miR-30c对肝癌细胞增殖和周期及凋亡的影响

·基础研究·Experimental Research
·
[作者简介]陈海明(1978-02~),男,广东汕头人,主治医师,研究方向:全科医学。

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miR-30c 对肝癌细胞增殖和周期及凋亡的影响
陈海明
张贤春
陈鼎
陈军斌
海口市人民医院
全科医学科（海南
海口
570208）
344
肝癌是我国高发的恶性肿瘤,我国肝癌患者占世界范围内肝癌患者总数的一半以上,研究肝癌的发病机制,寻找早期肝癌诊断的生物学标志一直是学者们努力研究的热点和难点
[1]。

微小RNA (mi ⁃
croRNA ,miRNA )是一段无编码功能的18~24个核苷酸的小片段RNA ,但是这个小片段RNA 可以与靶标基因3’-UTR 特异性结合,调控靶标基因的翻译过程,越来越多的证据显示,miRNAs 与肝癌的发生、进展和转移密切相关[2]。

miRNA-30c (miR-30c )是miR-30家族中的一员,研究发现miR-30c 在多种肿瘤组织中低表达,并且与肿瘤的淋巴结转移密切相关[3],在肝癌患者的血清中也发现了miR-30c 低
表达[4]。

本研究使用miR-30c 转染肝癌HepG2细胞,
观察HepG2细胞增殖、细胞周期及凋亡的变化,探讨miRNA-30c 在肝癌中的作用。

1
材料和方法
1.1主要试剂与仪器
肝癌HepG2细胞购自中国
科学院上海细胞生物学研究所,DMEM 培养基、Tri ⁃
zol 和Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen 公司,胎牛血清购自美国GIBCO 公司,青霉素和链霉素、2,5-二苯基四唑溴化铵(MTT )、碘化丙啶(PI )购自
美国Sigma 公司,膜联蛋白V-FITC 凋亡检测试剂盒、逆转录试剂盒购自北京碧云天生物科技有限公司,荧光定量PCR 试剂盒购自大连Takara 公司。

过表达miR-30c 的慢病毒载体(p RI-CMVGFP-mi
RNA 34a vector ,序列:UGUAAACAUCCUACACU ⁃
CUCACUGAGAGUGUAGGAUGUUUACAUU )、阴性
对照载体(pRI-CMVGFP-negative vector )、miR-30c 和内参PCR 引物购自上海吉凯基因化学技术有限公司,序列见下表1。

TF900细胞培养箱为美国Thermo Fisher 公司产品,EPICS XL-4流式细胞仪为美国Beckman 公司产品,ABI 7500荧光定量PCR
仪为美国Applied Biosystems 公司产品。

Med550酶标仪为美国Bio Rad 公司产品。

10%胎牛血清、100U/mL 青霉素、100mg/mL 链霉素
的DMEM 培养基,置于5%CO 2、37℃细胞培养箱。

处于对数生长期时,接种6孔板,换无血清培养基,按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书操作进行病毒转染,设立对照组、阴性对照组和过表达miR-30c 组,对照组不加入病毒载体,阴性对照组加入阴性对照载体,过表达miR-30c 组加入含有miRNA34a 的病毒载体,转染2h 后换含血清培养基继续培养48h ,荧光定量PCR 检测各组miR-30c 表达情况。

1.3miR-30c的荧光定量PCR检测取上述对照组、阴性对照组和过表达miR-30c组HepG2细胞1×106个,加入1mL Trizol按照试剂盒说明书操作提取细胞总RNA,按照逆转录试剂盒说明书操作反转录出cDNA第一链,取1μg DNA模板,加入相关引物、Taq酶和荧光染料进行定量PCR扩增,反应条件:94℃预变性2min;94℃45s,62℃40s,35个循环,72℃6min,对照内参用2-△△Ct表示miR-30c的相对表达水平。

