最新3第三讲限制性酶切方式及连接汇总
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总体积：20µL
酶切步骤： ⑴加样； ⑵摇匀，短时离心； ⑶反应1—3h； ⑷反应终止。
65℃水浴10—15min
1限制酶切的方式
1.2 双酶切 用不同的限制酶切割同一DNA分子的方法。
环状DNA分子完全酶切的结果，产生DNA 片段数是两种限制酶识别序列数之和。
线性DNA分子完全酶切的结果，产生DNA 片段数是两种限制酶识别序列数加1.
目的基因
限Βιβλιοθήκη Baidu性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA ligase
载体自连
目的基因 自连
2.2 DNA片段之间的连接 具互补黏性末端之间的连接 具平末端之间的连接
具互补黏性末端片段之间的连接
5‘GGACTG-0H 3’CCTGACTTAA-P
E.coR I 切割
P-AATTCTGCAA-3’ 0H-GACGTT-5’ E.coR I切割
列进行不完全的切割。
用途：当某种限制酶的多个识别序列之中 有一个识别序列恰好在回收待用的DNA片段 上，若完全酶切，将此DNA片段从中切断。 为了解决这个问题，就需要用到部分酶切， 以满足实验的需要。
2 限制酶切后的连接
2.1 DNA ligase:
能催化dsDNA片段紧靠在一起的3‘羟基 末端与5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键， 使两末端连接的一种核酸酶。
GATCC G
切
位
目的基因用 Bam HⅠ切割
G
载体DNA用Bam HⅠ切割
GATCC
点
+ CCTAG
G
连
G CCTAG
GATCC G
接
T4 DNA ligase
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
载体自连
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
重组体
GGATCC CCTAGG
DNA ligase 5‘GGACTGAATTCTGCAA-3’ 3’CCTGACTTAAGACGTT-5’
E.coR I 识别序列
结论：
待连接的两个DNA片段的末端如果是 用同一个酶切割的，连接后仍保留原限制 酶的识别序列。
同
一 限
GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ切割反应
制
酶
G CCTAG
GGATCC CCTAGG
目的基因自连
不同限制酶切位点的连接
Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点
G A A T T C
A G A T C T
C T T A A G
T C T A G A
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT A
GAATTC CTTAAG
双酶切可以在不同的反应系统中进行。
A 需要较低盐浓度的酶先切割，然后升高盐浓 度，另一个酶切割；
B 最适反应温度较低的酶先切割，然后升高温 度，另一个酶切割；
C 第一个酶切割后，经凝胶电泳回收DNA， 再选用合适反应系统，进行第二个酶的切割。
D 双酶切在同一个反应系统中。
1 限制酶切的方式
1.3 部分酶切 指限制酶对其在DNA分子上的全部识别序
3第三讲限制性酶切方式及连接
1限制酶切的方式
1.1 单酶切 若DNA样品是环状DNA分子，产生与识
别序列（n）相同的DNA片段数。 若DNA样品是L—DNA片段，完全酶切产
生n+1个DNA片段。
1限制酶切的方式
1.1 单酶切
酶切体系：
反应体系
13µL ddH2O 2µL 10×buffer 4µL 底物DNA 1µL 限制酶
AGATCT TCTAGA
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+AATTC G
A TCTAG
T4 DNA ligase
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
重组体
具平末端DNA片段之间的连接
5‘CAAGCTCA3’ 3’GTTCGAGT5’
AluI
5’GTAGCTTA3’ 3’CATCGAAT5’
AluI
P-CTCA-3’ 5’CAAG-OH
P-CTTA3’ 5’GTAG-OH
OH-GAGT5’ 3’GTTC-P OH-GAAT-5’ 3’CATC-P
T4 DNA ligase 5’CA AGCT TA-3’
3’GT TCGA AT-5’
AluI AGCT
HindⅢ AAGCTT
结论：
如果两个DNA片段的末端是用同一种 酶切割后产生的，连接后的DNA分子仍 保留那种酶的识别序列，有的会出现另一 种新的限制酶识别序列。
思考题： 1 限制酶切的方式 2 限制酶切后的连接
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酶切步骤： ⑴加样； ⑵摇匀，短时离心； ⑶反应1—3h； ⑷反应终止。
65℃水浴10—15min
1限制酶切的方式
1.2 双酶切 用不同的限制酶切割同一DNA分子的方法。
环状DNA分子完全酶切的结果，产生DNA 片段数是两种限制酶识别序列数之和。
线性DNA分子完全酶切的结果，产生DNA 片段数是两种限制酶识别序列数加1.
