真空包装肘花胀袋微生物的鉴定及验证

真空包装肘花胀袋微生物的鉴定及验证
高鹏;伏毅;陈谦;王艳;伍玲;谢艳;刘绵学;黄敏
【摘要】以正常和腐败的产品为材料研究引起真空包装肘花胀袋的微生物,将传统培养与分子生物学方法(16S rDNA序列分析和PCR-DGGE技术)相结合对分离纯化的微生物进行鉴定,并将分离到的细菌进行回接验证试验.结果表明,比较从正常和胀袋产品中分离纯化到的14株和18株菌发现,胀袋组中含有对照组没有的细菌.16S rDNA的分析结果显示这些菌株主要是芽孢杆菌[枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)]以及寡养单胞菌(Ste notrophomonas maltophilia和Stenotrophomonas pavanii);而PCR-DGGE 分析结果表明这些菌株主要是包括产气荚膜梭茵(Clostridium pe rfringe ns)在内的梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)和假单胞菌(Pseudomonas sp.),将分离到的细菌回接到样品中,产品即发生胀袋,可见,引起肘花胀袋的微生物是芽孢杆菌和寡养单胞菌.
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2016(000)013
【总页数】5页(P3434-3438)
【关键词】肘花;胀袋;微生物;枯草芽孢杆菌;寡养单胞菌;PCR-DGGE
【作者】高鹏;伏毅;陈谦;王艳;伍玲;谢艳;刘绵学;黄敏
【作者单位】四川省原子能研究院,成都610101;辐照保藏四川省重点实验室,成都610101;四川省原子能研究院,成都610101;辐照保藏四川省重点实验室,成都610101;四川省原子能研究院,成都610101;辐照保藏四川省重点实验室,成都
610101;四川省原子能研究院,成都610101;辐照保藏四川省重点实验室,成都610101;四川省原子能研究院,成都610101;辐照保藏四川省重点实验室,成都610101;四川省原子能研究院,成都610101;辐照保藏四川省重点实验室,成都610101;四川省原子能研究院,成都610101;辐照保藏四川省重点实验室,成都610101;四川省原子能研究院,成都610101;辐照保藏四川省重点实验室,成都610101
【正文语种】中文
【中图分类】TS251.5
肘花是以猪皮和猪瘦肉为原料的深加工产品，含有丰富的蛋白质，味道鲜香，颇受消费者青睐［1］。

但因其营养丰富，水分含量较高，腐败微生物极易生长和繁殖，加上加工所用的原辅料种类繁多、来源复杂，源头污染和二次污染都难以彻底控制，采用传统的高温法处理，一部分耐热微生物仍能残存，极易导致微生物繁殖，引起腐败［2］，出现胀袋现象，直接影响到企业的经济效益［3］。

找到导致胀袋的
微生物，采取预防措施对生产企业来说就显得尤为重要。

常规的腐败微生物检测大多数是依靠传统的培养法进行分离，然后根据菌落形态及生理生化特征确定其类型［4］。

该方法耗时长（一般需要2～5 d），操作复杂，对培养基类型和培养条件依赖性强，且自然界中只有0.1%～1.0%的微生物能够通过常规方法被培养，导致结果不够准确［5］，而PCR技术具有特异性高、敏感
快速、简便、重复性好等优点，可以弥补传统检测方法的不足。

近年来，通过变性剂梯度分离不同DNA片段的聚合酶链式反应——变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术也被越来越广泛地应用于食品中微生物的检测［6］。

张琦等［7］在郫县豆瓣自然发酵过程中细菌群落结构变化的研究中发现了Staphylococcus xylosus、Lactobacillus plantarum、Weissella confusa等细菌。

Jiang等［8］
使用PCRDGGE指纹技术和实时定量PCR技术，研究切片包装的猪肉在冷藏条件贮存期间微生物群落组成的变化，以及贮存后期主导腐败菌在整体细菌总量中的相对含量。

本研究以正常和胀袋的肘花为材料，将传统培养和分子生物学方法相结合，研究引起真空包装肘花胀袋的微生物。

采用传统培养方法，对正常和胀袋肘花产品中的微生物进行分离纯化，经16S rDNA鉴定以及对样品中细菌宏基因组总DNA可变区V6～V8区的PCR-DGGE分析，比较胀袋前后产品中微生物群落的变化，从而推
测引起产品胀袋的微生物种类，并将分离到的细菌回接产品进行验证试验，旨在找到引起产品胀袋的细菌，从而为企业在实际生产中解决问题提供参考和指导。

1.1 材料
成都市某食品厂提供的正常和胀袋水晶肘花产品。

1.2 方法可培养微生物的分离、纯化与鉴定
参考GB 4789.2-2012［9］的方法处理样品，梯度稀释后按下述方法进行接种培
养［5，10］。

1）好氧菌培养。

接种了各稀释度样品的营养琼脂平板，36℃培养48 h后，根据
不同形态（颜色、大小等）挑取典型菌落进行分离纯化。

2）厌氧菌培养。

接种了各稀释度样品的厌氧琼脂平板，36℃厌氧培养48 h。

挑
取典型菌落进行分离纯化。

3）细菌基因组DNA提取和16S rDNA序列扩增。

挑取纯化后的单菌落进行富集培养，取1.5mL培养液，用TIANamp Bacteria DNA kit（细菌基因组DNA提
取试剂盒）提取基因组DNA作为后续PCR反应模板。

