一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011263643.7
(22)申请日 2020.11.12
(71)申请人 中国药科大学
地址 210009 江苏省南京市鼓楼区童家巷
24号
(72)发明人 郝海平　叶慧　皖宁　田扬　
(74)专利代理机构 南京纵横知识产权代理有限
公司 32224
代理人 刘艳艳
(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)
(54)发明名称
一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛
选方法及其应用
(57)摘要
本发明公开了一种基于化学蛋白质组学的
小分子靶标筛选方法及其应用，为从复杂的生物
样品体系中发现小分子结合靶标的化学蛋白质
组学方法靶点响应性可及性变化谱技术（TRAP ），
在包含目标小分子作用靶标的生物样本（如细胞
裂解液）中，利用化学标记试剂共价修饰蛋白中
特定活性氨基酸（如赖氨酸），在终止标记过程
后，利用定量蛋白质组学技术，比较生物样本在
缺乏及存在孵育的小分子时其中全蛋白组水平
各活性氨基酸被修饰的丰度的变化，以此表征蛋
白位点的可及性变化，根据变化的倍数及显著性
筛选孵育小分子配体导致化学可及性显著变化
的位点作为候选靶标及小分子配体与靶标的潜
在结合和诱导变构的位点。

权利要求书2页 说明书12页 附图4页CN 112485442 A 2021.03.12
C N 112485442
A
1.一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的小分子靶标筛选方法基于靶点响应性可及性变化谱技术，包括：
（1）共价标记：在包含目标小分子作用靶标的生物样本中，利用化学标记试剂共价修饰生物样本蛋白中特定活性氨基酸；
（2）在终止标记过程后，利用定量蛋白质组学技术获得定量结果数据，比较生物样本在缺乏以及存在孵育小分子配体时其中全蛋白组水平各活性氨基酸被修饰的丰度的变化，以此表征蛋白位点的可及性变化；根据变化的倍数及显著性筛选孵育小分子配体导致生物样本中蛋白化学可及性显著变化的位点，将所述位点作为候选靶标及小分子配体与靶标的潜在结合和诱导变构的位点。

2.根据权利要求1所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的活性氨基酸为具有化学活性基团的氨基酸，包含赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。

3.根据权利要求2所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的活性氨基酸优选为赖氨酸。

4.根据权利要求3所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，用于标记活性赖氨酸的化学标记试剂为氟苯基酯、N‑羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、磺化NHS、丙烯酸磺酰酯、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、酰亚胺酯、琥珀酸酐、醋酸酐、马来酸酐、2‑乙酰苯基硼酸、磺酰卤、环氧化物、氟苯、吲哚及吲哚衍生物、酰基叠氮化物中的一种，或为醛基化合物与还原剂的组合；
所述醛基化合物包括甲醛、乙醛、丙醛；还原剂包括硼烷‑吡啶络合物、硼氢化钠、二甲胺硼烷。

5.根据权利要求4所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述甲醛采用氘代甲醛。

6.根据权利要求5所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，氘代甲醛与包含目标小分子作用靶标的生物样品蛋白中特定活性氨基酸的摩尔比为5:1‑15:1，更优选为10:1。

7.根据权利要求1所述的小分子靶标筛选方法，其特征在于，所述的定量蛋白质组学技术采用非标定量法或多通道标记定量法，多通道标记定量法包括串联质谱标签TMT定量蛋白组学、相对及绝对定量等重标签iTRAQ定量蛋白组学。