目的基因
限Βιβλιοθήκη Baidu性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA ligase
载体自连
目的基因 自连
2.2 DNA片段之间的连接 具互补黏性末端之间的连接 具平末端之间的连接
具互补黏性末端片段之间的连接
5‘GGACTG-0H 3’CCTGACTTAA-P
E.coR I 切割
P-AATTCTGCAA-3’ 0H-GACGTT-5’ E.coR I切割
列进行不完全的切割。
用途：当某种限制酶的多个识别序列之中 有一个识别序列恰好在回收待用的DNA片段 上，若完全酶切，将此DNA片段从中切断。 为了解决这个问题，就需要用到部分酶切， 以满足实验的需要。
2 限制酶切后的连接
2.1 DNA ligase:
能催化dsDNA片段紧靠在一起的3‘羟基 末端与5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键， 使两末端连接的一种核酸酶。
GATCC G
切
位
目的基因用 Bam HⅠ切割
G
载体DNA用Bam HⅠ切割
GATCC
点
+ CCTAG
G
连
G CCTAG
GATCC G
接
T4 DNA ligase
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
载体自连
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
重组体
GGATCC CCTAGG
DNA ligase 5‘GGACTGAATTCTGCAA-3’ 3’CCTGACTTAAGACGTT-5’
E.coR I 识别序列
结论：
待连接的两个DNA片段的末端如果是 用同一个酶切割的，连接后仍保留原限制 酶的识别序列。
同
一 限
GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ切割反应
制
酶
G CCTAG
GGATCC CCTAGG
目的基因自连
不同限制酶切位点的连接
Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点
G A A T T C
A G A T C T
C T T A A G
T C T A G A
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT A
GAATTC CTTAAG
双酶切可以在不同的反应系统中进行。
A 需要较低盐浓度的酶先切割，然后升高盐浓 度，另一个酶切割；
B 最适反应温度较低的酶先切割，然后升高温 度，另一个酶切割；
C 第一个酶切割后，经凝胶电泳回收DNA， 再选用合适反应系统，进行第二个酶的切割。
D 双酶切在同一个反应系统中。
1 限制酶切的方式
1.3 部分酶切 指限制酶对其在DNA分子上的全部识别序
3第三讲限制性酶切方式及连接
1限制酶切的方式
1.1 单酶切 若DNA样品是环状DNA分子，产生与识
别序列（n）相同的DNA片段数。 若DNA样品是L—DNA片段，完全酶切产
生n+1个DNA片段。
1限制酶切的方式
1.1 单酶切
酶切体系：
反应体系
13µL ddH2O 2µL 10×buffer 4µL 底物DNA 1µL 限制酶
AGATCT TCTAGA
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+AATTC G
A TCTAG
T4 DNA ligase
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
重组体
具平末端DNA片段之间的连接
5‘CAAGCTCA3’ 3’GTTCGAGT5’
AluI
5’GTAGCTTA3’ 3’CATCGAAT5’
AluI
P-CTCA-3’ 5’CAAG-OH
P-CTTA3’ 5’GTAG-OH
OH-GAGT5’ 3’GTTC-P OH-GAAT-5’ 3’CATC-P
T4 DNA ligase 5’CA AGCT TA-3’
3’GT TCGA AT-5’
AluI AGCT
HindⅢ AAGCTT
结论：
如果两个DNA片段的末端是用同一种 酶切割后产生的，连接后的DNA分子仍 保留那种酶的识别序列，有的会出现另一 种新的限制酶识别序列。
思考题： 1 限制酶切的方式 2 限制酶切后的连接
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