PCR扩增通用引物［11］：Eu27F（5′-GAGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-CTACGG CTACCTTGTTACGA-3′）。

50μL反应体系：10×PCR buffer 5μL，2.5 mmol／
L dNTP 4μL，25 mmol／L MgCl24μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，引物各1μL，
ddH2O 32.75μL，模板DNA 2μL。

反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性60 s，55℃退火60 s，72℃延伸90 s，32个循环，72℃延伸8min［9］。

扩增产
物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度为1 500 bp左右，Universal DNA Purification kit（DNA纯化回收试剂盒）胶回收后，置于-20℃储藏备用。

4）PCR-DGGE技术分析微生物种类。

分别取25 g对照和胀袋样品，加入0.85%生理盐水，匀浆制成10倍稀释液，取1.5mL匀浆液800 r／min离心2min，取上清液12 000 r／min离心5min，5管富集，用TIANamp Bacteria DNA kit提取宏基因组DNA作为后续PCR反应模板。

采用Nested PCR法。

先用通用引物Eu27F和1492R扩增细菌16S rDNA，反应程序同上。

然后用带GC clamp （5′CGCCCGCC GCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG3′）的通用引物GC-968f（5′-GC clamp-AACGCGAAGAACCTTAC-3′）和1401r（5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3′）［12］，经Touch down-PCR扩增16S rDNA
V6-V8区，反应程序：94℃5min；94℃30 s，61～56℃30 s（每个循环降低
0.5℃），72℃60 s，11个循环；94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，25个循环；72℃10min［11］。

PCR反应体系均为（50μL）：2×Taq PCR Master Mix
25μL，引物各1μL，ddH2O 21μL，模板DNA 2μL。

16S rDNA扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测；随后通过对PCR产物进行Recondition PCR去除嵌合体以及异源双链的影响，程序参考文献［13］。

16S rDNA V6～V8区扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度为490 bp左右［14］。

对细菌16SrDNA V6～
V8区PCR产物进行DGGE电泳、染色及图像分析［15-17］。

切胶回收代表性
条带，加入40μLTEBuffer 4℃浸泡过夜，取上清液为模板，用不含GC clamp的引物968f和1401r再次扩增16S rDNA V6～V8区，反应程序同上，反应体系（50μL）：10×PCR Buffer 5μL，2.5 mmol／L dNTP4μL，25 mmol／
LMgCl24μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，引物各1μL，ddH2O 30.5μL，模板
DNA 4μL。

1.3 序列分析
由上海英骏（Invitrogen）生物科技有限公司完成产物测序。

测序结果提交NCBI （http：///）进行Blast相似序列检索，并于Gen-Bank
获得序列登录号。

使用Clustal X 1.83软件进行比对，MEGA 5软件构建进化树。

1.4 验证试验
从分离纯化的细菌中选取有代表性的菌株，接种于肉汤培养基进行活化，于摇床中36℃振荡培养16 h。

稀释菌液，调节菌液浓度OD600nm在0.1左右，备用。

将肘花样品切成5 cm×5 cm的圆形切块，分装于真空包装袋中，用移液枪吸取
50μL菌液涂于样品表面，抽真空热封，该部分试验在无菌操作间进行，接种后的产品在36℃培养箱中放置观察。

2.1 菌株的分离纯化结果
接种后的平板在36℃培养48 h，综合营养琼脂和厌氧两种培养基平板上的菌落形态（大小、颜色），挑取有代表性的菌落进行分离纯化，对照组与胀袋组分别得到14株和18株纯化菌株。

2.2 16S rDNA序列分析
分别以两组样品中分离纯化的32株菌的总DNA为模板，用16S通用引物进行PCR扩增，得到片段为1 500 bp左右的PCR产物，经测序得到各菌株的16S rDNA序列。

各序列在NCBI（http：///）数据库Blast
比对后，从GeneBank下载亲缘关系相近种的模式菌株（或已发表菌株）序列，
基于16S rDNA序列，对32株菌及下载菌株的16S rDNA序列进行系统发育分析，以Neighbor-Joining分析法，经过500次计算，得到系统发育树。

将对照组中分离到的14株菌的16S rDNA序列进行Blast比对，构建系统发育树，根据遗传距离确定其最相似菌株，结果见表1。

从表1和图1中可以看出，对照
组中分离的14株可培养细菌主要是肠杆科细菌，包括泛团菌属（Pantoea sp.）、Enterobacter cloacae和Enterobacter ludwigii在内的肠杆菌属（Enterobacter sp.）。

