甲流重组犬流感病毒的小鼠致病性研究

甲流重组犬流感病毒的小鼠致病性研究
赵卫锋1，何 平1，周华波1,2，邹媛婧1，廖卓韵1，王凌霄1，
1
（1. 530004；2. 南宁市华波宠物医院，南宁 530004；3.山东省农业科学院畜
摘 要：本研究通过建立犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）感染BALB/c小鼠模型，探索新发现的甲流重组CIVs对小鼠的致病性。

我们采用9株H1N1和1株H3N2甲流重组CIVs，以106 TCID50/ mL的剂量滴鼻攻毒10组小鼠。

结果表明：感染后4 d小鼠体重均有一定程度的下降，其中A/Canine/Guangxi/LZ56/2015（H1N1）（简称LZ56）组的小鼠体重下降最为明显（P<0.5），其存活率为77.78%；通过TCID50测定发现10株甲流重组CIVs均能在小鼠的鼻窦和肺脏复制，以LZ56组的复制滴度最高，分别达到107.3 TCID50/ mL和105.3 TCID50/ mL；肺脏病理切片观察发现LZ36、LZ45、LZ56和QZ5组出现不同程度病变，以支气管上皮细胞坏死脱落，肺泡壁增厚，肺泡腔以及支气管内有大量的弥漫性浸润的单核细胞为主要特征。

结果表明，新型重组CIVs均能感染BALB/c小鼠，并能在小鼠体内较好复制，甚至致死，一旦这些新型CIVs以犬为中间宿主传播给人，势必对人类健康构成重大威胁。

因此，加强对CIVs的监测将为防控人流感大暴发提供提前预警。

关键词：甲型流感；重组；犬流感病毒；致病性；小白鼠
中图分类号：S852.659.5文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2017）06-0032-05 PATHOGENICITY OF REASSORTANT CANINE INFLUENZA VIRUS WITH
PANDEMIC/2009 IN MICE
ZHAO Wei-feng1, HE Ping1, ZHOU Hua-bo1,2, DING Yang-bao1, CHEN Quan-jiang1, LIU Lin1,
LI Rui-kai1, ZOU Y uan-jing1, LIAO Zhuo-yun1, W ANG Ling-xiao1, WEI Zu-zhang1, OUY ANG Kang1,
SUN Wen-bo3, HUANG Wei-jian1, CHEN Ying1
(1. College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2.Huabo Pet Hospital, Nanning 530004,
China; 3. Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China)
Abstract: In the present study, we assessed the pathogenicity of novel emerging reassortant CIVs carrying pandemic/2009 segments in the mouse model. Mice were infected intranasally with 106 TCID50/mL of 9 H1N1 and 1 H3N2 reassortant CIVs. Results showed that body weights of all mice decreased. Especially, mice infected with A/Canine/Guangxi/LZ56/2015 (H1N1) lost more weights at 4 dpi and 77.78% of mice survived. Besides, these reassortant viruses replicated in turbinates and lungs. The virus titers of reached to 107.3 TCID50/ mL in turbanates and 105.3 TCID50/mL in lungs. The pathological lesions were observed, characterized by necrosis of bronchial epithelials, thickness of alveolar septas and interstitial walls and diffuse infiltration of mononuclear cells. Taken together, our results showed that
收稿日期：2017-03-20
基金项目：广西自然科学基金回国项目（2015GXNSFCA139002）；广西自然科学基金青年基金项目（2016GXNSFBA380219）；
广西大学博士启动项目（XBZ160123）；山东省博士基金（BS2013SW022）
作者简介：赵卫锋，女，硕士，主要从事宠物流感病毒分子生物学研究
通信作者：陈樱，E-mail：yingchen@
犬流感（canine influenza，CI）是由犬流感病
种唾液酸受体，即SAα
[1,2]
感病毒的感染，如禽源H3N2[3]、禽源H5N1[4]、禽源H5N2[5]、禽源H9N2[6]、禽源H10N8[7]和新型重组毒株流感病毒[8]。

此外，犬血清学调查也证实，2009年爆发的甲型流感病毒株（pdm/09）、季节性人流感H3N2亚型病毒也都曾感染犬[9]，并且从病毒分离及动物实验证实了pdm/09株感染犬[10]，为人流感病毒感染犬提供了直接的证据。

