大菱鲆胆汁和血浆中的胆汁酸轮廓分析

动物营养学报２０２０，３２（１２）：５８１６⁃５８２６ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ
㊀
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０２０．１２．０３５
大菱鲆胆汁和血浆中的胆汁酸轮廓分析
姚㊀婷１，２㊀韦㊀娴３㊀薛㊀敏３㊀孙宝忠１㊀谷㊀旭３∗㊀张松山１∗
（１．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１０００３２；２．北京市饲料监察所，北京１０００６１；３．中国农业科学院
饲料研究所，农业农村部动物产品质量安全饲料源性因子风险评估实验室，北京１０００８１）
摘㊀要：本试验旨在解析大菱鲆胆汁和血浆中的胆汁酸谱，明确２种组织中胆汁酸种类和含量，为鱼类胆汁酸相关研究提供技术支撑和数据依据㊂研究利用超高效液相色谱－串联质谱技术，配合内标校正，建立了鱼胆汁和血浆中３０种胆汁酸的定性定量方法，并对大菱鲆胆汁和血浆进行了胆汁酸谱分析㊂该方法灵敏度㊁准确度和精密度均能够满足生物样品中胆汁酸的分析要求㊂结果表明：在大菱鲆胆汁中检测到６种初级胆汁酸和４种次级胆汁酸，其中初级胆汁酸种类按其含量高低排列分别为牛磺胆酸（ＴＣＡ）㊁牛磺鹅去氧胆酸（ＴＣＤＣＡ）㊁胆酸（ＣＡ）㊁甘氨鹅脱氧胆酸（ＧＣＤＣＡ）㊁甘氨胆酸（ＧＣＡ）和鹅去氧胆酸（ＣＤＣＡ），次级胆汁酸按其含量高低排列分别为牛磺β鼠胆酸（ＴβＭＣＡ）㊁牛磺ω鼠胆酸（ＴωＭＣＡ）㊁葡糖石胆酸（ＧＬＣＡ）和甘氨鹅胆酸（ＧＨＣＡ）㊂在大菱鲆血浆中检测到较低含量的５种初级胆汁酸和３种次级胆汁酸㊂其中初级胆汁酸的种类有ＣＡ㊁ＣＤＣＡ㊁ＧＣＤＣＡ㊁ＴＣＡ㊁ＴＣＤＣＡ，次级胆汁酸为鼠胆酸（ωＭＣＡ）和ＴωＭＣＡ㊂本研究首次在鱼体内发现了ωＭＣＡ的存在，并为其他鱼类胆汁酸轮廓鉴定分析提供了参考方法，丰富了鱼类胆汁酸谱库，为后续利用胆汁酸进行相关研究提供数据依据㊂关键词：胆汁酸；胆汁；血浆；大菱鲆；超高效液相色谱－串联质谱
中图分类号：Ｓ９６３㊀㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０２０）１２⁃５８１６⁃１１收稿日期：２０２０－０５－２７
基金项目：蓝色粮仓科技创新重点专项（２０１８ＹＦＤ０９００４００，２０１９ＹＦＤ０９００２０）
作者简介：姚㊀婷（１９９０ ），女，山西洪洞人，中级畜牧师，博士研究生，从事农产品质量安全研究㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙａｏｔｉｎｇ０５１５＠１２６．ｃｏｍ∗通信作者：谷㊀旭，副研究员，硕士生导师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｇｕｘｕ＠ｃａａｓ．ｃｎ；张松山，助理研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｓｏｎｇｓｈａｎ１９９７＠１６３．ｃｏｍ
㊀㊀胆汁酸（ｂｉｌｅａｃｉｄｓ，ＢＡｓ）是胆汁的主要成分，是胆固醇在肝脏中经一系列的酶促反应㊁新陈代谢过程后合成的具有两性分子结构的化合物［１］㊂胆汁酸的亲脂性质对营养物质的消化吸收代谢，尤其是糖脂代谢有着重要意义㊂此外，近年来的相关研究表明，在机体的生命活动中，胆汁酸可以激活对机体生命活动有重要作用的法尼醇Ｘ受体（ＦＸＲ）㊁Ｇ蛋白偶联ＢＡ受体１（ＧＰＢＡＲ１）和维生素Ｄ受体（ＶＤＲ），从而在糖脂类代谢㊁能量代谢㊁免疫调节和稳态调节方面发挥着重要作用［２－９］㊂㊀㊀作为调节机体糖脂代谢的重要物质，在鱼类尤其是肉食性鱼类养殖业中，胆汁酸常被用作保肝护肝产品㊂有研究报道发现，胆汁酸可显著降低乌鳢血清低密度脂蛋白胆固醇（ＬＤＬ⁃Ｃ）含量，从而改善糖脂代谢［１０］；０．１５ｇ／ｋｇ的胆汁酸可以促
进罗非鱼对脂质的消化吸收，从而调节脂代谢［１１］；在针对草鱼的研究中也发现，适量的胆汁酸能提高草鱼生长性能，促进其脂肪代谢，降低机体脂肪沉积，改善其肌肉品质［１２］㊂作者所在研究团队的研究结果也发现，肉食性鱼类大口黑鲈饲喂商业化配合饲料（淀粉含量１２％）后，大口黑鲈肝脏会出现胆汁淤积症状，而在饲料中添加胆汁酸（１．５ｇ／ｋｇ）后，大口黑鲈肝脏状态得到显著改善［１３］㊂目前哺乳动物（人㊁鼠和猪）胆汁酸的研究已经较为深入，但只有少部分文献报道鱼类胆汁酸组成及相关研究㊂张晶等［１４］对草鱼胆汁酸进行分析，发现草鱼胆汁酸以胆酸（ＣＡ）和鹅去氧胆酸（ＣＤＣＡ）为主，还含有少量脱氧胆酸（ＤＣＡ），并且草鱼的肥满度与ＣＡ㊁ＣＤＣＡ的含量呈负相关㊂在其他水产动物的研究报道中发现了石胆酸
１２期姚㊀婷等：大菱鲆胆汁和血浆中的胆汁酸轮廓分析
（ＬＣＡ）㊁ＤＣＡ的存在［１５］㊂由于缺乏对鱼类胆汁酸谱的系统研究，目前市面上鱼用的胆汁酸产品一般由猪胆汁制成，由于不同物种间胆汁酸存在很大差异，所以这些胆汁酸产品的效果不一㊂因此，对养殖鱼类进行全面系统的胆汁酸轮廓分析，明确鱼类胆汁酸的种类㊁含量是十分有必要的㊂