8.如权利要求1‑7任一项所述的小分子靶标筛选方法在筛选小分子靶标中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：
（1）通过蛋白鉴定及定量分析软件，根据研究的物种选择Uniprot数据库中与待测生物体系对应种属的蛋白组，设定酶解所用的蛋白酶类别，设定翻译后修饰设置为脲甲基化(半胱氨酸位点,固定)、氧化(甲硫氨酸位点,可变)、氘代二甲基化(赖氨酸位点,可变)、氘代甲基化(赖氨酸位点,可变)，一级质谱MS及二级质谱MS/MS的质量误差范围根据仪器的分辨率及灵敏度设定；
（2）利用蛋白鉴定定量软件对孵育前后含有赖氨酸的肽段被标记试剂标记的比例变化进行分析得到比例变化TRAP Ratio值，并对定量结果进行统计学分析得到统计学分析结果：对通过非标定量法获得的定量结果采用双尾学生t检验统计分析计算p值；对多通道标记定量结果，使用Benjamini & Hochberg法计算q值；
（3）从生物体系中根据比例变化TRAP Ratio值及统计学分析结果筛选小分子靶标，筛选标准的设置根据小分子与靶标的亲和力强弱进行调整。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，筛选标准的设置为：
针对活性代谢物及天然产物这些弱结合配体，结合及变构位点筛选标准为非标定量结果所得的肽段可及性变化TRAP Ratio> 1.5倍，并且t检验所得p值<0.05；多通道标记定量结果的肽段可及性变化TRAP Ratio> 1.5倍，所得q值<0.03；
针对与靶标存在强亲和力的小分子药物，结合及变构位点的筛选标准为肽段可及性变化TRAP Ratio值>2倍，并且t检验分析所得p值<0.01；多通道标记定量结果的肽段可及性变化TRAP Ratio> 2倍，所得q值<0.01。

一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用。

背景技术
[0002]在新药的研究与开发中，药物靶标的明确至关重要。

例如，来自于中药的天然产物尽管具有良好的药效和较低的毒性，但由于药理机制以及靶标分子不确定等原因限制了药物进入市场；对于现有上市药物，对其作用靶标的发现和确证能够有效指导针对新发现的功能靶标进行候选分子的结构设计和优化，推进新药研发进程；对于针对已知靶标进行的纯蛋白水平的药物筛选所获得的候选化合物是否能够在真实的细胞、组织等复杂生物体系中结合其靶标也是决定其临床效果的重要指标。

因此，随着新药研发领域对药物作用机制阐述要求的不断提高，小分子靶标发现是亟待革新的技术瓶颈。

[0003]小分子靶标发现一直是个热门且棘手的问题。

经典的靶标发现手段如亲和纯化色谱，通过固定小分子配体于固相基质上，在与含有靶标的细胞裂解液等孵育后，对富集到的蛋白进行鉴定即可获得初步的靶标信息。

然而该方法过程繁琐，依赖于对目标化合物的固定化，可能会干扰其与靶蛋白的相互作用的，难以获得真实生理环境下与小分子配体产生相互作用的靶标蛋白。

此后兴起的基于化学蛋白质组学技术的蛋白质活性谱技术(ABPP，Activity‑based protein profiling)，则通过修饰目标小分子配体为化学探针，在保留小分子参与靶标亲和作用的功能结构的基础上添加点击反应基团和共价结合靶蛋白的官能团，再对与探针结合的蛋白进行分析，发现靶标。

由于此方法需要基于配体小分子结构逐个进行探针设计，必须以构象关系为探针设计的理论基础，合成实验过程繁杂、周期长、通量低，难以作为普适性的小分子靶标发现技术进行推广。

因此，不对目标化合物进行修饰的靶标发现策略应运而生，例如药物亲和反应靶点稳定性技术(DARTS，drug affinity responsive target stability)、细胞热稳定分析法(CETSA，cellular thermal shift assay)、氧化蛋白稳定性技术(SPROX，stability of proteins from rates of oxidation)等等，这些方法都是基于定量蛋白质组学技术，考察配体结合前后靶蛋白对水解酶、热变性、有机溶剂变性条件下蛋白稳定性的改变，从而筛选受配体结合影响稳定性的蛋白为靶标，然而这一类方法通常需要配体与靶标结合后诱导出稳定和显著的构象变化，对含量较高的靶标蛋白质的筛选效果好，不适合低丰度蛋白、弱结合蛋白或结合不改变聚集和变构过程的靶标蛋白，并且无法提供小分子与靶标的结合位点信息。

发明内容
[0004]目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用，创新性地建立了一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标发现技术Target Responsive Accessibility Profiling(TRAP)。