同时我们对广西地区CIV的临床调查发现该病毒在呈地方流行态势，某些城市如梧州CIV检测阳性率高达40%[11]。

随着2009年甲型流感病毒pdm/09株的暴发，韩国陆续报道发现了与该毒株重组的新病毒株。

Song等[8]报道了与pdm/09重组的新型H3N1 CIV，其内部基因及NA基因来源于pdm/09谱系。

Moon等[12]报道了M基因来源pdm/09谱系，其他基因片段来源H3N2 CIV的重组病毒H3N2mv株。

犬和雪貂试验发现该病毒可引起典型呼吸道症状，并且相比原始的禽源H3N2 CIV 具有较强的毒力和复制能力，证实了源于pdm/09病毒的M基因可以增强病毒复制和传播能力[12]。

本实验室前期研究中，从宠物犬中分离获得了携带病毒pdm/09株内部基因的重组CIVs，他们以欧亚类禽的表面基因（HA和NA）、pdm/09的内部基因（PB2、PB1、PA和NP）为主要特征，其中某些毒株甚至出现“人+猪+犬”三种不同宿主来源片段的重组形式。

因此，为了解这些不同亚型pdm/09重组CIVs对哺乳动物的致病性，本实验通过建立CIVs感染小鼠模型来探索他们的易感性和复制能力，为将来有效地防控新型流感病毒在人类的暴发提供科学依据。

1 材料与方法1.1 毒株由本实验室分离保存，具体信息如表1
9~11日龄SPF鸡胚购自广西丽原生
6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠约20 g，
1.4 实验方法 采用9~11日龄SPF鸡胚尿囊腔接种法扩增病毒，取细胞上清经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每个样品接种2枚，0.2 mL/枚。

37℃孵育，弃去24 h内死亡的鸡胚，72 h后收胚，无菌收集鸡胚尿囊液，进行RT-PCR鉴定，然后接种MDCK细胞并通过空斑试验和TCID50测定其病毒效价。

1.5 实验动物的感染99只小鼠随机平均分成实验组（10组）和对照组，每组9只，采取麻醉滴鼻的接种方式，实验组小鼠接种50μL（约含1.0×106 TCID50/mL）病毒液，对照组接种50 μL/只 DMEM。

接种开始前时刻记为0天，并称其体重，作为参考值，然后每组小鼠每天称其体重，当其体重下降20%后则默认其死亡。

观察其临床症状，统计死亡率，攻毒后3 d和5 d时每组随机剖杀三只小鼠，采集脑、上鼻窦组织、心、肝、脾、肺（左肺固定，右肺滴定）、肾和肠道组织，然后进行TCID50测定病毒效价并观察肺脏的病理变化。

1.6 实验数据分析 运用Graph Pad Prism 5软件进行图表制作，并运用SPSS统计分析软件分析小鼠实验所得到的实验数据。

2 结果
2.1 攻毒后小鼠体重变化 攻毒后3 d开始，LZ56、QZ5和WZ 2组出现不同程度的精神沉郁、食欲减退和被毛凌乱等临床症状。

体重均有一定程度下降，其中LZ56组的小鼠体重下降最为明显，差异具备显著统计学意义（P<0.5），在攻毒后8 d体重降到83%，之后逐渐恢复，但是仍比其他组的体重低（如图1）。

LZ36LZ20LZ52LZ45LZ56QZ5WZ1WZ2LZ317NNTW15Control
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
体重(%)时间(d)
1201101009080
图1 小鼠体重变化图
Fig.1 Body weight of the mice infected with different
CIVs
2.2 攻毒后小鼠存活率 通过14 d的体重监测，结果只有LZ56组的重组H1N1亚型毒株均在攻毒后6 d和攻毒后7 d致死小鼠，其存活率为77.78%，其他组的毒株均未能致死小鼠，其存活率为100%（图2）。

2.3 小鼠攻毒后病毒在呼吸道的复制情况 采用TCID 50方法，对10组小鼠各个脏器中病毒进行滴定，我们发现这些重组病毒均能在肺脏和上鼻窦复制，平均病毒滴度≥10
3.7 TCID 50/mL，其中LZ56组在肺脏的复制能力较好，感染后3 d和5 d分别达到106.0 TCID 50/mL和106.1 TCID 50/mL。

此外LZ45组相比其他组的肺脏复制较差，感染后5 d的病毒滴度仅有
103.7 TCID 50/mL。

相对应的是，上鼻窦病毒滴度分别为104.5 TCID 50/mL和104.9 TCID 50/mL。

结果表明这些重组H1N1和H3N2亚型CIVs能较好地适应在哺乳动物体内的复制，甚至具有潜在的传播能力（图3）。

2.4 小鼠肺脏病理变化 我们采用HE染色观察小鼠肺脏损伤程度，结果发现所有CIVs重组病毒都可以造成肺脏不同程度的病变，其中以LZ36、LZ45、QZ5和LZ56组小鼠肺脏损伤较为严重，主要以支气管坏死脱落、肺泡壁增厚、肺泡腔以及支气管内有大量的弥漫性浸润的单核细胞为主。