㊀㊀目前胆汁酸轮廓分析主要的方法包括酶联免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）法㊁薄层色谱（ＴＬＣ）法㊁高效液相色谱（ＨＰＬＣ）法㊁气质联用（ＧＣ⁃ＭＳ）法以及液质联用（ＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ）法，Ｄｕｔｔａ等［１６］详细阐述了不同检测方法的优劣，其中ＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ法能够满足复杂样品中多种胆汁酸的同时定性定量分析，已成为研究胆汁酸谱的普遍公认的最可靠方法㊂
㊀㊀大菱鲆（ＳｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓｍａｘｉｍｕｓＬ．）肉质鲜美㊁营养价值高，是典型的肉食性鱼类，也是我国重要的海水养殖品种之一㊂但在养殖中其深受营养性脂肪肝病的困扰㊂因此研究人员尝试使用胆汁酸对大菱鲆进行糖脂代谢调节，达到保肝护肝的目的㊂在先前的研究报道中发现，添加胆汁酸后，大菱鲆幼鱼血清中谷丙转氨酶㊁谷草转氨酶及碱性磷酸酶活性显著提高，总蛋白及白蛋白的含量显著升高，而血浆中甘油三酯㊁总胆固醇及高㊁低密度脂蛋白胆固醇含量显著下降，均表明胆汁酸可以起到保护大菱鲆肝脏健康㊁降低营养性肝病发生率的作用［１７］㊂基于此，本文以大菱鲆为研究对象，利用ＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ法建立胆汁和血浆中胆汁酸的分析方法，对大菱鲆体内胆汁酸谱进行轮廓分析研究，明确胆汁酸的种类和含量，为利用胆汁酸进行糖脂代谢特定调节提供基础㊂本研究结果也将为丰富鱼类胆汁酸谱库提供数据，为分析肉食性鱼类糖脂代谢及营养性肝病的发生发展及利用特定胆汁酸进行精准防治㊁保肝护肝提供依据㊂１㊀材料与方法
１．１㊀试验材料
１．１．１㊀试剂与耗材
㊀㊀３０种非结合型和结合型胆汁酸标准品：ＣＡ㊁α－鼠胆酸（αＭＣＡ）㊁β－鼠胆酸（βＭＣＡ）㊁ω－鼠胆酸（ωＭＣＡ）㊁猪胆酸（ＨＣＡ）㊁ＭｕｒｃｏＣＡ㊁ＣＤＣＡ㊁ＤＣＡ㊁熊去氧胆酸（ＵＤＣＡ）㊁猪去氧胆酸（ＨＤ⁃ＣＡ）㊁７，１２－二酮石胆酸（７，１２ＫＬＣＡ）㊁石胆酸（ＬＣＡ）㊁甘氨胆酸（ＧＣＡ）㊁甘氨鹅胆酸（ＧＨＣＡ）㊁甘氨鹅脱氧胆酸（ＧＣＤＣＡ）㊁甘氨脱氧胆酸（ＧＤ⁃ＣＡ）㊁甘氨熊去氧胆酸（ＧＵＤＣＡ）㊁葡糖石胆酸（ＧＬＣＡ）㊁甘氨脱氢胆酸（ＧＤＨＣＡ）㊁牛磺胆酸（ＴＣＡ）㊁牛磺α－鼠胆酸（ＴαＭＣＡ）㊁牛磺β－鼠胆酸（ＴβＭＣＡ）㊁牛磺ω－鼠胆酸（ＴωＭＣＡ）㊁牛磺猪胆酸（ＴＨＣＡ）㊁牛磺鹅去氧胆酸（ＴＣＤＣＡ）㊁牛磺脱氧胆酸（ＴＤＣＡ）㊁牛磺熊去氧胆酸（ＴＵＤＣＡ）㊁牛磺猪去氧胆酸（ＴＨＤＣＡ）㊁牛磺石胆酸（ＴＬＣＡ）和牛磺脱氢胆酸（ＴＤＨＣＡ）均购买于美国Ｉｓｏ⁃Ｓｃｉｅｎｃｅｓ公司；氘代胆汁酸对照品胆酸－ｄ４（ＣＡ⁃ｄ４）㊁鹅脱氧胆酸－ｄ４（ＣＤＣＡ⁃ｄ４）㊁石胆酸－ｄ４（ＬＣＡ⁃ｄ４）和甘氨胆酸（ＧＣＡ⁃ｄ４）均购于美国Ｓｔｅｒ⁃ａｌｏｉｄｓ公司；牛磺胆酸钠盐－ｄ５（ＴＣＡ⁃ｄ５）㊁牛磺－β－鼠胆酸钠盐－ｄ５（ＴβＭＣＡ⁃ｄ５）和牛磺熊脱氧胆酸－ｄ５（ＴＵＤＣＡ⁃ｄ５）均购自加拿大ＴｏｒｏｎｔｏＲｅ⁃ｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ公司；β－鼠胆酸－ｄ５（βＭＣＡ⁃ｄ５）购买于美国ＩｓｏＳｃｉｅｎｃｅｓ公司；脱氧胆酸－ｄ４（ＤＣＡ⁃ｄ４）㊁甘氨石胆酸－ｄ４（ＧＬＣＡ⁃ｄ４）㊁甘氨熊脱氧胆酸－ｄ４（ＧＵＤＣＡ⁃ｄ４）㊁牛磺脱氧胆酸钠盐－ｄ４（ＴＤＣＡ⁃ｄ４）㊁甘氨鹅脱氧胆酸－ｄ４（ＧＣＤＣＡ⁃ｄ４）㊁甘氨脱氧胆酸－ｄ４（ＧＤＣＡ⁃ｄ４）和熊脱氧胆酸－ｄ４（ＵＤＣＡ⁃ｄ４）均购于美国剑桥同位素实验室公司；ＳＰＥ柱购于美国ＧｒａｃｅＤａｖｉｓｏｎＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ公司（ＧｒａｃｅＰｕｒｅＴＭＣ１８⁃Ａｑ５００ｍｇ／３ｍＬ）；甲醇㊁乙腈等有机试剂均为ＵＰＬＣ级，购于美国Ｍｅｒｃｋ公司㊂１．１．２㊀仪器
㊀㊀安捷伦超高效液相色谱仪（１２９０ＩｎｆｉｎｉｔｙⅡ）㊁安捷伦串联四极杆质谱联用仪（６４７０ＡＱＱＱ）㊁Ｅｐ⁃ｐｅｎｄｏｒｆ高速冷冻离心机（５４３０Ｒ）㊂
１．２㊀样品采集和处理
㊀㊀试验用６条大菱鲆购自青岛市亿海丰水产有限公司，初始体重为（７．４１ʃ０．０２）ｇ㊂鱼苗首先使用商业化配合饲料饲养２周，饲料组成及营养水平见表１㊂之后采用表１所示的饲料饲养７０ｄ（表观饱食投喂），养殖系统为室内流水养殖系统，水源为地下海水㊂大菱鲆首先饥饿４８ｈ，之后复食，复食２４ｈ后进行取样㊂取样时６条大菱鲆的平均体重为（２７．１４ʃ０．２６）ｇ㊂大菱鲆鱼体经消毒后静脉取血，无菌剥离胆囊组织，样品于－８０ħ冷冻保存㊂１．３㊀标准溶液及定量标准曲线的配制
㊀㊀所有胆汁酸标准品和相关同位素标准品均配制成浓度为１ｍｇ／ｍＬ的单标准品储备液㊂取所有胆汁酸标准品储备液，混合，使用５０％甲醇水溶液（Ｖ甲醇／Ｖ水＝５０ʒ５０）稀释得到浓度为１０μｇ／ｍＬ的
７１８５
㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３２卷
混合标准品工作液㊂在此基础上，对混合工作液（１０μｇ／ｍＬ）进行梯度稀释，得到浓度为０．００２ １０．０００μｇ／ｍＬ的混合标准品溶液㊂将以上梯度稀释的胆汁酸标准溶液与同位素内标溶液等体积混合，得到最终浓度在０．００１ ５．０００μｇ／ｍＬ的定量校正标准曲线㊂
表１㊀饲料组成及营养水平（干物质基础）
Ｔａｂｌｅ１㊀Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓｏｆ
ｔｈｅｄｉｅｔ（ＤＭｂａｓｉｓ）％项目Ｉｔｅｍｓ含量Ｃｏｎｔｅｎｔ原料Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ
酪蛋白Ｃａｓｅｉｎ３２．００
明胶Ｇｅｌａｔｉｏｎ８．００
晶体氨基酸Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅａｍｉｎｏａｃｉｄ１０．３４
鱼油Ｆｉｓｈｏｉｌ１０．００
大豆卵磷脂Ｓｏｙｂｅａｎｌｅｃｉｔｈｉｎ２．５０
氯化胆碱Ｃｈｏｌｉｎｅｃｈｌｏｒｉｄｅ０．５０
糊精Ｄｅｘｔｒｉｎ２７．９１
维生素预混料Ｖｉｔａｍｉｎｐｒｅｍｉｘ１）２．００
矿物质预混料Ｍｉｎｅｒａｌｐｒｅｍｉｘ２）１．００
磷酸二氢钙Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２２．５０
丙酸钙Ｃａ（Ｃ３Ｈ５Ｏ２）２０．１０
三氧化二钇Ｙ２Ｏ３０．１０
乙氧基喹啉Ｃ１４Ｈ１９ＮＯ０．０５
蛋氨酸Ｍｅｔ０．５０
谷氨酸Ｇｌｕ１．５０
复合诱食剂Ｃｏｍｐｏｕｎｄａｔｔｒａｃｔａｎｔ１．００
合计Ｔｏｔａｌ１００．００
营养水平Ｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓ３）
粗蛋白质Ｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅｉｎ５２．２５
粗脂肪Ｃｒｕｄｅｆａｔ１１．１１
粗灰分Ａｓｈ３．０７
㊀㊀１）维生素预混料为每千克饲料提供Ｔｈｅｖｉｔａｍｉｎｐｒｅｍｉｘｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｐｅｒｋｇｏｆｔｈｅｄｉｅｔ：ＶＢ１２５ｍｇ，ＶＢ２４５ｍｇ，ＶＢ６２０ｍｇ，ＶＢ１２１０ｍｇ，ＶＫ３１０ｍｇ，肌醇ｉｎｏｓｉ⁃ｔｏｌ８００ｍｇ，泛酸ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃａｃｉｄ６０ｍｇ，烟酸ｎｉｃｏｔｉｎｉｃａｃｉｄ２００ｍｇ，叶酸ｆｏｌｉｃａｃｉｄ２０ｍｇ，生物素ｂｉｏｔｉｎ６０ｍｇ，ＶＡ３２ｍｇ，ＶＤ５ｍｇ，ＶＥ２４０ｍｇ，ＶＣ２０００ｍｇ，微晶纤维素ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅ１６４７３ｍｇ㊂
㊀㊀２）矿物质预混料为每千克饲料提供Ｔｈｅｍｉｎｅｒａｌｐｒｅｍｉｘｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｐｅｒｋｇｏｆｔｈｅｄｉｅｔ：ＣｏＣｌ２５０ｍｇ，ＣｕＳＯ４㊃５Ｈ２Ｏ１０ｍｇ，ＦｅＳＯ４㊃Ｈ２Ｏ８０ｍｇ，ＺｎＳＯ４㊃Ｈ２Ｏ５０ｍｇ，ＭｎＳＯ４㊃Ｈ２Ｏ４５ｍｇ，ＭｇＳＯ４㊃７Ｈ２Ｏ１２００ｍｇ，Ｈ２ＮａＯＳｅ２０ｍｇ，Ｈ２ＣａＩＯ４，６０ｍｇ，沸石粉ｚｅｏｌｉｔｅｐｏｗｄｅｒ８４８５ｍｇ㊂
㊀㊀３）营养水平为实测值㊂Ｎｕｔｒｉｅｎｔｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｖａｌｕｅｓ．１．４㊀胆汁酸的测定
１．４．１㊀样品前处理
㊀㊀胆汁和血浆样品的处理参考Ｇｕ等［１８］方法进行㊂
㊀㊀胆汁样品：胆囊组织经冰水浴解冻后，取５μＬ混匀的胆汁样本，加入１９９５μＬ８０％甲醇水溶液
（Ｖ甲醇／Ｖ水＝８０ʒ２０），涡旋振荡１ｍｉｎ，－２０ħ静置３０ｍｉｎ后离心１５ｍｉｎ（转速１６０００ｒ／ｍｉｎ，４ħ）㊂取４０μＬ上清液，加２０μＬ５０％甲醇水溶液（Ｖ甲醇／Ｖ水＝５０ʒ５０，含２５０ｎｇ／ｍＬ混合胆汁酸同位
素内标），加４０μＬ２０％甲醇水溶液（Ｖ
甲醇
／Ｖ
水
＝２０ʒ８０），涡旋混匀，待后续ＵＰＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ分析㊂㊀㊀血浆样品：冰水浴解冻，涡旋混匀后经固相萃取柱处理㊂固相萃取过程：取Ｃ１８⁃ＡｑＳＰＥ柱，经２μＬ甲醇活化和２μＬ２％乙腈水溶液（Ｖ
乙腈
／Ｖ
水
＝２ʒ９８）平衡；取１００μＬ解冻血清样本，加１μＬ混合胆汁酸同位素内标（１ｎｇ／ｍＬ）混合，缓慢上样到ＳＰＥ小柱；加２μＬ去离子水清洗ＳＰＥ小柱，２μＬ甲醇洗脱目标物，收集洗脱液；氮气干燥洗脱液，
干燥样本复溶于２０μＬ５０％甲醇水溶液（Ｖ
乙腈
／Ｖ
水
＝５０ʒ５０）；离心１５ｍｉｎ（转速１６０００ｒ／ｍｉｎ，４ħ），上清液用ＵＰＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ分析㊂１．４．２㊀仪器条件
