常用的生化反应
细菌鉴定中常用的九个生化反应
１、糖酵解试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。
可用指示剂及发酵管检验。
试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。
接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。
２、淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。
淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
试验方法：以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20°培养5天。
然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。
立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。
阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。
淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。
培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。
淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。
3 、明胶液化试验有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。
试验方法：挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。
于20~22℃培养7~14天。
明胶高层亦可培养于36±1℃。
每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。
实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察
实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察一结果观察1.葡萄糖发酵实验直接观察试管,试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌.左边是恶臭假单胞菌，它有气泡并变黄；右边是大肠杆菌，２v.p.反应和甲基红试验:将培养的液体培养基分成两个干净的小试管，在一个试管中滴入2-3滴甲基红试剂。
溶液变红为甲基红阳性菌，与甲基红阴性菌相同，将V.P.试剂添加到另一个试管中，并在37℃下保持15分钟。
变红的是阳性细菌，保持不变的是阴性细菌vp，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。
3吲哚实验在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.左边是大肠杆菌，带有红色阳性细菌；右边是铜绿气单胞菌，颜色和阴色相同性菌。
4硝酸盐还原实验在点滴板上滴入革里斯试剂a液和b液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌．右下角的假单胞菌为阴性菌，加入科里奥利试剂A和B后不变色，加入二苯胺试剂后变蓝；左上角的大肠杆菌是红色的。
５柠檬酸盐实验那些对柠檬酸细菌呈阳性的人，以及那些使用斜面的人，都会变成阴性左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。
6明胶水解向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌．左边是大肠杆菌，呈透明圆形，呈阳性；右边是枯草芽孢杆菌，一种阴性细菌。
7淀粉水解实验将碘溶液加入培养的淀粉培养皿中，盖上培养皿。
菌落周围有透明圈的细菌是淀粉水解的阳性细菌，没有透明圈的细菌是阴性细菌左边枯草杆菌，出现透明圈，阳性；右边大肠杆菌，无透明圈，阴形。
8硫化氢生产实验直接观察培养好的培养基，出现黑色沉淀者为阳性菌，不变者为阴性菌．左边是一根变形的杆状物，有黑色沉淀和阳性细菌；右边是大肠杆菌，阴性细菌。
微生物鉴定中常用的生理生化试验
一、实验目的1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。
4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5.了解IMViC的原理。
二、实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
具体的原理如下：1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（枯草杆菌，大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。
酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。
若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
（1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。
三、实验材料1.菌种大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn），产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。
细菌鉴定中常用的生理生化反应
葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的 纤维蛋白原转变为纤维蛋白，导致血 浆凝固。
其他细菌的分类和鉴定
氧化发酵试验
细菌对碳水化合物的代谢方式不同，可分为氧化型和发酵型。通过 观察细菌在氧化发酵培养基中的生长情况和颜色变化来判断结果。
硝酸盐还原试验
细菌可将硝酸盐还原为亚硝酸盐或氮气，通过观察培养基中硝酸盐 的颜色变化来判断结果。
细菌鉴定在医学、工业等领域的应用
细菌鉴定对于医学诊断、流行病学调查、食品卫生、环境监测等领域具有重要意 义，因此，掌握细菌鉴定的方法和技巧至关重要。