其原理是靶标蛋白的高级结构在与小分子配体结合后，其配体结合域及诱导变构区域的氨基酸残基的溶剂可及性会
发生显著变化；该变化能够被还原烷基化等化学共价标记反应所捕捉，再利用定量蛋白质组学手段对细胞内的全蛋白组进行分析，能够获得真实生物体系内小分子孵育后全体蛋白组的可及性变化信息，从中筛选出小分子诱导可及性变化最显著的蛋白即为小分子靶标，这为阐述药物及内源性代谢物等活性分子对细胞的调控机制奠定了基础。

本方法采用了针对蛋白质中活性赖氨基酸的共价修饰反应，其标记效率高，定量结果可靠，操作便捷，成本低廉，且质谱数据信息的后期分析简单方便，并且能够结合高通量定量蛋白质组学流程，实现高效、快速的靶标发现。

[0005]综上所述，本发明开发的是一种既能够实现在复杂的生物体系中发现药物等小分子靶标蛋白的技术，通过直接测定小分子结合诱导的靶标蛋白可及性变化筛选出靶标及结合位点，能够普适性的运用于多个小分子配体的高通量靶标发现。

该发明对于目前无晶体结构的蛋白也能提供适量的配体结合位点的信息，并且适用于与小分子存在弱结合的靶标发现研究，能够反映出小分子与靶标在真实的细胞等生理环境中实际发生的结合构象。

[0006]本发明不仅可以获得真实生物体系内小分子的结合靶标谱，还能获得小分子与靶标的结合或诱导的变构位点的信息，是阐述药物及内源性代谢物等活性分子对细胞调控机制的分子基础。

[0007]技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0008]第一方面，提供一种基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法，所述的小分子靶标筛选方法基于靶点响应性可及性变化谱技术(TRAP)，包括：
[0009](1)共价标记：在包含目标小分子作用靶标的生物样本中，利用化学标记试剂共价修饰生物样本蛋白中特定活性氨基酸；
[0010](2)在终止标记过程后，利用定量蛋白质组学技术获得定量结果数据，比较生物样本在缺乏以及存在孵育小分子配体时其中全蛋白组水平各活性氨基酸被修饰的丰度的变化，以此表征蛋白位点的可及性变化；根据变化的倍数及显著性筛选孵育小分子配体导致生物样本中蛋白化学可及性显著变化的位点，将所述位点作为候选靶标及小分子配体与靶标的潜在结合和诱导变构的位点。

[0011]所述的活性氨基酸指具有化学活性基团的氨基酸，包含但不限于赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等。

[0012]用于标记活性赖氨酸的化学标记试剂为氟苯基酯、N‑羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、磺化NHS、丙烯酸磺酰酯、异氰酸酯、硫代异氰酸酯、酰亚胺酯、琥珀酸酐、醋酸酐、马来酸酐、2‑乙酰苯基硼酸、磺酰卤、环氧化物、氟苯、吲哚及吲哚衍生物、酰基叠氮化物中的一种，或为醛基化合物与还原剂的组合；所述醛基化合物包括甲醛、乙醛、丙醛；还原剂包括硼烷‑吡啶络合物(BPC)、硼氢化钠、二甲胺硼烷(DMAB)。

[0013]优选的，在一些实施例中，用于标记活性赖氨酸的标记试剂包括但不限于本发明实施例使用的甲醛和硼烷‑吡啶络合物(BPC)，为了区分内源性甲基化修饰，在生物体系中采用氘代甲醛进行标记；在重组蛋白体系，对于0.1mg/mL的纯蛋白溶液采用终浓度为1‑5mM 的氘代甲醛和0.5‑3mM的BPC，而在复杂的生物样本体系，对于3mg/mL的细胞裂解液采用终浓度为5‑15mM的氘代甲醛和2‑8mM浓度的BPC进行标记，但不局限于该比例。

