分离工程第六章

三、应用及特点
应用
分离纯化
用于分离的相对分子质量范围：几 百到106。
用于蛋白质、多肽、脂质、抗生素、 糖类、核酸及病毒等生物物质的分 离纯化。
还可用于医药产业中无热原水的制 备及低分子生物制剂中抗原性杂质 的除去。
脱盐
生物分离中主要用于生物大分子溶 液的脱盐及除去小分子物质。
还用于溶解目标产物的缓冲液的交 换。
吸附作用力 选择性
所需活化能 吸附层
达到平衡所需时间
物理吸附 分子间引力
较差 低
单层或多层 快
化学吸附 化学键合力
较高 高
单层 慢
有机高分子吸附剂：多孔性聚乙烯、多孔 性聚酯等树脂具有大网络细孔结构，用于 抗生素，维生素B12分离浓缩。
还有多孔性纤维素，琼脂糖凝胶，葡聚 糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，羟基磷灰石 (层析、电泳)。
TSK凝胶，利用亲水性高分子合成制备， 机械强度较高，经化学修饰后也常用于 IEC和AC；
Superdex凝胶，将葡聚糖共价交联到高 度交联的琼脂糖珠体上制备的刚性凝胶， 分离精度高，用于高效液相层析；
Superose凝胶，琼脂糖经二次交联制备 的刚性凝胶，常用于高效IEC和AC。
凝胶特性参数
小
小
小
易
粉末活性炭
锦纶活性炭
大孔网状吸附剂
特点：脱色去臭效果理想；对有机物具有良好的选择 性；物化性质稳定；机械强度好；吸附速度快；解吸、 再生容易。 但价格昂贵，吸附效果易受流速以及溶质浓度等因素 的影响。
大孔网状吸附树脂的种类
非极性吸附树脂：苯乙烯交联而成，交联 剂为二乙烯苯，又称芳香族吸附剂。 中等极性吸附树脂：甲基丙烯酸酯交联而 成，交联剂亦为甲基丙烯酸酯，故又称脂 肪族吸附剂。 极性吸附剂：丙烯酰胺或亚砜经聚合而成， 通常含有硫氧、酰胺、氮氧等基团。
排阻极限：不能扩散到凝胶网络 内部的最小分子的相对分子质量。
分级范围：可分离的溶质的相对 分子量范围。
溶胀率：溶胀后每克干凝胶吸收 水分的百分数。
凝胶粒径：多用筛目或微米表示。粒 径越小，分离效率越高。软凝胶粒径 较大，硬凝胶粒径较小。
床体积：1g干凝胶溶胀后所占有的体 积。
空隙体积：层析柱中凝胶之间空隙的 体积。一般用水溶性蓝色葡聚糖 （2000KD）测定。
离子交换操作方法
树脂预处理 离子交换吸附 洗脱
交换容量：单位质量的干燥离子交换剂 或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的 一价离子的毫摩尔数。是表征离子交换 能力的主要参数。
阳离子交换剂：
R-H+ + NaOH = R-Na+ + H2O 阴离子交换剂：
2R + Cl- + Na2SO4 = R2+SO42- + 2NaCl
强离子交换剂的离子化率基本不受 pH值 影响，离子交换作用的pH范围宽，弱离 子交换剂的离子化率受pH值影响很大， 离子交换作用的pH范围小。弱酸性阳离 子交换剂在pH值减低时，离子化率逐渐 降低，离子交换能力逐渐减弱，弱碱性 离子交换剂在pH升高时，离子化率逐渐 降低，离子交换能力逐渐丧失。
离子化率与离子交换能力成正比。
操作
一般采用恒定洗脱法， 即采用组成一定的洗 脱液进行洗脱展开。
分子筛凝胶色谱原理
二、凝胶过滤介质
对凝胶过滤介质的要求
亲水性高，表面惰性，即与溶质不发生任何 化学或物理相互作用；
稳定性高，对pH、离子强度及化学试剂稳定， 使用寿命长；
具有一定的孔径分布范围； 机械强度高，允许较高的操作压力。
故GFC可用于未知蛋白质相对分子质 量的测定。
特点 优点
采用恒定洗脱法，操作条件温和， 收率接近100％；
介质不需清洗或再生，易实施循环 操作，提高产品纯度；
脱盐比透析速度快，精度高；比超 滤剪应力小，活性收率高；
分离机理简单，操作参数少，规模 放大容易。
缺点 选择性低，处理量小； 洗脱展开后产品被稀释。
由于离子交换过程中溶质的分配系数 随离子强度增大而急剧降低，故离子 交换操作需在低离子强度下进行。
IEC操作（离子交换层析操作） 很少采用恒定洗脱。因为：
m
A IB
m
蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感， 即离子强度的微小改变，引起分配系数 的很大变化；
不同蛋白质的B值可能相差很大，即在 同一离子强度下不同蛋白质分配系数可 能相差非常大。
蛋白质等生物大分子与小分子化合物离 子交换特性有很大差别：
A、蛋白质分子量大，树脂孔道对其空间 排阻作用大，不能与所有的离子交换活 性中心接触。
B、离子交换吸附蛋白质分子会妨碍其他 蛋白质与未吸附蛋白质离子交换基团发 生作用。
C、蛋白质是多价电荷，离子交换中可与 多个离子交换基发生作用。因此蛋白质 的交换容量远低于无机离子的交换容量。
迎头分析（前流分析法）
将混合物溶液（料液）连续通过色谱柱， 只有吸附力最弱的组分以纯品状态最先自 柱中流出，其它各组分都不能达到分离。
色谱峰呈阶梯式
顶替展开 利用一种吸附力比各被吸附组分都强的 物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。
顶替剂将料液中所含溶质按其与固定相 亲和力的大小不同从柱中次序顶替出来。
强阴、弱阴
离子交换的一般过程
根据有离子交换能力的pH范围不同分为： 强酸性、弱酸性阳离子交换剂 强碱性、弱碱性阴离子交换剂
常用的离子交换树脂
强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基） 和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）； 弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH, -OCH2COOH, C6H5OH等弱酸性基团； 强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲 胺基或二甲基-ß-羟基乙基胺基； 弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性 较弱；
第三节 吸附与离子交换
1、吸附 吸附：溶质从液相或气相转移到固相的 现象。 活性炭：脱色，除臭等。 活性炭称吸附剂。 吸附剂：多孔微粒。
活 性 炭（Active carbon）
Байду номын сангаас
活性炭种类 颗粒大小 表面积 吸附力 吸附量 洗脱
粉末活性炭 小
大
大
大
难
颗粒活性炭 较小
较大 较小 较小 难
锦纶活性炭 大
第六章 色 谱
又称层析或色层分离。属高度纯化技术。
初步纯化技术：超滤，离心，沉淀，溶 剂萃取，膜分离，吸附等。
高度纯化技术：选择性沉淀或结晶，电 泳，络合，层析等。
对药品，特别是注射用药品和基因工程 菌生成的产品，都需要高度纯化。
气相色谱 液相色谱
特点 分离精度高、设备简单、操作方便。 应用 物质成分的定量分析与检测； 生物物质的制备、分离和纯化。
凝胶主体还可以加入其它交换基团， 如磺酸基，羧甲基，二乙基氨基乙 基等，这些物质既有分子筛效应又 具有一定的交换性能
Desalting proteins
proteins
salts
相对分子质量的测定
在分级范围内蛋白质的分配系数（或 洗脱体积）与相对分子质量的对数成 正比.
m(v)=a-blgMr.
P184表6、2列出了生物分离中常用的 离子交换基团
常用于蛋白质交换的离子交换基团
阴离子交换基：二乙胺乙基（DEAE)季 铵乙基（QAE)。
阳离子交换基：羧甲基（CM),膦酸基 (P),磺丙基（SP)。
所用的基质材料主要有纤维素，葡聚糖 凝胶和琼脂凝胶。
DEAE anion exchanger
CMC Cation Exchanger
物理吸附：吸附剂、吸附质之间范德华 力。
化学吸附：吸附剂、吸附质之间化学键 力。
离子交换吸附（简称离子交换）：吸附 剂为离子交换剂，离子交换剂表面含有 离子基团或可离子化的基团，通过静电 引力吸附带相反电荷的离子，吸附过程 中发生电荷的转移。离子交换的吸附可 通过调节pH或提高离子强度的方法洗脱。
常见的吸附类型及其主要特点
离子交换树脂的结构
具有三维空间立体结构的网络骨架 联接在骨架上的活性基团 活性基团所带的相反电荷的活性离子 （可交换离子）
树脂的网络骨架
