DGGE操作步骤

变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项
一、实验试剂及配置
一、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（：1）
试剂用量
丙烯酰胺
双丙烯酰胺
MilliQ（超纯水）水加到100mL 溶液采纳µm滤膜过滤，贮存在4℃
2、0％的变性贮存液
凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL20mL25mL30mL 50×TAE缓冲液2mL2mL2mL2mL MilliQ 水83mL78mL73mL68mL
总容积100mL100mL100mL100mL
3、100％的变性贮存液
凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL20mL25mL30mL 50×TAE缓冲液2mL2mL2mL2mL
去离子甲酰胺40mL40mL40mL40mL 尿素42g42g42g42g MilliQ 水加到100mL加到100mL加到100mL加到100mL
4、50×TAE缓冲液
试剂用量终浓度
Tris碱2M
冰乙酸 ml1M 0．5M EDTA，50mM
MilliQ 水加到
将溶液混合溶解，121℃下蒸汽灭菌20-30min,贮存在室温
五、银染液的配制:
原液：8×固定液（250 ml）：
乙醇200 ml
冰乙酸10ml
MilliQ 水40ml
（A）：1×固定液（400 ml）：
8×固定液 50ml
MilliQ 水350ml
（B）银染溶液(400ml)：
AgNO
3
MilliQ 水 300ml
（C）：显影剂（500ml）：
NaOH
MilliQ 水300 ml
甲醛
六、10％过硫酸铵（APS）：
过硫酸胺
超纯水
溶解后利用µm微孔滤膜过滤，4℃保留，保留时刻为1周。

7、10ml DGGE加样缓冲液：
2％溴酚蓝
2％二甲苯青
100％甘油7 ml
MilliQ水
二、不同引物的变性梯度
1,乳杆菌（380bp）
变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵35％（12ml）13ul56ul 65％（12ml）13ul56ul
2,双歧杆菌（596bp）
变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵40％（12ml）13ul56ul 70％（12ml）13ul56ul
3,肠球菌（300bp）
变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵40％（12ml）13ul56ul 55％（12ml）13ul56ul
4,V3 region（217bp）
变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵35％（12ml）13ul56ul 65％（12ml）13ul56ul 60％(12ml)13ul56ul
5,V6-V8 region (489bp）
变性梯度0%变性储存液100%变性储存液TEMED10%过硫酸铵42％（12ml）7ml5ml13ul56ul 58％（12ml）5ml7ml13ul56ul
浓缩胶：
0%变性贮存液 7ml， TEMED 8ul， 10%过硫酸铵 36ul
三、实验操作
1．封槽
（1）用95 %乙醇擦净清洗一大，一小两块玻璃板，干燥。

（2）用95 %乙醇清洗两个距离条，并将其置于大块玻璃板双侧边缘，外边缘与玻璃板边缘相齐。

（3）将小块玻璃板置于距离条上，对齐，并用夹子固定那个“sandwich”。

2．胶的制备
用不同体积的两种变性剂和丙烯酰胺贮存液配置变性剂要求浓度的胶。

体会上讲，胶的体积以恰好覆盖胶板为宜。

本实验V3区扩增产物DGGE 采纳65%和35%的变性剂浓度溶液；乳杆菌特异序列扩增产物DGGE采纳60%和35%的变性剂浓度溶液。

配置方式如下：
不同引物的变性梯度0％100％总体积
0% 7mL0mL7mL
35%12mL
40%12mL
50% mL mL12 mL
60% mL mL12 mL
65% mL mL12 mL
(1)清洗梯度合成器并使之干燥，并关掉两个槽之间的活栓。

(2)干燥梯度合成器的槽。

(3)别离向两个浓度的变性剂溶液中加µL /mL 10% APS(过硫酸铵)和1µL/ mL的TEMED（四甲基乙二胺），搅拌均匀。

(4)把高浓度变性剂溶液加到梯度合成器右边的槽中，低浓度变性剂溶液加到梯度合成器左侧槽中。

(5)将连接梯度合成器的出口针头置于胶板之间并固定。

(6)推动梯度形成器形成的梯度分离胶即注入两层玻璃板之间。

在混合和灌胶时应幸免产动气泡。

(7)分离胶灌完后，掏出针头，将其置于一个锥形瓶中，并停止搅拌。

(8)冲洗梯度合成器的两个槽，打开泵，排出其中水分。

(9)在浓缩胶中加入10% APS和TEMED并将浓缩胶灌入两层的玻璃板之间。

(10)待浓缩胶充满后，在其顶部插入梳子（幸免产动气泡），放置1 h。

3．电泳
(1)在电泳槽中添加新配置的电泳缓冲液，打开电泳仪预热到60 ℃。

(2)取掉梳子，用蒸馏水清洗没有凝聚的胶,并将sandwich固定在电泳槽内。

(3)调剂缓冲液的高度，使其方才超过胶上的加样孔。

(4)用缓冲液清洗加样孔（注射器及针头）。

(5)向胶顶部的加样孔中加入PCR的产物。

(6)盖上电泳仪的盖子，打开开关，电泳 220 v，10 min，随后85 v ,16 h。

4．染色
(1)电泳完成后将胶掏出置于一个干净的不锈钢或塑料容器中，水洗3次。

(2)加入400 mL 1×固定液，摇3 min。

(3)将固定液倒入在容器中（后面操作利用）。

(4)添加200 mL银染溶液在摇床上摇20 min。

(5)弃去银染溶液，用蒸馏水轻洗胶3次及容器。

(6)添加新鲜蒸馏水摇1-2 min。

(7)弃去蒸馏水，添加少量显影溶液，摇一会儿，直至显现清楚条带为止。

(8)弃去显影溶液，加入利用过的1×固定液，摇5 min。

(9)弃去固定液。

(10)加入蒸馏水摇2 min,后弃去蒸馏水。

(11)掏出胶并置于一个干净的玻璃板上，干燥，照相。

5．注意事项：
(1)DGGE电泳中利用有高毒性和致癌的一些试剂，故在实验进程中应注意增强自身的爱惜，如带手套等。

(2)灌胶的时候幸免产动气泡。

(3)银染溶液不能随意舍弃，以幸免造成环境污染，应回收进行统一处置。

(4)染液和显色液不能直接倒在胶上，避免染色显色不均匀。

过硫酸铵（APS）的作用主若是提供自由基，然后在促凝剂TEMED 的作用下使丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺聚合。

TEMED四甲基乙二胺: 用于配制PAGE胶等能够催化过硫酸铵产生自由基,从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合。