1.4细胞增殖检测MTT法检测细胞增殖:取对照组、阴性对照组和过表达miR-30c组HepG2细胞, 3000个接种到96孔板,在10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100mg/mL链霉素DMEM培养液中培养于5%CO2、37℃细胞培养箱,培养24、48、72h后加入MTT(0.5mg/mL),4h后加入DMSO,置于酶标仪
中460nm处测定吸光度(absorbance,A)值。

1.5细胞周期检测取对照组、阴性对照组和过表达miR-30c组HepG2细胞,1×105个/孔接种到6孔板,培养48h后收集细胞,无水酒精固定后,4℃过夜,加入PI(10μg/mL)染色30min,预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次后,上流式细胞仪FL3通道处检测,使用仪器自带的cxp软件进行细胞周期分析。

1.6细胞凋亡检测取对照组、阴性对照组和过表达miR-30c组HepG2细胞,1×105个/孔接种到6孔板,培养48h后收集细胞,预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次,按照试剂盒说明书加入1.0μL PI和5.0μL Annexin V,避光染色30min后,上流式细胞仪FL1、FL3双通道检测,使用仪器自带的cxp软件进行细胞凋亡细胞比例分析,Annexin V阳性和PI与Annexin V双阳性的细胞为凋亡细胞。

1.7统计学处理采用SPSS17.0统计软件,计量资料两组间比较使用检验,多组均数比较使用方差分析,计数资料使用χ2检验,<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1miR-30c转染效果分析对照组、阴性对照组和过表达miR-30c组miR-30c的2-△△Ct值分别为0.16±0.04、0.15±0.03和0.58±0.14,其中对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(>0.05),过表达miR-30c组miR-30c的2-△△Ct值显著高于对照组和阴性对照组(<0.01),见图1。

2.2miR-30c对肝癌HepG2细胞增殖的影响从图2可见,在24、48、72h过表达miR-30c组A值显著低于对照组和阴性对照组(<0.01)。

对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(>0.05)。

2.3miR-30c对肝癌HepG2细胞周期的影响对照组、阴性对照组和过表达miR-30c组G2期细胞分别占整个细胞周期的(1
3.04±1.26)%、(12.43±1.18)%和(32.57±5.34)%,其中对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(>0.05),过表达miR-30c组G2期比例显著高于对照组和阴性对照组(<0.01)。

见图3。

2.4miR-30c对肝癌HepG2细胞凋亡的影响对照组、阴性对照组和过表达miR-30c组凋亡细胞的比例分别为(5.74±1.15)%、(6.12±1.34)%和(24.42±4.45)%,其中对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(>0.05),过表达miR-30c组凋亡细胞比例显著高于对照组和阴性对照组(<0.01)。

见图4。

3讨论
miR-30家族作为miRNAs的重要组成部分包括miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d和miR-30e共5个成员,2004年人类髓样白血病细胞系中首次发现了miRNA-30c的作用,随后在结直肠癌、子宫内膜癌、骨肉瘤中发现了低表达miR-30c现象[5-6],以及给肿瘤细胞转染miR-30c后可以发挥抗肿瘤作用[7]。

Liu等[8]的研究发现miR-30c可以抑制丙肝病毒核心蛋白诱导的肝癌细胞上皮向间皮的转变。

王虎明等[9]的研究发现miR-30c在肝细胞癌组织中低表达,并且与患者的预后密切相关,提出miR-30c低表达可能是肝癌预后不良的独立因素。

上述结果提示miR-30c在肝癌中可能发挥了抑癌基因的作用,本研究从细胞水平探讨miR-30c在肝癌中的作用。

本研究中慢病毒转染肝癌HepG2细胞后,过表图13组miR-30c表达2-△△Ct值的比较
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
对照组阴性对照组过表达miR-30c组
图23组细胞增殖A值的比较
1.6
1.2
0.8
0.4
0244872
时间(h)
a<0.01,与过表达
miR-30c组比较
a a
对照组
阴性对照组
过表达miR-30c组
346
图33组G 2期细胞的检测和比较
A ~C :细胞周期的流式细胞仪检测;D :3组G 2期所占比例的比较
图源3组细胞凋亡的检测和比较
A ~C :细胞凋亡的流式细胞仪检测;D :3组细胞凋亡的比较
达miR-30c 组
miR-30c 的2-△△Ct 值显著高于对照
组和阴性对照组(<0.01),说明了转染成功,可以用于后续的实验,空病毒载体也未引起miR-30c 过表达,可以用于阴性对照以排除慢病毒对肝癌细胞的影响。