细菌鉴定的重要性
准确识别病原菌
通过细菌鉴定，可以准确识别 引起人类和动植物疾病的病原 菌，为疾病的预防和治疗提供
科学依据。
保障食品安全
细菌鉴定在食品工业中用于检 测食品中的有害菌和腐败菌， 确保食品的安全和质量。
细菌鉴定中生理生化反应的改进方向
自动化技术应用
通过自动化仪器和计算机技术，实现 生理生化反应的自动化操作和数据分 析，提高鉴定效率和准确性。
多项指标联合应用
将多个生理生化反应指标联合应用， 形成综合评价体系，提高细菌鉴定的 准确性和可靠性。
新型反应的开发
针对现有生理生化反应的不足，开发 新的反应类型和试剂盒，以满足更多 种类细菌的鉴定需求。
明胶液化试验
某些细菌可分泌明胶酶，将明胶分解为可溶性的多肽和氨基酸，通过 观察明胶的液化情况来判断结果。
05
细菌鉴定中生理生化反 应的优缺点及改进方向
生理生化反应的优缺点
准确性高
通过特定的生理生化反应，可以准确 地鉴定细菌种类。
操作简便
大多数生理生化反应的操作步骤相对 简单，易于掌握。
生理生化反应的优缺点
细菌常用生理生化鉴定
细菌鉴定中常用的生理生化反应录入时间:2009-8-13 15:12:12 来源：中国生命科技论坛1、实验原理（1）细菌生化试验各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。
用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。
（2）糖（醇）类发酵试验不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。
其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。
酸的产生可利用指示剂来判定。
在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。
气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。
（3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验）很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。
因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。
若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。
（4）大分子物质代谢实验．靛基质（口引睬）试验某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。
硫化氢试验某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。
为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。
明胶液化实验某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。
淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做）细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。
细菌鉴定中常用的生理生化反应
细菌鉴定中常用的生理生化反应细菌鉴定中常用的生理生化反应1、实验原理（1）细菌生化试验各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。
用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。
（2）糖（醇）类发酵试验不同的细菌含有能发酵不同糖（醇）的酶，因此发酵糖（醇）的能力不同。
其代谢产物也不同。
例如，有些产生酸和气体，有些产生酸但不产生气体。
酸的生成可通过指示剂来确定。
在制备培养基2（黄色）-6.8（紫色）]时预先加入甲酚紫[PHS]，当发酵产生酸时，培养基可从紫色变为黄色。
气体的产生可以通过发酵管中倒置的杜氏管中是否存在气泡来证明。
（3）甲基红（methylred）试验（该试验简称mr试验）许多细菌，如大肠杆菌，分解葡萄糖生成丙酮酸，然后分解生成甲酸、乙酸、乳酸等，将培养基的pH值降低到4.2以下。
此时，如果添加甲基红，指示器将显示红色。
因为甲基红指示剂的变色范围为pH4（红色）-ph6 2（黄色）。
如果某些细菌，如产气菌，分解葡萄糖生成丙酮酸，但迅速解吸丙酮酸并将其转化为酒精，培养基的pH值仍高于6.2。
因此，此时添加甲基红指示剂以显示黄色。
（4）大分子代谢的实验。
靛蓝基质（口服吸收）试验某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。
硫化氢试验某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。
为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。
明胶液化实验某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。
淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做）细菌不能直接利用大分子淀粉。
它们必须依靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解成小分子糊精或进一步水解成葡萄糖（或麦芽糖），然后被细菌吸收和利用。
常用细菌生化反应试验
用于肠道杆菌的鉴定
糖发酵试验结果判断
反应现象 酸性变色、有气泡 酸性变色、无气泡
培养基不变色
结果描述
分解××糖产酸、产气 分解××糖产酸、不产
气 不分解××糖
甲基红试验
• 原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步 生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4 以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色 反应。此为甲基红试验阳性。
伤寒沙门菌KIA（K A－＋）MIU（＋－－）
大肠埃希菌KIA（AA＋－）MIU（＋＋－）
苯丙氨酸脱氨实验
