bp。 5. 随机引物： 适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主 要用于单一模板的RT-PCR反应。当特定mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全 长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中 所有RNA 分子全部充当了cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通 常用此引物合成的cDNA 中96%来源于rRNA。 6. Oligo dT： 适用于具有PolyA尾巴的RNA。(原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有 PolyA尾巴。)由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少 量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。是一种对mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA 可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总 RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方 面均要小。 7. 基因特异性引物： 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。用含目标RNA 的互补序列的寡核苷酸作为 引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。 用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。缺点是只能用于单一基因的PCR 实验。PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非 特异性扩增带。 上述内容罗列了RT-PCR设计的基本原则，都是些理论的知识，大家在用软件设计引物的时候可 根据这些理论知识和软件设计评估结果选择最佳的上下游引物序列
相对定量
参考基因：Actin, GAPDH, 18sRNA 靶基因A 对照组 实验组 25.2 22.1 GAPDH 19.5 20.8 ΔCt 5.7 1.3
1．计算ΔCt：ΔCt=Ct 靶基因－Ct GAPDH，分别计算实验组和对照组的ΔCt。 2．计算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组，本例中ΔΔCt= －4.4。 3．计算相对表达量的差值。2 －ΔΔCt
杂交探针方法
• TaqMan 探针 • 分子信标探针（Molecular Beacons） • FRET探针
TaqMan探针
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs Taq酶
R
反应体系
Q
Probe
Taq
l
R
Q
变
性
Q
5’
R
3’
退 火
R
Q
5’
Taq
3’
1. 链取代 2. 水
R Q
5’
Taq
35.6
Cycle
High Ct low amount
35.3 35.2
Template abundance in 6 samples.
Correlation Coefficient, Slope and PCR Efficiency (cont.)
标准 曲线的斜率和扩增效率相关
Efficiency () = [10(-1/slope) ] - 1 相关系数
3’
5’
延 重
伸 复
3’
3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’
5’
循环2 4个拷贝
3’
3’
3’ 3’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’
5’
循环3
3’
5’ 3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’
3’ 3’
8个拷贝
3’
PCR反应模式
Theoretical
Log Target DNA
Real Life
荧光PCR的原理
• 插入染料法 • 杂交探针法
插入染料方法的原理
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs Taq酶
插入染料
反应组分
Taq
l
ID
变
性
3’
5’
5’
3’
退
火
3’
ID Taq
ID ID
Taq ID ID
5’
延
3’
伸
5’
l
3’
l ID ID ID l l
l ID
Taq 5’
3’
检测激发的荧光
SNP 检测，较Taqman探针有更大的温 度选择性 多重PCR
难设计和合成 产生的荧光信号较低 价格昂贵
FRET 探针
3’ 5’ 5’ 3’
Primers
d.NTPs Taq酶
反应组分
Taq
R Q
变
性
FRET 探针
l
D
5’
R
5’ 3’
1-5 bases
退
火
D
5’
R
Taq
5’ 3’
2nd generation 85 bp amplicon
Forward Primer 110
•
• •
• • • • • • • • •
刚做实验的同学，很多时候希望别人帮自己设计好引物，其实这种方式是不可取的，首先是高估了引物设计的 难度，其次也自己的实验别人了解的并不多，还有就是引物设计其实是实验者必备的技能。这里讲述下RTPCR设计的基本原则。 1.上下游引物要保守： 为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行pcr扩增。所以引物的选取也要非常的保守， 最好不要有不同的碱基，若不得不有时，也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。 在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序列的5’端引物位置找的是3’端至少有5 个bp保守，在即在发表序列的3’端引物位置找的是5’端至少有5个bp保守。 5’NNNNNNN 3’ 发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’NNNNNNNNN 5’ 2. 上下游引物的长度和Tm值： 上下游引物的长度一般为18-25bp之间，且Tm值在58-60℃之间。确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物 中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的 5个碱基不应出现2个G或/和C。 上游引物应标记F(forword)，且在基因组的位置及长度;下游引物应标记R(reverse)，且在基因组的位置及长度。 用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃，长度相差最好不超过 4bp。 3.引物的评价： 用DNAstar 软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入引物 的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的引物序列。选中整个序列后，在 “report”菜 单下“primer self dimer”,分析引物的二聚体。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个dimer，并对此引物用dG值 进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primer hairpins”,分析引物的发 夹结构。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个hairpins，并对此引物的hairpins进行评价。再选择所需要的上下 游引物，在“report”菜单下 “primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有 多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好(dG值通常为负 值)，绝对值超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行)。 不必考虑引物与探针之间的配对与发夹结构，因为探针的Tm值非常之高。

反向引物的中间用Cy5 标记 和wild type 杂交的探针用FAM标记

不对称PCR，提高反向引物浓度
混合型
野生型
突变型
等位基因功能
MGB探针
实验设计和优化
影响PCR的因素
• 扩增效率——非特异性扩增、引物二聚 体、扩增产物的长度和二级结构 • 重复性 • 敏感性 • 动力学范围
绝对定量
构建标准曲线： A、按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸。 B、利用纯化的扩增产物制备 C、克隆有扩增产物的质粒
突变检测
熔点曲线分析功能 • SYBR Green • FRET 探针 • 分子信标探针 等位基因功能 • MGB 探针 • Taqman 探针？
熔点曲线分析
SNP 检测-FRET
避免二级结构
Forward Primer 110 1
Reverse primer A
Reverse Primer A
= 66.3 %
Avoid Secondary Structure (cont.)
Optimizing Primer location
Reverse Primer B
Reverse primer B = 95.8 %
Cycle #
Rel同一样品重复96次的实验结果
终点法和实时法的结果比较
Lockey etal. (1998) Biotechniques 24:744-6
实时PCR（real time PCR） 能 够在扩增的同时对扩增产物的量 测量或定量。
2 1.6 1.2 0.8 0.4 0 0 10 20 21 30 40
好坏数据比较
= 101% Good r = 0.997
= 131% Bad r = 0.982
引物二聚体对结果的影响
特异性产物
Tm = 89°C
10,000 copies
2,000 copies
引物二聚体 Tm = 78°C
400 copies
No template control
82 º C 采集荧光信号