１．４．２．１㊀色谱条件
㊀㊀色谱柱为Ｗａｔｅｒｓ公司ＵＰＬＣＢＥＨＣ１８色谱柱（２．１ｍｍˑ１００ｍｍ，１．７μｍ）㊂采用线性梯度洗脱模式进行色谱分离，流速为０．４５ｍＬ／ｍｉｎ㊂柱温为４０ħ㊂流动相组成为：Ａ相为０．１％甲酸水溶液，Ｂ相为０．１％甲酸乙腈㊂液相色谱洗脱条件如表２所示㊂
１．４．２．２㊀质谱条件
㊀㊀采用电喷雾离子源（ＥＳＩ）负离子模式对经色谱分离的胆汁酸进行离子化㊂
㊀㊀质谱参数：干燥气温度为３００ħ；干燥气流速为５Ｌ／ｍｉｎ；雾化器压力为４５ｐｓｉ；鞘气温度为３００ħ；鞘气流速为１１Ｌ／ｍｉｎ，毛细管电压为４０００Ｖ㊂
㊀㊀采用动态多反应监测（ｄＭＲＭ）模式进行定性定量检测，每个扫描周期时间设定为３００ｍｓ㊂
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１２期姚㊀婷等：大菱鲆胆汁和血浆中的胆汁酸轮廓分析表２㊀液相色谱洗脱条件
Ｔａｂｌｅ２㊀Ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ｅｌｕｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ㊀％
时间
Ｔｉｍｅ／ｍｉｎ
流动相Ａ
ＭｏｖｉｎｇｐｈａｓｅＡ
流动相Ｂ
ＭｏｖｉｎｇｐｈａｓｅＢ
０．００８５１５０．５０８５１５１．００７５２５５．００６６３４８．００６０４０９．００４８５２１０．２０４２５８１０．２１０１００１１．２００１００１１．２１８５１５１２．５０８５１５１．５㊀数据分析
㊀㊀ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ软件（版本Ｂ．０８．００）用于控制仪器和采集数据㊂使用ＳＰＳＳ２０软件对相关数据进行描述性统计学分析，以平均值ʃ标准差的形式进行结果显示㊂
２㊀结㊀果
２．１㊀检测方法的验证
㊀㊀根据１．４中的仪器条件建立的胆汁酸检测方法进行分析时，标准品和相应胆汁㊁血浆样品的提取离子流图如图１所示，各胆汁酸出峰时间不干扰，没有杂质峰干扰目标物质，分析时间短，在１２．５ｍｉｎ内就可以完成３０种胆汁酸的分离分析㊂相关方法学参数及指标如表３所示，各待测胆汁酸在０．００２５ ５．００００μｇ／ｍＬ内线性良好（Ｒ２＞０．９９），满足胆汁和血浆样本中胆汁酸的准确定量测定㊂
㊀㊀Ｃｏｕｎｔｓｖｓ．ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ：计数与采集时间；ωＭＣＡ：ω－鼠胆酸ｏｍｅｇａ⁃ｍｕｒｉｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＣＡ：胆酸ｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；βＭＣＡ：β－鼠胆酸ｂｅｔａ⁃ｍｕｒｉｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；αＭＣＡ：α－鼠胆酸ａｌｐｈａ⁃ｍｕｒｉｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＨＣＡ：猪胆酸ｈｙｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＣＤＣＡ：鹅去氧胆酸ｃｈｅｎｏｄｅ⁃ｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＤＣＡ：脱氧胆酸ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ：熊去氧胆酸ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＨＤＣＡ：猪去氧胆酸ｈｙｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌ⁃ｉｃａｃｉｄ；ＭｕｒｏＣＡ：鼠胆酸ｍｕｒｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；７，１２ＫＬＣＡ：７．１２－二酮石胆酸７，１２⁃ｋｅｔｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＬＣＡ：石胆酸ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＧＣＡ：甘氨胆酸ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＧＨＣＡ：甘氨鹅胆酸ｇｌｙｃｏｓｙｌｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＧＣＤＣＡ：甘氨鹅脱氧胆酸ｇｌｙｃｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙ⁃ｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＧＤＣＡ：甘氨脱氧胆酸ｇｌｙｃｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＧＵＤＣＡ：甘氨熊去氧胆酸ｇｌｙｃｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＧＬＣＡ：葡糖石胆酸ｇｌｙｃｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＧＤＨＣＡ：甘氨脱氢胆酸ｇｌｙｃｏｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴＣＡ：牛磺胆酸ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴαＭＣＡ：牛磺α－鼠胆酸ｔａｕｒｏ⁃ａｌｐｈａ⁃ｍｕｒｉｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴβＭＣＡ：牛磺β－鼠胆酸ｔａｕｒｏ⁃ｂｅｔａ⁃ｍｕｒｉｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴωＭＣＡ：牛磺ω－鼠胆酸ｔａｕｒｏ⁃ｏｍｅｇａ⁃ｍｕｒｉｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴＨＣＡ：牛磺猪胆酸ｔａｕｒｏｈｙｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴＣＤＣＡ：牛磺鹅去氧胆酸ｔａｕｒｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴＤＣＡ：牛磺脱氢胆酸ｔａｕｒｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴＵＤＣＡ：牛磺熊去氧胆酸ｔａｕｒｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴＨＤＣＡ：牛磺猪去氧胆酸ｔａｕｒｏｈｙｏｄｅｏｘｙ⁃ｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴＬＣＡ：牛磺石胆酸ｔａｕｒｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴＤＨＣＡ：牛磺脱氢胆酸ｔａｕｒｏｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＴＣＡ⁃ｄ５：牛黄胆酸－ｄ５ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ⁃ｄ５㊂
图１㊀标准品及样品中待测胆汁酸的提取离子流图
Ｆｉｇ．１㊀Ｅｘｔｒａｃｔｅｄｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｆｂｉｌｅａｃｉｄｓｉｎｓｔａｎｄａｒｄｓａｎｄｓａｍｐｌｅｓ
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㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报
３２卷
表３㊀不同种类胆汁酸的方法学参数及指标Ｔａｂｌｅ３㊀Ａｎａｌｙｓｉｓｐａｒａｍｅｔｅｒｓａｎｄｉｎｄｅｘｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｉｌｅａｃｉｄｓ
项目
Ｉｔｅｍｓ
保留时间Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ／ｍｉｎ定量离子对
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ｉｏｎｓ／（ｍ／ｚ）
碎裂电压Ｆｒａｇｍｅｎｔｏｒ／
Ｖ碰撞能量Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｅｎｅｒｇｙ／ｅＶ线性范围Ｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅ／（μｇ／ｍＬ）线性曲线Ｌｉｎｅａｒｉｔｙｃｕｒｖｅ相关系数Ｒ２内标
Ｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｓ胆酸ＣＡ６．３３９４０７．３－＞４０７．３２４０１００．００２５ ５．００００ｙ＝１３．７９８ｘ０．９９８９㊀㊀胆酸－ｄ４
α－鼠胆酸αＭＣＡ５．５７０４０７．３－＞４０７．３２４０１００．００１０ ５．００００ｙ＝１００．０８ｘ０．９９９２β－鼠胆酸－ｄ４
ω－鼠胆酸ωＭＣＡ
５．３８４
４０７．３－＞４０７．３
２４０
１０
０．００１
０ ５．０００
０
ｙ＝６５．３２９ｘ
０．９９８
２
β－鼠胆酸－ｄ４
猪胆酸ＨＣＡ６．１７８４０７．３－＞４０７．３２４０１００．００１０ ５．００００ｙ＝１１．０７４ｘ０．９９９４β－鼠胆酸－ｄ４
鹅去氧胆酸ＣＤＣＡ８．６２８３９１．３－＞３９１．３２３０１００．００１０ ５．００００ｙ＝３９．８０２ｘ０．９９９５熊去氧胆酸－ｄ４