• 原理：细菌的具有的苯丙氨酸脱氨酶，可 使培养基中的苯丙氨酸脱氨，形成苯丙酮 酸，后者与三氯化铁作用，形成绿色化合 物。
• 培养基：苯丙氨酸琼脂 • 试剂：10％三氯化铁 • 结果：加入试剂后培养基呈现绿色为阳性 • 应用：多用于肠道杆菌的鉴定
脱酸 乙酰甲基甲醇
V-P试剂 二乙酰
培养基变红
葡萄糖发酵形成丙酮酸后的不同代谢途径
大肠埃希菌IMViC试验（＋＋－－） 右侧为对照（－－＋＋）
葡萄糖
V－P试验
丙酮酸
脱酸
乙酰甲基甲醇
V-P试剂
二乙酰
培养基变红
大肠埃希菌IMViC试验（＋＋－－） 右侧为对照（－－＋＋）
蛋白质类代谢试验
• 靛基质试验 • 硫化氢试验 • 苯丙氨酸脱氨试验 • 尿素酶试验
• 培养基：葡萄糖蛋白胨水 • 结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+
培养基不变色： －
• 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主 要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
葡萄糖
微生物鉴定的生理生化反应汇总
微生物鉴定的生理生化反应各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验1．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。
检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。
所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。
若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不分解糖则无变化。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。
即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）淀粉醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇非糖类肌醇2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告细菌鉴定是微生物学中的一个重要分支，它是通过对细菌的形态、生理生化反应、生长特性等方面进行分析，来确定细菌种类的过程。
在细菌鉴定中，生理生化反应实验是一种常用的方法，它可以通过观察细菌在不同条件下的生长情况，来确定细菌的种类。
本文将介绍几种常用的生理生化反应实验。
1. 氧气需求实验氧气需求实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌的氧气需求量。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同氧气浓度的培养基中，然后观察细菌的生长情况。
如果细菌只能在氧气充足的条件下生长，那么它就是一种需氧菌；如果细菌只能在氧气缺乏的条件下生长，那么它就是一种厌氧菌；如果细菌既能在氧气充足的条件下生长，也能在氧气缺乏的条件下生长，那么它就是一种兼性厌氧菌。
2. 糖类发酵实验糖类发酵实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌对不同糖类的发酵能力。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同糖类的培养基中，然后观察培养基的酸碱度变化。
如果培养基的酸碱度发生了变化，那么说明细菌对这种糖类进行了发酵。
通过这个实验，我们可以确定细菌对哪些糖类具有发酵能力，从而进一步确定细菌的种类。
3. 氧化还原实验氧化还原实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌的氧化还原能力。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同氧化还原剂的培养基中，然后观察培养基的颜色变化。
如果培养基的颜色发生了变化，那么说明细菌对这种氧化还原剂具有反应能力。
通过这个实验，我们可以确定细菌的氧化还原能力，从而进一步确定细菌的种类。
4. 酶活性实验酶活性实验是一种常用的生理生化反应实验，它可以用来确定细菌的酶活性。
在这个实验中，我们需要将细菌接种到含有不同底物的培养基中，然后观察底物的变化情况。
如果底物发生了变化，那么说明细菌对这种底物具有酶活性。
通过这个实验，我们可以确定细菌的酶活性，从而进一步确定细菌的种类。
微生物常用生化反应及意义
手工法ＩＮＤ试验原理 手工法ＩＮＤ试验原理 ＩＮＤ
● 原理： ● 有些细菌具有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸，产生吲哚， ● 吲哚与试剂柯凡克（ＫＯＶＡＣ）对二甲氨基苯甲醛作用，形成 ● 玫瑰吲哚而呈红色
手工ＩＮＤ试验结果判断 手工ＩＮＤ试验结果判断 ＩＮＤ
Microscan Panel 上原理和结果判断 ● 原理： ● 色氨酸代谢形成吲哚，加入ＫＯＶＡＣ’Ｓ试剂，阳性反应会呈红 ● 色． ● 结果判断： ● 阳性为粉红至红色，阴性为澄清或橙色．
● ● ● ● 某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步将丙酮酸脱羧成为 乙酰甲基甲醇，后者在碱性环境中被空气中的氧氧化成为二乙酰， 进而与培养基中的精氨酸等所含的胍基结合，形成红色的化合物， 即Ｖ－Ｐ试验阳性
手工Ｖ－Ｐ试验结果判别 手工Ｖ－Ｐ试验结果判别 Ｖ－Ｐ
Microscan Panel 上原理和结果判断 ● 原理： ● 细菌使丙酮酸钠反应产生乙偶姻，在加入40%KOH,5%α萘酚后产生红色 ● 结果判断： ● 红色为阳性，澄清为阴性． ● 经过１８小时培养，某些非发酵菌可能产生粉红色，应判为阴性
微生物常用生化反应及 意义
德灵诊断
周玮刚
革兰氏染色法（Ｇ 革兰氏染色法（Ｇram stain） （Ｇ ）
● 染色步骤： ● １．初染：第一染色剂（结晶紫）染色１分钟，水洗 ● ２．固定：第二染色剂（碘液）染色１分钟，水洗 ● ３．脱色：第三液脱色剂（９５％乙醇）脱色到无紫色脱落为止， 水洗 ● ４．复染：第四液复染液（石碳酸复红）染色３０Ｓ，水洗．干 后镜检
手工法NIT试验原理 试验原理 手工法
● 原理：