[0014]针对活性氨基酸进行标记反应的试剂可以采用除了甲醛和BPC的其他共价标记试剂，例如活性酯类包括氟苯基酯、N‑羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、磺化NHS、丙烯酸磺酰酯、异氰
酸酯、硫代异氰酸酯、酰亚胺酯，酸酐类包括琥珀酸酐、醋酸酐、马来酸酐，其他类型化学试剂包括2‑乙酰苯基硼酸、磺酰卤、环氧化物、氟苯、吲哚及吲哚衍生物、酰基叠氮化物等。

[0015]对蛋白进行共价标记后，采用的定量蛋白质组学流程的方案灵活，所述的定量蛋白质组学技术采用非标定量法或多通道标记定量法，多通道标记定量法包括串联质谱标签TMT定量蛋白组学、相对及绝对定量等重标签iTRAQ定量蛋白组学。

[0016]第二方面，提供所述的小分子靶标筛选方法在筛选小分子靶标中的应用。

本发明建立了基于定量蛋白质组学结果筛选与小分子配体结合后化学可及性发生显著变化的靶蛋白及位点，能够广泛的应用于从细胞、菌液、组织裂解液中寻找活性小分子靶标的应用。

[0017]在一些实施例中，所述应用包括：
[0018](1)通过蛋白鉴定及定量分析软件，根据研究的物种选择Uniprot数据库中与待测生物体系对应种属的蛋白组，设定酶解所用的蛋白酶类别(如胰蛋白酶、糜蛋白酶)，设定翻译后修饰设置为脲甲基化(半胱氨酸位点,固定)、氧化(甲硫氨酸位点,可变)、氘代二甲基化(赖氨酸位点,可变)、氘代甲基化(赖氨酸位点,可变)，一级质谱(MS)及二级质谱(MS/MS)的质量误差范围需要根据仪器的分辨率及灵敏度设定；
[0019](2)利用蛋白鉴定定量软件对孵育前后含有赖氨酸的肽段被标记试剂标记的比例变化进行分析得到比例变化TRAP Ratio值，并对定量结果进行统计学分析得到统计学分析结果：对通过非标定量法获得的定量结果采用双尾学生t检验统计分析计算p值；对多通道标记定量结果，使用Benjamini&Hochberg法计算q值；
[0020](3)从生物体系中根据比例变化TRAP Ratio值及统计学分析结果(p值或者q值)筛选小分子靶标，筛选标准的设置根据小分子与靶标的亲和力强弱进行调整。

[0021]进一步的，筛选标准的设置为：例如，针对活性代谢物及天然产物这些弱结合配体，结合及变构位点筛选标准为非标定量结果所得的肽段可及性变化TRAP Ratio>1.5倍，并且t检验所得p值<0.05(实例1、实例2)；多通道标记定量结果的肽段可及性变化TRAP Ratio>1.5倍，所得q值<0.03(实例5)；针对与靶标存在强亲和力的小分子药物，对结合及变构位点的筛选标准为肽段可及性变化TRAP Ratio值>2倍，并且t检验分析所得p值<0.01(实例3)；多通道标记定量结果的肽段可及性变化TRAP Ratio>2倍，所得q值<0.01(实例4) [0022]在一些实施例中，所述应用还包括：(4)对TRAP分析的结果设置TRAP score打分体
系，score＝Abs[Log
2(Ratio)*Log
10
(p值/q值)]，每个蛋白选择TRAP score打分最高的肽段
作为代表，根据(2)结果绘制小分子结合靶标谱的火山图，基于参考文献及已有晶体结构解析TRAP获得的小分子与靶标的结合位点及诱导的结构变化。

[0023]在一些实施例中，所述方法包括以下步骤：
[0024](1)考察蛋白水平活性氨基酸被共价标记的效率，确定活性赖氨酸作为标记对象，考察多种赖氨酸标记体系，选择并优化用于标记蛋白中高反应活性氨基酸残基的试剂，比较标记反应试剂对蛋白的高级结构及活性无显著影响后，选取能够在组学水平特异性修饰赖氨酸，高效反应生成还原烷基化修饰的氘代甲醛作为化学探针。