脱氧胆酸ＤＣＡ８．８０５３９１．３－＞３９１．３２３０１００．００１０ ５．００００ｙ＝８．９９２２ｘ０．９９９８脱氧胆酸－ｄ４
猪去氧胆酸ＨＤＣＡ７．１１０３９１．３－＞３９１．３２３０１００．００１０ ５．００００ｙ＝８．６３６５ｘ０．９９９３脱氧胆酸－ｄ４
７，１２－二酮石胆酸７，１２⁃ＫＬＣＡ
７．６４１
３８９．３－＞３８９．３
２２５
１０
０．００５
０ ０．５００
０
ｙ＝５２．８６ｘ
０．９９３
４
石胆酸－ｄ４
石胆酸ＬＣＡ１０．３６７３７５．３－＞３７５．３２３５１００．００５０ ０．５０００ｙ＝１７．６３ｘ０．９９７２石胆酸－ｄ４
甘胆酸ＧＣＡ５．１６９４６４．３－＞７４．０２３０４６０．００１０ ５．００００ｙ＝４４．９３５ｘ０．９９２６甘胆酸－ｄ４
甘氨鹅胆酸ＧＨＣＡ４．８２３４６４．３－＞７４．０２３０４６０．００１０ ５．００００ｙ＝１１８．２９ｘ０．９９７４甘氨鹅脱氧胆酸－ｄ４
甘氨鹅脱氧胆酸ＧＣＤＣＡ６．７４４４４８．３－＞７４．０２２０４００．００１０ ５．００００ｙ＝２７．８８４ｘ０．９９３０甘氨鹅脱氧胆酸－ｄ４
葡糖石胆酸ＧＬＣＡ９．３０４４３２．３－＞７４．０２２５３６０．００１０ ５．００００ｙ＝１７．８１４ｘ０．９９９６葡糖石胆酸－ｄ４
牛磺胆酸ＴＣＡ４．０５９５１４．３－＞７９．９３００７７０．００１０ ５．００００ｙ＝３２．０２５ｘ＋０．２９１４０．９９８９牛磺胆酸－ｄ４
牛磺β－鼠胆酸ＴβＭＣＡ２．７８７５１４．３－＞７９．９３００７７０．００５０ ５．００００ｙ＝２８．９６３ｘ－０．０７４３０．９９６６牛磺β－鼠胆酸－ｄ４
牛磺ω－鼠胆酸ＴωＭＣＡ２．３７１５１４．３－＞７９．９３００７７０．００５０ ５．００００ｙ＝２８．９６３ｘ－０．０７４３０．９９６６牛磺β－鼠胆酸－ｄ４
牛磺鹅去氧胆酸ＴＣＤＣＡ５．５７２４９８．３－＞７９．９２８０８００．００１０ ５．００００ｙ＝５１．６８９ｘ＋０．０７８２０．９９９９牛磺熊去氧胆酸－ｄ４
牛磺脱氧胆酸ＴＤＣＡ５．７５３４９８．３－＞７９．９２８０８００．００１０ ５．００００ｙ＝１９１．７４ｘ０．９９５０牛磺脱氧胆酸－ｄ４
牛磺猪去氧胆酸ＴＨＤＣＡ４．４１２４９８．３－＞７９．９２８０８００．００１０ ５．００００ｙ＝４８．６７５ｘ－０．０１０４０．９９９９牛磺熊去氧胆酸－ｄ４
牛磺石胆酸ＴＬＣＡ７．４６３４８２．３－＞７９．９２９０８００．００１０ ０．５０００ｙ＝９．４５７３ｘ０．９９３１石胆酸－ｄ４
β－鼠胆酸βＭＣＡ
５．８１２
４０７．３－＞４０７．３
２４０
１０
０．００１
０ ５．０００
０
ｙ＝８３．７７ｘ＋０．１０５７
０．９９９
５
β－鼠胆酸－ｄ４
熊去氧胆酸ＵＤＣＡ６．９１３３９１．３－＞３９１．３２３０１００．００１０ ５．００００ｙ＝６１．６４５ｘ＋１．３４２５０．９９９１熊去氧胆酸－ｄ４
鼠胆酸ＭｕｒｏＣＡ６．６２２３９１．３－＞３９１．３２３０１００．００２５ ５．００００ｙ＝１．２１３５ｘ＋０．０３６２０．９９９３脱氧胆酸－ｄ４
甘氨脱氧胆酸ＧＤＣＡ６．９７６４４８．３－＞７４．０２２０４００．００１０ ５．００００ｙ＝７．６４３７ｘ＋０．０５４１０．９９９７甘氨脱氧胆酸－ｄ４
甘氨熊去氧胆酸ＧＵＤＣＡ５．３８７４４８．３－＞７４．０２２０４００．００５０ ５．００００ｙ＝１３０．８ｘ－５．５３７５０．９９８２甘氨鹅脱氧胆酸－ｄ４
甘氨脱氢胆酸ＧＤＨＣＡ３．３５４４５８．２－＞７４．０２０５３６０．００１０ ５．００００ｙ＝８８．４９６ｘ＋４．２３６９０．９９７３甘氨鹅脱氧胆酸－ｄ４
牛磺α－鼠胆酸ＴαＭＣＡ２．６５７５１４．３－＞７９．９３００７７０．００１０ ５．００００ｙ＝２７．１６４ｘ－０．０５７４０．９９７７牛磺β－鼠胆酸－ｄ４
牛磺猪胆酸ＴＨＣＡ３．４０５５１４．３－＞７９．９３００７７０．００２５ ５．００００ｙ＝２３．８０６ｘ＋０．１５１８０．９９９４牛磺脱氧胆酸－ｄ４
牛磺熊去氧胆酸ＴＵＤＣＡ４．１５１４９８．３－＞７９．９２８０８００．００１０ ５．００００ｙ＝３５．３７９ｘ－０．１０２５０．９９９９牛磺熊去氧胆酸－ｄ４
牛磺脱氢胆酸ＴＤＨＣＡ２．３１４５０８．３－＞７９．９２８５７２０．００１０ ５．００００ｙ＝１５．８３ｘ＋０．１０２３０．９９９７牛磺熊去氧胆酸－ｄ４
０
２８５
１２期姚㊀婷等：大菱鲆胆汁和血浆中的胆汁酸轮廓分析
２．２㊀大菱鲆胆汁和血浆中胆汁酸分析结果
㊀㊀根据上述建立的分析方法对大菱鲆胆汁和血浆中的胆汁酸进行分析，检测到的胆汁酸种类及含量如表４所示㊂
表４㊀大菱鲆胆汁和血浆中的胆汁酸
Ｔａｂｌｅ４㊀ＢｉｌｅａｃｉｄｓｉｎｂｉｌｅａｎｄｐｌａｓｍａｏｆＳｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓｍａｘｉｍｕｓＬ．μｇ／ｍＬ项目Ｉｔｅｍｓ胆汁Ｂｉｌｅ血浆Ｐｌａｓｍａ
胆酸ＣＡ２１７９．６３００ʃ１４６１．２７０００．０８６０ʃ０．０３０７
ω－鼠胆酸ωＭＣＡＮＤ０．００８１ʃ０．００２６
鹅去氧胆酸ＣＤＣＡ５．３９４７ʃ２．３４８１０．０４３５ʃ０．０１４２
甘胆酸ＧＣＡ１５７．２０４０ʃ２９．７００５ＮＤ