离交树脂三维空间立体结构
2、离子交换剂 分为阳离子交换剂 和 阴离子交换剂
阳离子有交换能力 阴离子有交换能力
活性基团为酸性
活性基团为碱性
离子交换的分类
按活性基团分类，可分为阳离子交换树 脂(cation exchange)（含酸性基团）和 阴离子交换树脂(anion exchange)（含碱 性基团）。 具体又可以分为：强阳、弱阳
大孔吸附树脂的吸附机理
非离子型共聚物，借助于范德华力从溶液中吸附 各种有机物，其吸附能力与树脂的化学结构、物 理性能以及与溶质、溶剂的性质有关。通常遵循 以下规律：
非极性吸附剂可从极性溶剂中吸附非极性溶质； 极性吸附剂可从非极性溶剂中吸附极性物质； 中等极性吸附剂兼有以上两种能力
吸附剂对溶质的吸附作用按吸附作用力 区分主要有三类：
第一节 色谱原理与分类
一、原理
根据混合物中，溶质在互不相溶的两相 之间分配行为的差别，引起移动速度的 不同而进行分离的方法。
互不相溶的两相分别称为：固定相和流 动相。
色谱系统的基本组成
生物分离主要用柱层析，柱层析处理量 大。
固定相分配系数大的后被洗脱。
二、分类
流动相与固定相
气相
固体 流动相液相液体
若采用离子强度不变的流动相进行恒定 洗脱，不同蛋白质的洗脱体积相差很大， 甚至分配系数大的蛋白质很难洗脱，造 成洗脱剂的大量消耗和洗脱时间的大幅 度增加。
多采用梯度洗脱法
线性梯度洗脱法
顶 替 展 开
可以选用不同的洗脱方案
最简单的是无梯度洗脱：即在整个色层分 离中，使用一种恒定组分的洗脱液（恒定 的洗脱能力）。如果溶质的特性非常相似 或非常不同这种形式的洗脱很少用，这种 情况，有一些组分会快速洗脱而另一些会 强烈地阻滞。 采用梯度洗脱（阶梯式洗脱）：洗脱剂的 洗脱能力可以连续或分段的提高。
常用商品化凝胶过滤介质
葡聚糖凝胶
Sephadex G，传统的软凝胶过滤介 质，目前仍广泛使用，但机械强度 低。
琼脂糖凝胶
Sepharose，常用，但机械强度较低；
Sepharose CL，用环氧氯丙烷交联 制备，机械强度较高；
此类凝胶经化学修饰后用于IEC、 HIC和AC。
其他
的分配行为不同，在洗脱过程中彼此得到分离。
蛋白质是多价的两性高分子电解质，具有 等点pI，当溶液pH偏离等电点，pH大于 pI时，带负电荷，可被阴离子吸附剂所吸 附，pH小于pI时，带正电荷，可被阳离子 交换剂吸附。
蛋白质的静电荷数 B 反离子价数
B值为蛋白质的净电荷数与反离子价数（离 子交换基的离子价数）之比。由于蛋白质 净电荷数常为两位数以上，B值很大。因此 离子强度的微小改变会引起分配系数很大 改变。
固定相
超临界以流固体体为载体的液体薄层
固定相的形状
纸层析 薄层层析
多用于分析
柱层析 用于大量制备分离
压力
以固体为固定相的液相柱层析中，根据操作压
力的不同分为：
低压 0.5MPa 中压0.5 ~ 4.0MPa
常用于大量制备分离
高压4.0 ~ 40MPa 主要用于成分分析
流动相流动方向
轴向流层析 径向流层析
优点：规模放大容易；柱
效率高。
缺点：柱设备造价较高。
分离操作方式 根据分离操作方式不同分为:
洗 脱 展 开 迎 头 分 析 顶 替 展 开
洗脱展开（洗脱层析）
料液中的溶质根据其在固定相和流动相间 分配行为的不同，在层析柱出口处被展开 形成相互分离的层析峰。
三种操作方法中，洗脱展开最常用。
分配机理
根据溶质与固定相之间的相同作用机理， 液相层析法可分为：
凝胶过滤层析GFC 离子交换层析IEC 反相层析RPC 疏水性相互作用层析HIC
第二节 凝胶过滤层析
一、原理与操作
原理
利用凝胶粒子（凝胶 过滤介质）为固定相， 根据料液中溶质相对 分子质量的差别进行 分离的液相层析法。
第四节 离子交换层析
一、原理与操作
原理
利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质 与离子交换剂之间静电相互作用力的差别 进行溶质分离的洗脱层析法。
荷电溶质在离子交换剂上的分配系数为：
m

A IB
m
其中：I为流动相的离子强度；A和B为常数； m∞为离子强度无限大时溶质的分配系数。
对于不同的溶质，A与B不同，即在离子交换剂上