● 硝酸盐培养基中的硝酸盐可被某些细菌还原为亚硝酸盐，后者与 ● 乙酸作用生成亚硝酸．亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯 ● 磺酸，再与α萘氨结合成红色的Ｎ－α苯氨偶氮苯磺酸．
细菌常见的生化反应试验
细菌常见的生化反应试验（一）什么是生化试验?指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。
生化试验或称生化反应：细菌的酶不完全相同，对营养物质的分解能力不一致，因此其代谢产物各异。
在培养基中加入可与被测终产物反应的指示剂，产生肉眼可见的变化，如颜色的改变等，利用生化方法来鉴定细菌的试验，统称为细菌的生化试验或称生化反应（二）生化试验的方法：1在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的pH值变化。
2在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。
3根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。
4根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。
（三）生化试验的注意事项1.待检菌应是新鲜培养物，培养18~24h。
2.待检菌应是纯种培养物。
3.遵守观察反应的时间。
观察结果的时间，多为24或48小时。
4.应做必要的对照试验。
5.提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。
（四）检验细菌的生化试验范围:1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验二、糖醇类代谢试验（一）糖醇类发酵试验（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验（三）V-P试验（四）甲基红（Methyl Red）试验MR（五）七叶苷水解试验（六）甘油品红试验（一）糖醇类发酵试验1、原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖(醇)，有的只能分解1~2种糖(醇) ，有的分解糖(醇)能产酸产气，有的分解糖(醇)只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。
常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇2试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。
微生物鉴定的生理生化反应汇总
微生物鉴定的生理生化反应各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验1．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。
检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。
所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。
若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不分解糖则无变化。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。
即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）淀粉醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇非糖类肌醇2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
常用细菌生化反应试验
不发酵的V-P试验
总结词
详细描述
不发酵的V-P试验表示细菌不能发酵葡萄糖， 不产生乙酰甲基甲醇，在试验中表现为无色。
有些细菌不能发酵葡萄糖，因此不产生乙酰 甲基甲醇属、不动杆菌 属等。不发酵的V-P试验有助于鉴别非发酵 菌与肠杆菌科细菌。
临床意义
非发酵菌为医院感染的重要病原菌，可引起 呼吸道、泌尿道、伤口等感染。
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检测细菌对酸性环境的 适应能力，用于鉴别肠
道菌属。
试验原理
糖发酵试验
氧化酶试验
不同细菌含有不同的酶系，能够分解糖类 产生酸性或碱性产物，通过指示剂变色反 应判断细菌对糖类的代谢能力。
氧化酶催化过氧化氢分解为水和氧气，过 氧化氢在铁离子存在下形成棕色沉淀，通 过观察沉淀判断氧化酶活性。
触酶试验
甲基红试验
V-P试验阴性
总结词
V-P试验阴性表示细菌不能利用葡萄糖，不产生乙酰甲基甲醇，在试验中表现为无色。
详细描述
当细菌不能利用葡萄糖或不产生乙酰甲基甲醇时，V-P试验呈阴性。这通常表明该细菌 不属于肠杆菌科，因为肠杆菌科细菌通常能够发酵葡萄糖并产生乙酰甲基甲醇。V-P试
验阴性有助于排除某些肠道细菌感染的可能性。
过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧 气，氧气在硫酸中形成白色沉淀，通过观 察沉淀判断过氧化氢酶活性。
肠道菌属能够代谢糖类产生酸性产物，使 培养基pH降低，加入甲基红指示剂后呈红 色，通过观察颜色变化判断肠道菌属。
02 糖发酵试验
葡萄糖发酵试验
总结词
葡萄糖发酵试验是细菌生化反应试验中的一种，用于鉴别细菌对葡萄糖的代谢 能力。
04 Voges-Proskauer试验
微生物学检验细菌的生物化学实验
检测对象：特异性抗原
方法：直接凝集试验（玻片法）、荚膜肿
胀伤寒试杆验菌诊断血清 + 待检测细菌
（含抗伤寒杆菌抗体）
细菌凝集
玻片凝集试验：阳性
报告：检出伤寒杆菌
血清学诊断
试剂：含已知抗原 应用：检测待检者血清中有无相应的抗 体以及抗体的效价
球菌
种类: 革兰阳性 葡萄球菌属、链球菌属（链球菌、肺炎 链球菌）、肠球菌属、微球菌属等 革兰阴性 奈瑟菌属、布兰汉菌属
四种革兰阳性菌的比较
葡萄球菌属 微球属 链球菌属 气球菌属
排列方式 葡萄串状、 四联或成对 链状 成双或四联
触酶试验
+
+
-
弱+
氧化/发 酵
厌氧生长
发酵 +氧化 源自生长发酵 +发酵 弱
葡萄球菌属
最常见的化脓性球菌 医务人员的葡萄球菌带菌率高 革兰阳性、葡萄串状排列 产生不同的脂溶性色素 触酶试验阳性 发酵葡萄糖 金黄色葡萄球菌是主要致病菌