甘氨鹅胆酸ＧＨＣＡ０．４９４４ʃ０．０８７０５ＮＤ
甘氨鹅脱氧胆酸ＧＣＤＣＡ８２０．６９００ʃ５０．５５８１０．０１２６ʃ０．００７８
葡糖石胆酸ＧＬＣＡ０．３２８３ʃ０．０５７８０．０００４ʃ０．０００１
牛磺胆酸ＴＣＡ２９８５９．９０００ʃ１０６３８．７６０００．０５１６ʃ０．０５０３
牛磺β－鼠胆酸ＴβＭＣＡ４５．８４４０ʃ１２．６３７２ＮＤ
牛磺ω－鼠胆酸ＴωＭＣＡ２６．１１０７ʃ１３．９２４００．０１９６ʃ０．００８５
牛磺鹅去氧胆酸ＴＣＤＣＡ４５８６．８９００ʃ１８１１．１６０００．１１６０ʃ０．０６６９
㊀㊀ＮＤ表示未检出㊂ＮＤｍｅａｎｓｎｏｔｄｅｔｅｃｔｅｄ．
２．１㊀大菱鲆胆汁中的胆汁酸
㊀㊀胆汁酸分为肝脏合成的初级胆汁酸和在肠道微生物作用下合成的次级胆汁酸㊂由表４可知，在大菱鲆胆汁中检测到６种初级胆汁酸和４种次级胆汁酸，其中初级胆汁酸种类按照其含量高低排列分别为ＴＣＡ㊁ＴＣＤＣＡ㊁ＣＡ㊁ＧＣＤＣＡ㊁ＧＣＡ和ＣＤＣＡ；ＴＣＡ的平均含量达到２９８５９．９０００μｇ／ｍＬ，处在末位的ＣＤＣＡ平均含量只有５．３９４７μｇ／ｍＬ㊂次级胆汁酸检出种类按照其含量高低排列分别为ＴβＭＣＡ㊁ＴωＭＣＡ㊁ＧＬＣＡ和ＧＨＣＡ；其中ＴβＭＣＡ的平均含量为４５．８４４０μｇ／ｍＬ，ＧＨＣＡ平均含量只有０．４９４４１３μｇ／ｍＬ㊂未检出其他２０种胆汁酸㊂
２．２㊀大菱鲆血浆中的胆汁酸
㊀㊀表４列出了大菱鲆血浆中胆汁酸种类和含量，可以看出血浆中胆汁酸含量较低，检测到８种胆汁酸，其中５种初级胆汁酸和３种次级胆汁酸㊂初级胆汁酸按照其含量高低排列分别为ＣＡ㊁ＣＤＣＡ㊁ＧＣＤＣＡ㊁ＴＣＡ㊁ＴＣＤＣＡ，含量在０．０１００ ０．１０００μｇ／ｍＬ；次级胆汁酸为ωＭＣＡ和ＴωＭＣＡ，含量在０．０００３ ０．１０００μｇ／ｍＬ㊂其余２２种胆汁酸均未检出㊂
３㊀讨㊀论
３．１㊀大菱鲆胆汁中的胆汁酸
㊀㊀大菱鲆胆汁中检测到含量最高的２种初级胆汁酸为ＴＣＡ和ＴＣＤＣＡ，二者均为牛磺酸结合型胆汁酸，叠加含量占检测全部初级胆汁酸总含量的９５％以上；这与啮齿动物小鼠的胆汁酸结合类型相似，小鼠大部分胆汁酸是牛磺酸结合型（约占９５％），胆汁酸池包含约６０％的ＴＣＡ和４０％的Ｔα⁃ＭＣＡ及Ｔβ⁃ＭＣＡ，具有强亲水性，牛磺酸与胆汁酸的结合更有利于增加胆汁酸的亲水性，从而促进胆汁酸进入肠道发挥后续功能；而人类的胆汁酸池中ＣＡ约占４０％，ＣＤＣＡ约占４０％，ＤＣＡ约占２０％，甘氨酸与牛磺酸结合型胆汁酸的比例约为３ʒ１，人类胆汁酸具有强疏水性［１９］㊂在水产动物草鱼胆汁的相关研究报道［１４］中发现，草鱼胆汁中
检测到主要的初级胆汁酸为ＣＡ和ＣＤＣＡ，二者在本试验大菱鲆胆汁中也有检出，含量分别为２１７９．６３和７．０６１３μｇ／ｍＬ，其中ＣＡ的含量比草鱼报道中的含量高出１００倍以上，这可能与取样时间有密切关系㊂本试验中大菱鲆投喂后禁食２４ｈ采样，此时鱼体处于饥饿状态，肠道中的胆汁酸已经完成肝肠循环返回至胆汁中储存，更能反映鱼体本身的胆汁酸谱信息［１４］㊂此外，在草鱼的研究报道中发现只有个别样品检测到了牛磺酸结合型胆汁酸ＴＣＤＣＡ，而在本研究中ＴＣＤＣＡ在所有大菱鲆胆汁样品中均有检出，说明胆汁酸的种类和含量在不同鱼之间存在差异㊂本试验中大菱鲆胆汁中主要初级胆汁酸的种类与含量与相关报道中大鼠［２０］的研究结果相一致㊂大菱鲆胆汁中检
１２８５
㊀
动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３２卷
测到主要的次级胆汁酸为ＴβＭＣＡ和ＴωＭＣＡ，而ＧＬＣＡ和含量较低的ＧＨＣＡ均为结合型胆汁酸，其他种类的次级胆汁酸未检出㊂由于肝脏不能合成次级胆汁酸，所以大菱鲆胆汁中的次级胆汁酸是经过肝肠循环后被肝脏重新吸收在胆汁中进行储存，可能存在一定生物学功能［１４］㊂
㊀㊀在先前的研究报道中认为只有啮齿动物鼠类胆汁内才会出现鼠胆酸，其他哺乳动物如猪㊁羊㊁牛等都未检出［２１－２６］㊂另外，在草鱼［１４］的研究报道中，由于没有涉及鼠胆酸类的分析检测，在其他分析的胆汁酸中发现草鱼胆汁中的次级胆汁酸主要为ＤＣＡ和ＴＤＣＡ，与本试验结果中次级胆汁酸ＧＬＣＡ和ＧＨＣＡ也存在较大差异，说明胆汁酸的种类在不同鱼之间可能也存在较大差异㊂在大菱鲆的胆汁中检测到ＴβＭＣＡ和ＴωＭＣＡ，这是首次在鱼类胆汁中发现鼠胆酸类胆汁酸，可能与试验中大菱鲆的饲喂方式以及生理健康状态有关，值得在后期研究中引起关注及进一步在分子水平上确证挖掘㊂次级胆汁酸经肠道微生物作用而合成，并经过肝肠循环最终重吸收至胆囊中储存㊂次级胆汁酸和肠道微生物协调作用对机体的新陈代谢有着重要的调节作用［２７］㊂由于ω⁃ＭＣＡ是β⁃ＭＣＡ主要代谢产物，通过６β－差向异构化形成［９］，本试验中出现的胆汁酸ＴβＭＣＡ和ＴωＭＣＡ可能是大菱鲆肝脏首先合成了ＭＣＡ，之后在肠道微生物的作用下形成β⁃ＭＣＡ并差向异构化形成ω⁃ＭＣＡ，之后在体内与牛磺酸结合形成ＴβＭＣＡ和ＴωＭＣＡ㊂普遍认为只有在啮齿动物肝脏中存在的物种特异性固醇６β－羟化酶（ＣＹＰ２Ｃ７０）可以将大部分ＣＤＣＡ转化为α⁃ＭＣＡ，接着α⁃ＭＣＡ中７α⁃ＯＨ基团差向异构化为７β⁃ＯＨ基团，形成β⁃ＭＣＡ［２７－２８］㊂ＭＣＡｓ及相关代谢产生的次级胆汁酸是啮齿动物体内主要的胆汁酸种类，并且有着重要的生理功能［２９］，人体在非健康状态下也会存在ＭＣＡ，如孕妇在妊娠期患有肝胆淤积症（ＩＣＰ）时［３０］；并且值得引起注意的是，当ＩＣＰ孕妇在使用ＵＤＣＡ进行治疗时，α⁃ＭＣＡ对ＵＤＣＡ的代谢影响具有显著性意义，而β⁃ＭＣＡ对ＵＤＣＡ和ω⁃ＭＣＡ的代谢影响具有显著性意义㊂在大菱鲆或者其他鱼类体内，胆汁酸的合成路径研究尚处于起步阶段，目前只确定存在胆汁酸经典路径的合成酶胆固醇７α－羟化酶（ＣＹＰ７Ａ１）㊁胆固醇１２α－羟化酶（ＣＹＰ８Ｂ１）及胆固醇２７α－羟化酶（ＣＹＰ２７Ａ１），对于可以将ＣＤＣＡ转化为ＭＣＡ的相关酶或者控制相关酶表达的基因是否存在尚不清楚，有待后续进一步深入研究［１５，３１］㊂
