不同破壁方法对大肠杆菌DNA提取的影响[1]

.. [ 收稿日期] .. 2009.. 12..14; 2010..03..27 修回
.. [ 作者简介] .. 丁小云( 1983- ) , 女, 在读硕士, 研究方向: 植物营养学。

E..mail: dingxiaoyun654321@ 126. com
.. * 通讯作者: 魏成熙( 1950- ) , 男, 教授, 硕士生导师, 从事土壤肥力与作物生产方面的教学及研究工作。

[ 文章编号] 1001..3601( 2010) 04..0242..0149..02
不同破壁方法对大肠杆菌DNA 提取的影响
丁小云1 , 耿俊丽2 , 魏成熙1*
( 1. 贵州大学农学院, 贵州贵阳550025; 2. 福建师范大学生命科学学院, 福建福州350000)
.. .. [ 摘.. 要] 为了解不同细胞破壁方法对大肠杆菌总DNA 提取效果的影响, 分别采用CTAB/ 溶菌酶/ 蛋
白酶K 法、溶菌酶/ SDS 法、CTAB/ SDS 法对大肠杆菌进行破壁提取DNA, 比较了3 种方法从大肠杆菌中提
取DNA 的效果。

结果表明: 3 种方法都可以从大肠杆菌中提取到分子量大于21. 2 kb 的DNA 片段, 1mL
菌液DN A 的提取量为14. 3~ 43. 6 ..g, 不同方法间在DNA 产量及纯度等方面存在较大差异。

[ 关键词] 大肠杆菌; DNA; 提取方法
[ 中图分类号] S852. 61+ 2 [ 文献标识码] A
Effect of Different Extract methods on DNA Extract
Amount from Es cherichia coli
DING Xiao..yun1 , GENG Jun..li2 , WEI Cheng..x i1*
( 1. College of Agriculture, Guizhou University , Guiyang, Guizhou 550025; 2. College of Lif e Sciences,
Fuj ian Normal University , Fuzhou, Fuj ian 350000, China)
.. .. Abstract: T hree differ ent DNA ex t ract ing methods of CT AB/ lyso zyme/ proteinase K lysis, SDS/
lysozyme lysis and CTAB/ SDS ly sis w ere used in ex t ract ing DNA f rom Escher ichia coli to study the effect
on DNA ex tr act amount f rom E scheri chia col i . T he result s show ed that each of three tested methods co uld
ex t ract DNA f ragment of abov e 21. 2 kb molecular w eig ht f rom Escher ichia col i , 14. 3 ~ 43. 6..g DNA
could be ex t racted f rom 1mL E scheri chia col i solut ion, and there w as obv io usly difference in DNA ex t ract
amount and purity among three ext ract metho ds.
Key words: Escher i chia col i ; DNA; ext raction method
.. .. 大肠埃希氏杆菌是肠道的正常菌群, 广泛存在
于土壤、空气、河流和海洋等自然界, 利用其基因组
DNA 通过相应的PCR 和电泳等技术建立基因.. 指
纹库 , 实现粪便污染源示踪, 已成为生物示踪中的
一种有效的方法[ 1] 。

作为分子生物学研究的第一
步, 样品DNA 的提取尤为重要。

提取DNA 的总
量、成分、纯度、片段大小以及提取方法的偏倚性[ 2] 将对后续工作产生影响。

常用的破壁方式主要有物
理法、化学法、酶解法和联合裂解法, 经过人们长期
的研究和总结, 联合裂解法较单独使用某一种方法
破壁提取DNA 的效果好。

为寻找一种简便有效的
大肠杆菌DNA 的提取方法, 研究了3 种DNA 的提
取方法对大肠杆菌总DNA 的提取效果, 筛选适合
于大肠杆菌DNA 的提取方法, 为进一步开展分子
生物学方向的研究提供科学依据。

1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试剂Tris ( 三羟甲基氨基甲烷) 、EDTA
( 乙二胺四乙酸) 、CT AB( 十六烷基三甲基溴化胺, 分析纯) , 购自中国医学( 集团) 上海化学试剂公司; M..琼脂糖Promega 分装; 溶菌酶Fluka 进口分装;
蛋白酶K( aMRESCO) ; ....DNA Marker ( EcoR ! / Hind .) , DL2000..DNA Marker, 均购于华美生物
工程有限公司。

1. 1. 2 PCR 引物PCR 引物, 购自宝生物工程
( 大连) 有限公司。

1. 1. 3 大肠杆菌大肠杆菌, 南阳师范学院细胞
实验室提供。

1. 2 方法
1. 2. 1 样品的制备配置200mL LB 培养基[ 3] ,
加入100 ..L 大肠杆菌, 于37 # 160 r/ min 振荡培养17 h。

等量分装于离心管中, 甘油保存, 4 # 冰箱中
备用。

1. 2. 2 大肠杆菌DNA 的提取采用3 种方法提
取基因组DNA。

方法1 参照李均敏[ 4] 报道的方法, 方法2 参照宋培勇[ 5..6] 报道的方法., 方法3 参照宋培勇[ 5..6] 报道的方法., 以上方法根据需要稍有改动。