该标记反应产生的还原烷基化修饰不改变赖氨酸残基的带电状态，几乎不会引入人为的蛋白质构象变化和蛋白‑蛋白相互作用。

基于此标记手段，建立TRAP流程，即将小分子配体与含有靶标的蛋白组样品孵育后，用氘代甲醛和BPC试剂标记蛋白中活性赖氨酸，加入过量碳酸氢铵终止标记反应，通过超滤或蛋白沉淀法去除多余标记试剂。

[0025](2)使用尿素将蛋白变性，依次进行二硫键还原、巯基烷基化保护、酶解等蛋白组学分析的处理步骤，采用非标定量法或多通道标记定量技术，将除盐后的样品通过纳升液相‑质谱仪检测，分别对与配体和与溶剂对照孵育的蛋白组样本中赖氨酸的化学标记产生的修饰肽段的丰度变化进行定量分析。

[0026](3)质谱检测：对于采用非标定量的样品，利用纳升液相色谱质谱联用仪的数据依赖采集模式采集数据。

对于多通道标记定量的样品，先在高pH流动相条件下采用高效液相色谱分离样品，将样品分成多个组分并接收，除盐后经纳升液相色谱‑高分辨质谱液质系统分离后，基于三级串联质谱定量(MS3)模式采集数据。

[0027](4)将数据导入蛋白鉴定定量软件后，基于Uniprot数据库选择对应种属蛋白组，设定酶解所用蛋白酶类别，设置允许存在的翻译后修饰，再基于定量分析模块，对孵育前后含有赖氨酸的肽段被探针标记的比例变化(TRAP Ratio)进行统计分析，综合TRAP Ratio变化以及组间显著性差异筛选可及性变化明显的肽段及所属蛋白即为小分子靶标。

[0028]在本发明所述的基于化学蛋白质组学的小分子靶标发现技术TRAP，可运用在真实的生物体系中，将细胞器分隔、大分子拥挤、辅因子浓度变化、靶蛋白互作蛋白等因素考虑在内，寻找真实环境中小分子结合靶标，并能提示小分子调控靶标功能的结合构象信息，不受到靶标是否具有已知晶体结构的限制。

此外，在运用本发明所述的TRAP技术进行靶标发现研究，还能够在活细胞体系孵育小分子配体后进行细胞裂解、化学标记和定量蛋白质组学处理的TRAP流程，能够发现在活细胞水平的小分子靶标，并能够发现受直接靶标调控的下游通路蛋白，通过对小分子靶标谱进行通路富集可明确其在真实细胞、组织等复杂生物体系中调控功能蛋白的作用机制。

[0029]有益效果：利用TRAP技术进行小分子靶标发现研究，不需要对目标小分子进行结构修饰，即能够实现在复杂的生物体系内发现小分子配体的结合靶标，明确其大致结合位点及诱导变构的相互作用的构象；能通过表征化学可及性变化的TRAP Ratio及其变化的显著性，成功区分不同配体与其靶标蛋白结合的亲和力差异，以及评价不同浓度的配体对靶标蛋白的可及性变化的影响程度；兼容于复杂的生物体系，不受细胞种类和物种的限制；能够根据实验需求，联合非标定量及TMT等多通道定量试剂实现对多个剂量的配体或是对多个配体的靶标进行发现研究。

应用TRAP技术，通过非标定量和TMT定量试剂，实现了在HCT116、A549细胞及大肠杆菌E.coli裂解液中发现II型丙酮酸激酶(PKM2)的激活剂TEPP‑46的结合靶标；联合TMT多通道定量技术在HepG2活细胞中描绘了天然活性分子水飞蓟宾的靶标。

[0030]本发明基于化学蛋白质组学的小分子靶标筛选方法及其应用，具有以下优点：[0031](1)不需要复杂、耗时的针对配体合成衍生化探针，利用共价标记反应探测小分子靶标活性氨基酸的可及性变化，结合定量蛋白质组学流程即能够快速高效的发现小分子靶标；
[0032](2)适用于多种复杂的生物体系，包括但不限于本发明示例的多种样本如细胞裂解液、菌液、活细胞；
[0033](3)针对配体结合诱导靶标产生显著的可及性变化进行靶标筛选，能够获得小分子与靶标的结合域和/或结合诱导的变构区域的结构信息；
[0034](4)根据小分子配体与靶标结合诱导的可及性变化，能够提示不同小分子配体与
靶标结合亲和力的差异；通过分析梯度剂量的小分子诱导的靶标可及性变化曲线，能够定量区分不同剂量的小分子配体与靶标的结合亲和力差异；
[0035](5)针对小分子与靶标由于相互作用导致对化学标记试剂产生位阻筛选靶标，适用于与小分子存在弱结合的靶蛋白，避免了DARTS、CETSA等靶标发现技术要求小分子与靶标结合后水解稳定性、热稳定性等发生显著变化而导致的假阴性结果。

附图说明
[0036]图1：TRAP技术表征工具蛋白核糖核酸酶A与配体CDP/CTP的结合位点，并能通过可及性变化的差异倍数TRAP Ratio区分小分子配体与靶标结合的亲和力差异；
[0037]图2：TRAP技术明确重组蛋白PKM2与配体1,6‑二磷酸果糖(FBP)的结合位点；[0038]图3：复杂的细胞环境中应用TRAP技术筛选小分子激活剂TEPP‑46靶标PKM2；[0039]图4：应用高通量TRAP靶标发现流程在HCT116细胞中发现TEPP‑46结合靶标PKM2；[0040]图5：应用高通量TRAP靶标发现流程在HepG2细胞中揭示天然活性分子水飞蓟宾的潜在靶标。

具体实施方式
[0041]下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

若无特别说明，本发明所述的实验方法，均为常规方法；所述的化学试剂，均可从商业途径获得。

[0042]实施例1：优化和建立纯蛋白水平的共价标记方法，利用TRAP技术确证基于共价标记试剂的化学可及性变化，能够识别小分子通过非共价亲和力结合的靶标的区域，并能成功区分不同配体与其标结合亲和力的差异。

[0043](1)纯蛋白水平标记方法的建立：
[0044]以核糖核酸酶A为工具蛋白，在100μL体系中将100μM的核糖核酸酶A分别与空白溶剂、1mM小分子配体5‑胞苷二磷酸(CDP)、1mM小分子配体5‑胞苷三磷酸(CTP)室温孵育1小时，加入1μL 4％氘代甲醛和60μL 10mM硼烷‑吡啶络合物(BPC)对蛋白中溶剂可及性赖氨酸进行标记，室温标记30分钟后加入碳酸氢铵至终浓度50mM，终止反应20分钟，采用10kDa超滤柱利用高速离心机14,000g离心15分钟去除多余的标记试剂，溶剂中添加10M尿素至终浓度大于6M变性蛋白，加入二硫苏糖醇(DTT)至10mM于56℃反应30分钟后，冷却至室温，立即加入碘乙酰胺(IAA)至浓度40mM，避光反应30分钟后，补加入等量DTT溶液中和多余IAA，按
为照质量比1:25添加糜蛋白酶，在25℃酶解过夜后，加入0.1％甲酸终止反应。

最后使用C
18
填充材料的ZipTip柱对样品除盐、挥干、复溶，采用纳升液相‑四级杆串连飞行时间质谱仪的数据依赖采集(DDA)模式分析肽段的氘代二甲基化修饰水平在配体孵育前后的变化。

[0045](2)小分子配体与靶标的结合口袋及亲和力分析：
[0046]将数据导入蛋白组学数据分析软件PEAKS，选择Uniprot中牛种属核糖核酸酶A数据库，设定酶解所用蛋白酶类别为糜蛋白酶，翻译后修饰设置为脲甲基化(半胱氨酸位点,固定)，氧化(甲硫氨酸位点,可变)，氘代二甲基化(赖氨酸位点,可变)，氘代单甲基化(赖氨酸位点,可变)，采集的数据一级误差范围设为20ppm，二级误差范围为0.1Da，在定量模块，选择非标定量法对孵育前后赖氨酸标记肽段丰度变化进行定量得到可及性变化值TRAP。