３．２㊀大菱鲆血浆中的胆汁酸
㊀㊀血浆中的胆汁酸主要来源于肠道的吸收，但血浆中的胆汁酸会快速地被运送回肝脏，开启新一轮的肛肠循环，所以血浆中的胆汁酸含量一般较低［３２］㊂本研究中检测到的血浆中的初级胆汁酸分别为ＴＣＤＣＡ和ＣＡ，含量换算单位后分别约为０．２３和０．２１μｍｏ／Ｌ，此外还有较低含量的ＴＣＡ和ＣＤＣＡ检出㊂这与胆汁中的胆汁酸种类和含量的分布基本一致㊂次级胆汁酸的含量很低，检出的只有ωＭＣＡ㊁ＧＬＣＡ和ＴωＭＣＡ，其余胆汁酸未检出㊂水产动物草鱼相关的研究报道中尚未在草鱼血浆中发现任何的胆汁酸，可能是由于草鱼血浆中的胆汁酸含量较低或者检测方法的建立等原因未检出［１４］㊂
㊀㊀在哺乳动物大鼠的研究报道中发现正常大鼠血浆中的胆汁酸有初级胆汁酸ＣＤＣＡ㊁ＣＡ㊁ＧＣＡ㊁ＴＤＣＡ㊁ＴＣＡ㊁ＴＣＤＣＡ㊁ＧＣＤＣＡ以及次级胆汁酸ＨＤＣＡ㊁ＤＣＡ㊁β⁃ＭＣＡ㊁Ｔβ⁃ＭＣＡ㊁ＵＤＣＡ㊁ＴＨＤＣＡ㊁ＧＵＤＣＡ㊁ＧＨＤＣＡ㊁和ＧＤＣＡ，其中含量较高的是ＨＤＣＡ㊁ＣＡ㊁ＤＣＡ㊁ＧＣＡ和β⁃ＭＣＡ［２３］，其中初级胆汁酸的种类与本研究相类似㊂由于β⁃ＭＣＡ是啮齿动物鼠类主要的初级胆汁酸，其牛磺酸结合产物Ｔβ⁃ＭＣＡ在血浆中含量也较高，为０．４μｍｏｌ／Ｌ［２３］，与本研究中主要胆汁酸含量在同一水平㊂正常健康人体血浆中胆汁酸的含量较低，有文献报道中为ＧＣＤＣＡ㊁ＨＤＣＡ㊁ＵＤＣＡ㊁ＣＡ和ＤＣＡ，其中ＧＣＤＣＡ的含量最高，为０．４８３μｍｏ／Ｌ［３３］，与本研究和文献报道中的含量在同一水平㊂此外，上述研究报道中也指出，人体和啮齿动物血浆胆汁酸种类和含量在不同健康状态㊁环境因素的影响下会有较大差异，结合型胆汁酸水平也会随着机体状态的不同而发生种类和含量的改变㊂
３．３㊀胆汁酸对鱼类生命健康的影响
㊀㊀近年来，由于对饲料中的高脂高糖物质代谢能力不足或者为降低养殖成本使用植物蛋白质替代鱼粉引起的养殖鱼类的营养性脂肪肝问题日益突出［１３，３４－３５］㊂在草鱼的相关研究中发现，草鱼的肥满度与胆汁中的胆汁酸含量呈负相关关系，鱼体越胖体内的胆汁酸ＣＡ和ＣＤＣＡ的含量越
２２８５
１２期姚㊀婷等：大菱鲆胆汁和血浆中的胆汁酸轮廓分析
低［１４］㊂其他动物相关研究结果也指出，代谢性疾病与胆汁酸的种类和含量变化有着密切关系，如在单纯性肥胖人类血浆胆汁酸谱的研究中发现，ＴＣＤＣＡ和ＴＣＡ的含量显著高于正常人对照组，二者在能量代谢相关疾病机制研究中可能存在有效作用［３６］㊂目前，鱼类胆汁酸谱及轮廓分析研究尚处于起步阶段㊂从哺乳动物（人㊁小鼠和猪）的胆汁酸谱研究上看，不同种类的胆汁酸在调节非酒精性脂肪型肝炎（ＮＡＳＨ）㊁非酒精性脂肪性肝病（ＮＡＦＬＤ）㊁Ⅱ型糖尿病（ＴⅡＤＭ）㊁代谢综合征（ＭＳ）㊁肠道相关炎症等疾病上的作用不尽相同［３７－４２］㊂由于客观条件限制，本研究中未涉及脂肪肝大菱鲆和正常健康状态大菱鲆胆汁酸的对比分析，如果可以实现此差异分析，明确在营养性肝病状态下胆汁酸的差异代谢路径和相关调控方式，可为后续大菱鲆或其他养殖鱼类营养性肝病的饲料靶向干预㊁特定种类胆汁酸定向治疗或者水产功能性饲料的开发提供技术基础㊂因此全面系统的分析养殖肉食性鱼类的胆汁酸轮廓，对后续利用胆汁酸进行营养调控㊁营养性肝病的预防治疗将有重大意义㊂
３．４㊀本试验研究局限性
㊀㊀本试验通过固相萃取过程净化，利用ＵＰＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ法建立了３０种初级和次级胆汁酸的定性定量分析方法，并实现了对大菱鲆胆汁和血浆中胆汁酸的种类及含量分析㊂本试验中采用内标校正，能够实现胆汁酸的准确定量分析㊂本试验中涉及的胆汁酸种类只有３０种，大部分是文献的报道及现有商品化标准品的胆汁酸，但鱼类不同于哺乳动物及人类，其胆汁酸的种类可能有较大差异，一些尚未发现或缺乏商业化标准品的㊁或者含量微乎其微的胆汁酸检测给相关分析鉴定带来挑战㊂
４㊀结㊀论
㊀㊀本研究中利用ＵＰＬＣ⁃ＭＳ／ＭＳ法，采用同位素内标定量，建立了３０种胆汁酸的分析方法，并对大菱鲆胆汁和血浆中胆汁酸的种类及含量进行分析㊂结果发现，大菱鲆胆汁中的初级胆汁酸主要是ＴＣＡ㊁ＴＣＤＣＡ㊁ＣＡ和ＣＤＣＡ，次级胆汁酸主要是ＴβＭＣＡ㊁ＴωＭＣＡ㊁ＧＬＣＡ和ＧＨＣＡ；血浆中初级胆汁酸主要是ＴＣＤＣＡ㊁ＣＡ㊁ＴＣＡ和ＣＤＣＡ，次级胆汁酸主要是ωＭＣＡ㊁ＧＬＣＡ和ＴωＭＣＡ㊂参考文献：
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