对照组肺泡均匀，无萎缩或扩张，无充血或炎细胞浸润（HE染色-蓝紫色，图中黑色箭头所指）、巨噬细胞（HE染色-红色，图中蓝色箭头所指），见图4。

毒株Strains
简称Abbreviation 基因片段Gene segments PB2PB1PA HA NP NA M NS E P E P T E P E P T E P E P T E P E P T E P E P T E P E E T E P E E T E P E E T A/Canine/Guangxi/LZ36/2015(H1N1)LZ36P P P E P E P A A/Canine/Guangxi/LZ45/2015(H3N2)
LZ45
P P P A P
A P A
P: 2009年甲型流感病毒谱系; T: 北美三重重组猪流感病毒谱系; E: 欧亚禽源猪流感病毒谱系; A: 禽源H3N2亚型犬流感病毒谱系P: Pandemic/2009; T: Triple reassortant swine; E: Eurasian Avian-like swine; A: Avian-like H3N2 canine 0 2 4 6 8 10 12 14
存活率(%)
时间(d)
LZ36LZ20LZ52LZ45LZ56QZ5WZ1WZ2LZ317NNTW15Control
110100908070
图2 小鼠存活率
Fig.2 Survival rate of the mice infected with different CIVs
20×
40×
图4 感染后5 d 小鼠肺脏伊红苏木素染色图
Fig.4 HE staining of microscopic lung sections from mice
infected with reassortant CIVs at 5 d.p.i
3 讨论
不同宿主基因片段的重组产生的新型流感病毒，容易导致传播力和毒力增强。

由于猪呼吸道上皮细胞受体拥有结合人和禽流感病毒的受体，使得猪成为最佳的中间宿主，接受来自人和禽流感病毒的感染，从而产生新型流感病毒。

随着2009年H1N1甲型流感病毒的暴发，除了在猪群发现携带pdm/09病毒基因的重配病毒，宠物犬也陆续发现了一系列的重配病毒，如H3N2 CIV 和pdm/09病毒中的M基因重组
[12]
，H3N2 CIV HA基因和pdm/09病毒重组的
H3N1 CIV [8]等。

此外，韩国学者采用不同动物模型评估禽源H3N2 CIV对不同宿主的致病性差异，小鼠无任何临床症状，从而确定无适应性的小鼠不是禽源H3N2亚型 CIV感染的最佳模型
[13]。

但是后续的实
验发现，携带pdm/09病毒的禽源H3N2亚型 CIV却能在小鼠上复制。

Lyoo等[14]用携带pdm/09的PA、M和NS基因的重组H3N2 CIV感染小鼠，结果发现该病
毒不仅引发小鼠死亡，而且使犬和雪貂在感染后d4排毒。

Moon等[12]采用携带H3N2亚型 CIV 和pdm/09病毒的M基因重组株进行了雪貂和犬感染实验，结果表明重组H3N2亚型 CIV可以通过直接接触感染引发传播，并且有典型的呼吸道症状和排毒现象。

Lyoo等[14]和Moon等[12]的实验结果也说明这一点，携带pdm/09基因的的重组病毒，不仅具有致病性，而且具有一定传播能力。

为评估这些新型pdm/09重组CIVs的生物学特性，本研究通过建立无适应性感染小鼠模型，探索了这些重组病毒对小鼠的致病性和复制能力。

与韩国学者报道一致的是，这些重组毒株能够导致小鼠出现不同程度的临床症状和病理变化。

尽管这些重组毒株的毒力不是很强，但是值得关注的是，所有毒株都可以在肺脏和上鼻窦复制，特别是LZ56组展现较好的复制能力，甚至致死小鼠。

序列分析发现在LZ56毒株HA蛋白的225位点发生改变，由谷氨酸（E）变为甘氨酸（G）（数据未出示）。

研究证实，HA225G将有利于病毒在肺脏复制，引发严重的肺炎[15]。

此外，有研究证实pdm/09的基因片段与毒力、复制能力和传播特性相关。

Lakdawala [16]和Chou等[17]用病毒pdm/09株的M基因和病毒A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）株的7个基因片段重组的流感病毒进行雪貂和豚鼠实验证实，M
基因在增强传播能力中扮演着关键角色。

