药品生物技术《酵母RNA 的提取》

实验三酵母RNA的提取、测定
及组成成分的分析
Ⅰ酵母RNA的提取——浓盐法
【目的和要求】
了解用浓盐法提纯RNA的基本原理和方法
【基本原理】
核酸是一类不稳定的生物大分子，在制备过程中很容易发生降解。

因此，要使制得的核酸尽可能保持其在生物体内的天然状态，制备核酸必须采取温和的条件，例如避免过酸碱，避免剧烈的搅拌，防止核酸降解酶类的作用。

由于RNA种类较多，所以制备方法也各异。

工业上制备RNA一般选用成本较低、适宜于大规模操作的稀碱法和浓盐法。

稀碱法是用1%NaOH溶液，将细胞壁溶解，用酸中和，升高温度使蛋白质变性，将蛋白质与核酸分离，然后除去菌体，将2gL三角瓶内。

加10% Nacl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴中提取半小时。

2．分离
将上述提取液取出，用自来水冷却，分装在离心管内，以3500r/min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。

3．沉淀RNA
将离心得到的上清液倾于50mL烧杯内，并置于放有冰块250mL烧杯中冷却。

待溶液冷至10℃以下时，在搅拌下小心地用6mol/L HCL溶液调节in，使沉淀充分，颗粒变大。

1．冼涤
上述悬浮液3000r/min离心5min，得到RNA沉淀。

小心弃去上清液，加入3mL L碳酸氢钠溶液溶解沉淀（必要时用玻捧搅拌沉淀物以助溶解，如有不溶物则为杂质）。

在4000r/min离心1min。

取上清液于另一离心管中，加入2倍体积的95%乙醇，混匀。

重新沉淀RNA，3000r/min离心5min，即得湿RNA粗制品。

（如果要干燥的RNA制品，可在真空干燥箱内烘干。

如果要得到精制可进行多次沉淀。

）
RNA粗制品可供定量测定实验用。

【材料与试剂】
1．实验试剂、材料：
（1）鲜酵母
（2）10％ NaCI（化学纯）
（3）6mol/L HCI溶液
（4）95% 乙醇（化学纯）
（5）mol/L碳酸氢钠
（6）精密试纸：（7）冰块
【实验器材】
①量筒（25mL）②三角瓶（50mL）③烧杯（250mL、50mL）
④滴管及玻棒⑤温度计（100℃）⑥离心机
⑦恒温水浴箱（100℃）⑧台秤⑨试管木夹
⑩精密
波长处。

核酸的消光系数（或吸收系统），通常以∈（ρ）或Eρ来表示，即每升含有一克核酸磷溶液在260nm波长处的消光（即光密度，或称为光吸收）。

核酸的消光系数不是一个常数，而依赖于材料的前处理、溶液的（长下，每毫升含1微克DNA溶液的消光值（即）为。

故测定未知浓度的RNA（或DNA）溶液的值，即可计算出其中核酸的含量。

该法操作简便，迅速。

对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。

若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质，测定误差较大，应设法事先除去。

由于降解或水解作用，核酸的消光系数可以增高约40％，此现象称为增色效应。

在大分子的核酸中，氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为。

因此，核酸的消光低于构成它的核苷酸的消光。

该象称为减色效应。

【操作方法】
一、核酸样品纯度的测定
1．准确称取待测的核酸样品0.5克，加少量蒸馏水（或无离子水）调成糊状，再加适量的水，用5～6％氨水调到l。

2．取两支离心管，甲管内加入2ml 样品溶液和2ml 蒸馏水；乙管内加入2ml 样品溶液和2ml 沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照）。

混匀，在冰浴（或冰箱）中放置30min ，离心10min 。

从甲、乙两管中分别吸取上清液，用蒸馏水定容至50ml 。

选用光程为1㎝的石英比色杯，在260nm 波长下测其光密度。

3．计算：
甲－乙 微克／ml
DNA （或RNA ）％
＝ 或 ×100%
样品浓度（微克／ml ）
上式中样品浓度
＝
0.5克 ＝ ×106微克 =50微克／
ml 50×
4 ×
50 ml 104ml
2
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液（20210微克／ml ）在紫外分光光度计上直接测定。