培养基不变色： － 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验， 主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
伏－普试验（V-P试验）
原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮 酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙 酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白 胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化 合物。
培养基：葡萄糖蛋白胨水
结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+ 培养基不变色： －
应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主 要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌
葡萄糖
甲基红试验
丙酮酸 大量混合酸
pH降至4.4以下
甲基红试剂
培养基变红
葡萄糖
V－P试验
微生物鉴定中常用的生化反应
有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。
淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。
细菌产生的脂肪酶能分解培养基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。
脂肪酸可以使培养基pH下降，可通过在油脂培养基中加入中性红做指示剂进行测试。
中性红指示范围为pH6.8（红）～8.0（黄）。
当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，则菌落周围培养基中出现红色斑点。
某些细菌分泌蛋白酶分解明胶，产生小分子物质。
如果细菌具有分解明胶的能力，则培养基可由原来固体状态变成液体状态。
详细实验方法∙微生物鉴定中常用的生化反应实验材料∙大肠杆菌∙枯草杆菌∙金黄色葡萄球菌∙产气肠杆菌∙铜绿假单胞菌∙黏乳产碱杆菌∙普通变形杆菌试剂、试剂盒∙油脂培养基∙淀粉培养基∙明胶液化培养基∙石蕊牛乳培养基仪器、耗材∙平皿∙接种环∙酒精灯∙试管∙接种针有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。
淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。
细菌产生的脂肪酶能分解培养基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。
脂肪酸可以使培养基pH下降，可通过在油脂培养基中加入中性红做指示剂进行测试。
中性红指示范围为pH6.8（红）～8.0（黄）。
当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，则菌落周围培养基中出现红色斑点。
某些细菌分泌蛋白酶分解明胶，产生小分子物质。
如果细菌具有分解明胶的能力，则培养基可由原来固体状态变成液体状态。
牛乳中主要含有乳糖、酪蛋白等成分。
细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖及酪蛋白的分解和利用。
牛乳中常加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。
石蕊中性时呈淡紫色，酸性时呈红色，碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部脱色。
细菌对牛乳的利用可分三种情况：（1）酸凝固作用：细菌发酵乳糖后，产生许多酸，使石蕊牛乳变红，当酸度很高时，可使牛乳凝固，此称为酸凝固。
（2）凝乳酶凝固作用：某些细菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固在中性环境中发生。
通常这种细菌还具有水解蛋白质的能力，因而产生氨等碱性物质，使石蕊变蓝。
细菌鉴定之生化反应
二 蛋白质和氨基酸的代谢试验
1 明胶液化试验
原理：细菌产生明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固 体变为液体
方法：待测菌接种于明胶培养基，22 ℃培养7天。若用35 ℃孵育，因明 胶在此温度下自行液化，故在观察前先置4 ℃冰箱30min再观察
结果：培养基呈液化状态为阳性 意义：多数假单胞菌能液化明胶，肠杆菌科细菌如：沙雷菌、变形杆菌、
细菌鉴定之生化反应
常用试验
碳水化合物的代谢试验 蛋白质和氨基酸的代谢试验 碳源和氮源利用试验 各种酶类试验 抑菌试验
一 碳水化合物的代谢试验
1 糖（醇、苷）类发酵试验 原理：细菌含有发酵糖（醇、苷）的酶分解糖类产酸、产气、或仅产酸
培养基：含有0.5%~1%的糖（醇、苷）的液体、半固体、固体、或 微量生化管
阴沟杆菌等可液化明胶
2 吲哚（叮基质）试验
原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲 哚，当加入吲哚试剂-柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）后则形成红色的 玫瑰吲哚
培养基：蛋白胨水 方法：待测菌接种于培养基，35 ℃培养24-48小时，沿试管壁缓慢
加入吲哚试剂 结果：于两者接触面出现红色为阳性，无色为阴性 意义：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷伯为阳性 试剂：柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）与欧氏试剂的区别：前者含戊
2 触酶试验
原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和氧，出现 气泡
试剂：3%过氧化氢溶液 方法：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加3%过氧化氢数滴，
