课件2：3.1.1 重组DNA技术的基本工具

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸， 他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
黏性末端
黏性末端
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀 SmaI 限制酶的作用： 只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切 口，是平整的，这样的切口叫平末端。
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
二、DNA连接酶 ——分子缝合针 （2）T4 DNA连接酶连接平末端，效率低
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
E·coli DNA连接酶与T4DNA连接酶比较：
类型
来源
功能
相同点
差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌
G AA TT C C TT AA G
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
G AA TTC CT T A A G
G AATT C C TT AA G
缺口怎么办？
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
1. 作用： 将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶 切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
2. 种类： ⑴ E·coli DNA连接酶 ⑵ T4 DNA连接酶
• 2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种——中棉所41 ，该品种能够缓解棉铃虫抗药性。
我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家！
什么是基因工程？
指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋 予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于 基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
➢ 如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？ 会产生相同的黏性(平)末端
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀 思考： 把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
G AATTC
G AATTC
C TTAA G
C TT AA G
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
G AATT C C TTAA G
（3）有某些标记基因 便于鉴定和筛选
（4）对受体细胞无害、易分离
大肠杆菌及质粒结构模式图
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
4、质粒的特点： 质粒是基因工程中最常用的运载体
质
最常用的质粒是大肠杆菌的质粒
粒 的
细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子
特
存在于许多细菌及酵母菌等生物中
点 质粒的存在对宿主细胞无影响
（1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？ （2）在笔记本上写出EcoRI切割后的所产生的末端和目的基因片段。
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
练习使用EcoRI剪切目的基因
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…… ……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
5、两种常用的限制酶： EcoRⅠ和SmaⅠ
EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶； SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀 EcoRI 限制酶的切割： 只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
什么样的末端才能连接起来？，
二、DNA连接酶 ——分子缝合针 3、DNA连接酶的缝合作用
可把黏性末端之间的缝隙 “缝合”起来， 两DNA片段要具有互补的 黏性末端才能拼起来
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！
二、DNA连接酶 ——分子缝合针 （1）E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接粘性末端
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
2.种类： 数千种
3.特点： 识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
（特异性）
4.作用部位： 特定切点上的磷酸二酯键
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
限制酶
5’
A
1’ 4’
3’
2’
磷酸二酯键
5’
G
4’
1’
3’
2’
AT GC CG TA
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
重组DNA技术的基本工具
为了棉花姓“中国”
• 1992年，一场史无前例的棉铃虫灾害吞噬着 中国的棉田，我国棉花产业遭遇灭顶之灾；
• 国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术，到1999 年外国抗虫棉已占领我国95%的棉花市场份 额，国内棉花品种市场迅速流失。
棉花棉铃虫幼虫
为了棉花姓“中国”
• 1998年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新品种——中棉 所29，使低龄棉铃虫的死亡率超过90%；
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
规律：---选择酶切位点的原则：
1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点； 2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因
课堂小结
基 因 工 程 的 基 本 工 具
限制酶
来源： 主要来源于原核生物 特点： 具有专一性 作用部位：磷酸二酯键 结果： 形成黏性末端或平末端
在C和G 之间切开
中轴线
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
平末端
平末端
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
6、结果： 产生黏性末端或平末端
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
练习使用EcoRI剪切目的基因
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…… ……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
4、DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：
DNA连接酶
DNA聚合酶
相 作用实质 同 化学本质
都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质
模板
不需要
需要DNA的一条链作模板
作用对象 在两个DNA片段之间
不
形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接到已有的 DNA片段上，形成磷酸二酯键
同 作用结果 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链
目的基因
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCTCGGTATG AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
GAGCCATACTTAA GCCGTATG…
… TCCTAG … AGGATCTTAA
目的基因
AATTCCATAC … GGTATG …
科学家究竟用到了哪些“分子工具”？ 这些“分子工具”各具有什么特征呢？
3.1 重组DNA技术的基本工具
三种“分子工具”
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
⒈主要来源： 主要从原核生物中分离纯化
根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身 的目的。
EcoRⅠ ……G-A-A-T-T-C…… ……C-T-T-A-A-G……
HindⅢ ……A-A-G-C-T-T…… ……T-T-C-G-A-A……
BamHⅠ ……G-G-A-T-C-C…… ……C-C-T-A-G-G……
仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何 特点？
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补 对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找 到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的 碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
1.作用： 将外源基因送入受体细胞。
质粒 2.种类： 动植物病毒
λ噬菌体的衍生物
质粒
分子运输车
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
3、运载体需具备的条件
（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存 能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；
（2）有一个至多个限制酶切点 便于与不同目的基因结合
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
DNA连接酶 连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
①对受体细胞无害；
载体
作为载体 的条件
②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
种类：质粒、λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
谢谢观看!
T4DNA连接酶
T4噬菌体
恢复磷酸 二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
DNA聚合酶的作用
A
A
T
T
G
T
T
A
A
C
DNA聚合酶 DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶 DNA聚合酶
A A
T
T
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
【归纳定义】工程别名：DNA重组技术 操作对象：基因 操作水平：DNA分子水平 工程实质：基因重组
“工欲善其事，必先利其器”。在培育转基因生物时，既要在体外对含有 所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组DNA分子导入生 物体内，并使其表达。
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微 小的分子进行操作，是非常精细的共工作。
TaqⅠ ………T-C-G-A……… ………A-G-C-T………
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀 【反馈练习】
下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ D）
A．GAATTC CTTAAG
B．GGGGCCCC CCCCGGGG
C．CTGCAG GACGTC
D．CTAAATC GATTTAG
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
质粒的复制只能在宿主细胞内完成
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
三、基因进入细胞的载体——分子运输车 实例：重组DNA分子的模拟操作
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
GCCGTATG…
… TCCTAG AATTCTCGGTATG AATTCCATAC … … AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA GGTATG …
……CTACGATG ……GATGCTACTTAA
AATTCCCTAA……
黏性
末端
GGGATT……
目的基因
AATTC刀
➢ 要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几 个黏性(平)末端？ 要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。
点
用途
基因工程
DNA复制
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
【反馈练习】 根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b a
a：磷酸二酯键；b：氢键
A.切断a处的酶为___①____ B.连接a处的酶为__③__④___ C.切断b处的酶为___②____