二、核酸溶液含量的测定
1．取2支离心管，每管各加入2ml 待测的核酸溶液，再向甲管内加2ml 蒸馏水，向乙管内加2ml 沉淀剂。

混匀，在冰浴（或冰箱）中放置30min ，3 000转／分，离心10min 。

将甲、乙两管的上清液分别稀释至光密度值在～之间。

选用光程为1㎝的石英比色杯，在260nm 波长下测其光密度。

2．计算：
DNA （或RNA ）含量
＝
甲－乙 微克／ml
或
三、脱氧核糖核酸酶的作用
1．待测的核酸样品：
2．用含0.01M 硫酸镁的醋酸盐缓冲液（0.5M,）配制100ml 含有10mgDNA 的溶液。

3．取该溶液,加入脱氧核酸酶溶液，混匀后适当稀释。

在260nm 波长下，测定其消光的变化。

空白对照用蒸馏水代替酶液。

在测定紫外吸收时，以含有0.01M 硫酸镁的醋酸盐缓冲液0.5M,调节仪器的零点。

4．用RNA 为材料重复该实验，并解释实验结果。

【试剂和器材】
一、试剂
（1）核酸样品：DNA或RNA。

（2）待测核酸溶液
（3）5～6％氨水：用25～30％氨水稀释5倍。

（4）沉淀剂：任选一种，操作和效果都相同。

①Mac Fadyen试剂：％醋酸双氧铀（Uranium Acetate）溶于％二氯乙
酸中。

②钼酸铵—过氯酸试剂：％钼酸铵溶于％过氯酸中。

如配2021l，即在
193ml蒸馏水中加入7ml 70％过氯酸和0.5g钼酸铵。

（5）脱氧核糖核酸溶液。

（6）含有0.01M硫酸镁的醋酸盐缓冲液（0.5M,）。

二、器材
（1）分析天平（2）紫外分光光度计
（3）离心机（4）冰浴或冰箱
（5）烧杯（10ml）（6）离心管（10ml）
（7）容量瓶（50、100ml）（8）吸量管（、2和5ml）
（9）药勺和玻璃棒（10）试管和试管架
【思考题】
1．采用该法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？
2．若样品中含有蛋白质，如何排除干扰？你认为最简便的是什么方法？
3．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？
Ⅲ酵母RNA的水解及其组成成分的分析
【目的和要求】
了解定性鉴定核酸的原理和方法。

【原理】
用硫酸水解RNA时，可以生成磷酸、戊糖和碱基。

各种成分以下列反应鉴定：
（1）磷酸与钼酸铵试剂作用能产生黄色磷钼酸铵〔（NH
4）
3
.2克l。

在瓶口
上插一玻璃小漏斗，漏斗上盖一表面玻璃，然后在沸水浴中加热水解约半小时，过滤，取滤液进行下列实验。

二、嘌呤碱基的检查
取1支试管，加入１ml 硝酸银溶液，再逐滴加１mol氨水至沉淀消失。

然后加入1ml滤液，放置片刻，观察有无白色嘌呤碱基的银化物沉淀产生（见光变为红棕色）。

三、磷酸的检查
取2ml滤液放入１支试管中，加入5滴浓硝酸和１ml钼酸铵溶液后，在沸水浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀。

四、戊糖的检查
取２支试管，各加入1ml滤液，分别加入等体积的地衣酚试剂和二苯胺试剂，在沸水浴中加热1-2 min。

比较两支试管的颜色变化，并解释。

【试剂和器材】
一、试剂
（1）酵母核糖核酸（RNA）（2）10％梳酸
（3）1mol氨水（4）硝酸银溶液
（5）钼酸铵试剂：将2g钼酸铵溶解在100ml 10％硫酸中
（6）地衣酚试剂：100ml浓盐酸加入100mg三氯化铁，摇匀，贮存备用，使用前加入476mg地衣酚（又名甲基苯二酚）。

（7）二苯胺试剂：将4g二苯胺溶于400ml冰醋酸中，再加入11ml浓硫酸（比重）。

若冰醋酸不纯，试剂呈兰色或绿色，则不能使用。

（8）硝酸
二、器材
（1）试管及试管架（2）试管夹
（3）水浴锅（4）玻璃漏斗
（5）锥形瓶（50ml）（6）量筒（10ml）
（7）滤纸（8）煤气灯
【思考题】
1．若用上述方法鉴定DNA的水解液，应如何安排实验？估计会有什么结果？
2．现有三瓶未知溶液，已知它们分别为蛋白质、糖和RNA，采用什么试剂或方法鉴定（请自行设计简便的实验）？。