MTT 细胞增殖实验显示过表达miR-30c 组A 值显著低于对照组和阴性对照组(<0.01),说明了过表达miR-30c 组细胞的增殖受到了显著抑制。

细胞周期分析显示过表达miR-30c 组G 2期比例显著高于对照组和阴性对照组(<0.01),说明过表达miR-30c 主要将肝癌HepG2细胞周期阻滞在G 2期。

细胞凋亡分析也显示过表达miR-30c 组凋亡细胞比例显著高于对照组和阴性对照组(<0.01)。

本研究结果说明miR-30c 在肝癌中可能起到肿瘤抑制作用。

Xu 等[10]研究发现miR-30c 可通过下调基质连接蛋白1,抑制子宫内膜癌的增殖,可以改善患者的预后,本研究未对miR-30c 的调控靶基因进行研究,有望在以后的实验中探讨。

综上所述,过表达miR -30可以抑制肝癌HepG2细胞增殖,阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡,miR-30有望成为肝癌诊断以及预后评估的分子标志物。

参
考
文
献
[1]梁靖晨,刘军杰.新型肝癌生物标志物的研究进展[J].医学综述,
2019,25(11):2143-2148.[2]王焱,唐博.miRNA 与肝癌密切关系的研究进展[J].世界最新医学信息文摘,2018,18(94):27+30.[3]徐晓峰,周怀君.miRNA-30c 的研究进展[J].东南大学学报(医学
版),2011,30(3):514-518.
[4]刘冲,唐浩,邓霖,等.血清miRNA-186,miRNA-30c 在肝细胞性癌中诊断价值的研究[J].现代检验医学杂志,2016,31(6):44-47.[5]刘斌,刘丽霞,臧爱民,等.miRNA-30c 在结直肠癌的表达与预后相关性分析[J].医学研究与教育,2017,34(6):1-6.
[6]孔祥怡,周怀君.miRNA-30c 及其靶基因MTA-1在子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤中的作用[J].东南大学学报(医学版),2016,35(3):
364-370.
[7]Sun R,Muheremu A,Hu Y.miRNA-30c can be used as a target in the diagnosis and treatment of osteosarcoma [J].Onco Targets Ther,
2018,11(14):9091-9099.
[8]Liu D,Wu J,Liu M,et al.Downregulation of miRNA -30c and
miR-203a is associated with hepatitis C virus core protein-induced epithelial-mesenchymal transition in normal hepatocytes and hepa ⁃tocellular carcinoma cells [J].Biochem Biophys Res Commun,2015,
464(4):1215-1221.
[9]王虎明,樊东升,徐杰,等.肝细胞癌患者癌组织miRNA-30c 水平变化及其临床意义探讨[J].实用肝脏病杂志,2019,22(2):248-251.[10]Xu X,Kong X,Liu T,Zhou L,et al.Metastasis-associated protein 1,
modulated by miR -30c,promotes endometrial cancer progression through AKT/mTOR/4E-BP1pathway [J].Gynecol Oncol,2019,154(1):207-217.
(收稿日期:2019-05-22)
(本文编辑:周立波;技术编辑:张珂)
4030
20100
对照组
阴性对照组过表达miR-30c 组
403020100
对照组阴性对照组过表达miR-30c 组
a
<0.01,与过表达
miR-30c 组比较a
<0.01,与过表达miR-30c 组比较a a a
a
G 148.43%G 232.39%S 19.17%
G 148.08%G 212.54%S 39.38%
G 151.47%G 212.08%S 36.45%
A
B
C
D
A B C
D
040801201600408012016004080120160。