Lyoo等[14]研究表明病毒pdm/09株的PA和NS 基因在病毒的传播能力和致病性上也有很重要的作用，尤其是PA-
LZ36LZ20LZ52LZ45LZ56QZ5WZ1WZ2LZ317NNTW15Control
病毒滴度(L o g 10 T C I D 50/m L )
86
4
2
图3 病毒在肺脏和上呼吸道的复制情况
Fig. 3 Virus titers of reassortant CIVs in the lung and turbinate
感病毒的HA和NA基因决定。

因此，这些携带EA表面基因和禽源H3N2 CIV表面基因，pdm/09内部基因
步研究。

死小鼠。

基因的交替重配将会驱动病毒的进化和对宿主的适应性，一旦这些新型重组CIVs具有跨宿主传播的特性，人类将受到直接的威胁。

因此，加强对宠物犬中CIVs重组事件的监测，切断流感病毒中间传播路径，将有利于及早防控人类流感大暴发。

参考文献
[1] M u r a n a k a M,Y a m a n a k a T,K a t a y a m a Y,et al.
Distribution of influenza virus sialoreceptors on upper and lower respiratory tract in horses and dogs[J]. J Vet Med Sci, 2011, 73(1): 125-127.
[2] Ning Z Y, Wu X T, Cheng Y F, et al. Tissue distribution
of sialic acid-linked influenza virus receptors in beagle dogs[J]. J Vet Sci, 2012, 13(1): 219-222.
[3] Yang X, Liu C, Liu F, et al. Identification and genetic
characterization of avian-origin H3N2 canine influenza viruses isolated from the Liaoning province of China in 2012[J]. Virus Genes, 49 (2): 342-347.
[4] Kim H M, Park E H, Yum J, et al. Greater virulence of
highly pathogenic H5N1 influenza virus in cats than in dogs[J]. Arch Virol, 2015, 160(1): 305-313.
[5] Z h a n G J,L i n g Z S,Z h u Y L,e t a l.G e n e t i c
characterization of a novel influenza A virus H5N2 isolated from a dog in China[J]. Vet Microbiol, 2012, 155(2-4): 409-416.
[6] Sun X, Xu X, Liu Q, et al. Evidence of avian-like H9N2
influenza A virus among dogs in Guangxi, China[J].
Infect Genet Evol, 2013, 20: 471-475.
[7] Su S, Qi W, Zhou P, et al. First Evidence of H10N8 Avian
Influenza Virus infections among Feral Dogs in Live Poultry Markets in Guangdong Province, China[J]. Clin Infect Dis, 2014, 59(5): 748-750.
and canine H3N2 influenza viruses in Korea[J]. J Gen Virol, 2012, 93(Pt 3): 551-554.
Y, Du L, et al. Serological survey of
Du L, et al. Natural and experimental
with pandemic H1N1/2009 influenza
何平, 等. 2013年~2015年广西宠物犬流感临床流行病学调查[J]. 动物医学进展, 2016, 37(5): 122-125.
[12] M oon H, Hong M, Kim J K, et al. H3N2 canine influenza
virus with the matrix gene from the pandemic A/ H1N1 virus: infection dynamics in dogs and ferrets[J].
Epidemiol Infect, 2015, 143(4): 772-780.
[13] Lyoo K S, Kim J K, Kang B C, et al. Comparative
analysis of virulence of a novel, avian-origin H3N2 canine influenza virus in various host species[J]. Virus Res, 2015, 195: 135-140.
[14] L yoo K S, Na W, Yeom M, et al. Virulence of a novel
reassortant canine H3N2 influenza virus in ferret, dog and mouse models[J]. Arch Virol, 2016, 161(7): 1915-1923.
[15] P ascua P N, Song M S, Lee J H, et al. Virulence and
transmissibility of H1N2 influenza virus in ferrets imply the continuing threat of triple-reassortant swine viruses[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109(39): 15900-15905.
[16] L akdawala S S, Lamirande E W, Suguitan A J, et
al. Eurasian-origin gene segments contribute to the transmissibility, aerosol release, and morphology of the 2009 pandemic H1N1 influenza virus[J]. PLoS Pathog.
2011, 7(12): e1002443.
[17] C hou Y Y, Albrecht R A, Pica N, et al. The M segment of
the 2009 new pandemic H1N1 influenza virus is critical for its high transmission efficiency in the guinea pig model[J]. J Virol, 2011, 85(21): 11235-11241.
[18] G onzalez G, Marshall J F, Morrell J, et al. Infection and
pathogenesis of canine, equine, and human influenza viruses in canine tracheas[J]. J Virol, 2014, 88(16): 9208-9219.。