基因组DNA 提取后, 用紫外分光光度计测定
纯度, 用琼脂糖凝胶电泳、EcoR ! 酶切及RAPD 检
测DN A 的质量。

2 结果与分析
2. 1 不同方法对DNA 提取的影响
从表可知, 不同方法DNA 提取量差别较大, 方
法1 提取的DNA 含量最高, 为43. 6..g / mL, 明显高于方法2 和方法3。

其中, 方法2 提取量最少, 为
12. 6..g / mL。

这可能与方法1 中使用了2 次酚/ 氯仿/ 异戊醇抽提, 酚的多次使用会降低DNA 的提取
效率和纯度。

核酸的嘌呤、嘧啶中都有共轭双键, 对.. 贵州农业科学.. 2010, 38( 4) : 149~ 150
.. Guizho u Ag ricultur al Sciences
紫外光有强烈的吸收, 天然双链DNA 在260 nm 与
280 nm 处吸收值( OD260 / OD280 ) 应在1. 8 左右, 低则
说明有蛋白质、酚等小分子杂质未除尽, 高则说明还
有RNA[ 6] 。

3 种提取方法获得的DNA 的OD260 /
OD280平均值分别为1. 93、1. 60、1. 71, 说明方法1
提取的DNA 含有酚类及色素, 方法2 和方法3 提
取的DN A 含蛋白质。

表从大肠杆菌中提取总DNA 的方法比较
.. Table .. Compariso n o f three ext ract DNA met ho ds from Escher ichia coli
方法OD260 OD280 OD260 / OD280
DNA 提取
量/ (..g / mL)
1 0. 08
2 0. 04
3 1. 93 43. 6
2 0. 024 0. 015 1. 60 12. 6
3 0. 027 0. 016 1. 71 14. 3
2. 2 基因组DNA 的电泳检测
DNA 分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速
率与DN A 分子量对数成反比, 分子越大则所受阻
力越大, 也越难于在凝胶孔隙中蠕行, 因而迁移得越
慢。

DNA 用溴化乙锭( EB) 染色后可在紫外光的照
射下发出荧光, 通过荧光的位置和强度可判断DNA
的大小和DNA 的浓度。

本次试验采用3 种方法提
取的基因组DNA 用1% 的琼脂糖凝胶进行电泳检
测。

从试验结果( 图1) 看出, 从右开始, 泳道2~ 4
为采用3 种方法所提取的大肠杆菌基因组DNA 的
电泳图谱, 3 种方法提取的DNA 在凝胶上呈现出较
整齐的一条线。

其中, 第2 种方法拖尾现象较严重,
3 种方法相比较, 第1 种方法提取效果较好, 主带清
晰, 无拖尾现象。

2. 3 单酶切检测
从3 种方法提取的EcoR ! 基因组DNA 的
EcoR !酶切图谱( 图2) 可知, 方法1 和方法3 提取
的基因组DNA 均可被限制性内切酶完全消化, 说
明所提取的DNA 纯度高、质量好, 不含抑制限制性
内切酶的各种杂质。

方法2 提取的DNA 几乎不被
消化, 说明含抑制限制性内切酶的杂质。

2. 4 RAPD 反应
从3 种方法提取的EcoR!基因组DNA 的RAPD
图谱( 图3) 看出, 3 种方法均可扩增出清晰的、具有多
态性的条带。

由于所采用的破壁方法不同, 所含杂质
及所用引物不同, 反映出有差异的长度多态性。

以上
结果显示, 3 种方法所提取DNA 的纯度、成分、片段
大小都达到了RAPD 扩增所需要的条件。

.. .. M, DNA marker DL.. 2000; 1 为方法1, 2 为方法2, 3 为方法3
图3 大肠杆菌DNA 随机扩增电泳
Fig. 3 .. DNA random amplificat ion electr opho resis
3 小结与讨论
3 种破壁方法各有优劣, 但相对来说, 方法1 的
优势较明显, 结果稳定, 提取的总量多, 杂质含量少,
可以扩增PCR。

方法3 提取的总量略高于方法2,
但纯度略低于方法1。

在理论上, 方法1 的破壁效
果最好, 偏倚性也最小, 与本研究结果相符。

方法2
在DNA 提取过程中使用了酚/ 氯仿/ 异戊醇( 25 %
24 %1) 和氯仿/ 异戊醇( 24 % 1) 作为提取介质, 通常
认为该法提取效果较好, 本次试验结果与此不符, 可
见, 其操作条件和相关的参数还需要进一步摸索。

RA PD 分析对DNA 纯度的要求比较低, 模板OD
值( OD260 / OD280 ) 略高于1. 6 就可以进行RAPD 分
析。

经纯度测定, OD260 / OD280 达到1. 71~ 1. 93, 完
全可以应用于RAPD 反应, 所得的RA PD 谱带均达
到理想要求, 这为利用RAPD 技术对大肠杆菌做进
一步分子生物学研究提供了基础资料。

[ 参考文献]
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( 责任编辑: 杨.. 林)
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