这14株菌均嗜中温，普遍存在于植物表面、水和土壤中。

胀袋组中分离到的18株菌的16S rDNA序列分析结果见表2。

从表2和图2可以看出，胀袋组分离得到的18株菌主要包括四类，其中9株为泛团菌属（Pantoea sp.）和Enterobacter ludwigii、Enterobacter cloacae在内的肠杆菌属细菌（Enterobacter sp.），剩余9株B1、B2、B3、B4、B5、B7、B8、B9和B10
为包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）在内的芽孢杆菌以及寡养单胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia、Stenotrophomonas pavanii）。

根据表2
的结果比较分析，胀袋组中除了含有对照组分离到的泛团菌属和肠杆菌属细菌外，还分离得到枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌以及寡养单胞菌属细菌，推测产品胀袋可能是由芽孢杆菌和寡养单胞菌引起的。

2.3 PCR-DGGE结果分析
对照组和胀袋组中样品的PCR-DGGE指纹图谱见图3，DGGE条带经测序比对，序列鉴定结果见表3。

由图3和表3可知，对照组中的细菌主要为Enterobacter sp.和Staphylococcus aureus，而胀袋组中的细菌除此之外，还有包括产气荚膜
梭菌（Clostridium perfringens）在内的梭状芽孢杆菌（Clostridium sp.），而
且条带非常亮，说明胀袋后，产品中细菌的种类和数量发生了变化，肠杆菌Enterobacter sp.的生长可能受到抑制而数量较少，而梭状芽孢杆菌则大量增殖并成为优势菌株（与对照相比，出现新的条带，条带多而且亮），因此，产品胀袋可能是由梭状芽孢杆菌引起的。

2.4 验证试验
从对照组和胀袋组中分离纯化到的菌株中分别选取A13（Enterobacter sp.strain
YT4）、B1（Bacillus subtilis strain HB-6）、B2（Stenotrophomonas maltophilia strain MTH20）、B3（Bacillus licheniformis strain ML1）、B4（Bacillus subtilis strain SBRh5）、B9（Bacillus licheniformis ATCC 14580）和B10（Stenotrophomonas pavanii strain LMG 25348）为试验菌株，将稀释后的菌液回接于产品中，同时以未接种的样品为空白对照。

产品于36℃放置，观
察结果。

由表4可以看出，产品在接种B组菌液2 d后即出现胀袋现象，36℃放
置5 d后，这种现象更加明显，结果与“2.2”的结果一致，将胀袋中产品分离到
的细菌重新回接时，能够引起产品胀袋，而对照组和空白对照则没有发生胀袋。

因此，该结果进一步证实，将分离到的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和寡养单胞菌回接产品后，产品即出现胀袋现象，说明引起产品胀袋的微生物主要是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和寡养单胞菌。

本研究将传统培养和分子生物学方法（16s rDNA和PCR-DGGE技术）相结合，
通过比较对照组和胀袋组样品中细菌种类的不同，对引起真空包装肘花产品胀袋的微生物进行鉴定。

结果表明，这些细菌主要是芽孢杆菌、寡养单胞菌和梭状芽孢杆菌，后续的回接试验证实了芽孢杆菌和寡养单胞菌与样品的胀袋有直接关系。

有关寡养单胞菌能够引起食品腐败的研究较少，而对芽孢杆菌的研究相对较多，芽孢杆菌（Bacillus sp.）在自然界中广泛存在，因此在食品的加工过程中很容易污
染食品［18］，大量研究也表明芽孢杆菌是肉制品中的常见腐败菌，它能利用糖类、蛋白质等营养成分生长，形成内生孢子，具有较强耐受力，特别是耐热力，从而逃避热处理的损伤。

食品加工中灭菌或熟制工艺难以将芽孢杆菌完全杀灭，使得该属细菌成为食品工业中较为重要的微生物研究对象［3］。

徐世明等［5］通过
对胀袋烤鸡中的腐败菌进行研究，分离出5株腐败菌，包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilu）各两株。

汪立平等［19］从鼓胀的豆浆盒里变质豆浆中分离到3株腐败菌，分别为地衣芽孢杆菌（Bacillus
licheniformis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）和短芽孢杆菌（Brevibacillus borstelensis）。

本试验通过回接试验，验证了枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和寡养单胞菌是产品发生胀袋的原因。

梭状芽孢杆菌多为厌氧菌，且耐热性较强，即使利用真空包装和高温高压等方式也无法完全清除，因此，肉制品中若携带有梭状芽胞杆菌，一般经过熟制加工后仍会有残留，且在贮存过程中逐渐繁殖，进而影响产品品质和感官，控制此类细菌的污染与生长是延长真空包装食品的关键环节。

由于PCR-DGGE方法是直接提取样品中细菌的宏基因组总DNA，所以无法验证梭状芽孢杆菌能够引起产品胀袋，但是有关梭菌属细菌引起产品胀袋的现象也有相关研究，孙涪陵等［20］从胀袋火腿肠中分离纯化得到一株厌氧菌，经形态观察、生化试验鉴定为产气荚膜梭茵（Clostridium perfringens）。

通过分析真空包装胀袋肘花中的腐败菌，为下一步进行腐败菌溯源提供了依据，有助于企业寻找产品污染源头，对生产和加工过程中的关键环节加以重点控制，采用更科学的灭菌方法，加强产品品质。

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