观察结果 结果：出现大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性 意义：用于革兰氏阳性球菌的鉴别，葡萄球菌和微球菌为阳性，链
球菌和肠球菌为阴性，肠球菌多假阳性
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克氏双糖铁琼脂（KIA）
• 葡萄糖∶乳糖＝1∶10 • 铁：枸橼酸铁铵 • 指示剂：酚红 – 我们人为的把高层代表葡萄糖，斜面代表乳糖。
葡（－） 乳（－）
葡（＋） 乳（＋）
克氏双糖铁琼脂（KIA）
葡（＋） 葡（＋） 乳（－）H2S（＋） 乳（－）
原理
以葡萄糖＋，乳糖－为例 葡萄糖是最早利用的单糖，发酵葡萄糖的中间产 物丙酮酸为酸性，酚红指示剂为黄色。
• 结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。
氧化酶试验
• 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的 最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化， 再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化 合物。
• 试剂：1％盐酸四甲基对苯二胺或1％盐酸二甲基对苯二胺。
• 方法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。 • 结果：细菌在与试剂接触10秒内呈深紫色，为阳性。
O-F试验
• • • • • • • • 将实验菌种接种到2支O-F管中 在其中1支管中加入无菌液体石蜡，厚度0.5cm左右。 35℃培养18-24小时。 结果 开口管 黄色 黄色 绿色 加石蜡管 黄色 绿色 蓝色 结果 发酵型（F） 氧化型（O） 产碱型
VP试验
产气肠杆菌能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲 醇，乙酰甲基甲醇被氧化（在碱性溶液中）生成二乙酰， 后者可与含胍基的化合物反应生成红色化合物，称VP试 验阳性。大肠埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，VP阴性。 VP甲液：5%α －萘酚
– 有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌； – 有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；
– 有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞
菌等。
• 硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝 酸。
• 试剂：甲液 乙液
对氨基苯磺酸 α -奈胺
• 结果：出现红色为阳性。 • 若加入试剂后无颜色反应，可能是：①硝酸盐没有被还原， 试验阴性；②硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假 阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则 表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴 性。
• 有些细菌能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等， 生成硫化氢 H2S＋Fe 黑色的硫化亚铁
• 问：有无葡萄糖－，乳糖＋的情况？为什么？
MIU试验
• 半固体 • M代表动力 • I代表吲哚（靛基质） • U代表尿素 • 结果观察时先观察有无动力，试验管有无变红（三分之二
管变红为尿素阳性），然后加入对二甲基氨基苯甲醛，观
察吲哚试验结果。
• 思考题：
KIA的试验原理
实验内容
• 1、用革兰染色法观察四种试验细菌的形态学特征
• 2、将四种试验细菌接种各种生化反应管：O-F管2支，KIA、 MIU、硝酸盐还原各1支，葡萄糖磷酸盐蛋白胨水2支。接种 完毕放置35℃培养18-24小时。 • 3、过氧化氢酶试验、氧化酶试验
• 注：以组为单位做四株试验菌，每位同学做一株菌。
• 若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管， 如有气泡产生，表示有氮气生成。
过氧化氢酶试验(触酶试验)
• 原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和 新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。 • 试剂：3％过氧化氢溶液。 • 方法：取待测菌涂在玻片上，然后加3％过氧化氢数滴立 即观察结果。
硝酸盐还原试验
• 原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中， 硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞 内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚
硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸
盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还 原性产物。
• 硝酸盐还原的过程因细菌不同而异:
胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢。在有醋酸铅或硫酸亚 铁存在时，则生成黑色硫化铅或硫化亚铁，可借以鉴别细 菌。
尿素分解试验
变形杆菌具有尿素酶，可分解尿素产生氨，培养基
呈碱性，以酚红为指示剂检测呈红色。
阳性 阴性 尿素酶试验
吲哚（I）、甲基红（M）、VP（V）、枸橼酸盐利用 （C）四种试验，常用于鉴定肠道杆菌，合称之为 IMViC试验。大肠埃希菌呈“++--”，产气肠杆菌为 “--++”。
VP乙液：40%KOH
甲基红试验
产气肠杆菌使丙酮酸脱羧后形成中性产物，培养液
pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性，
大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性pH＜
5.4，指示剂甲基红呈红色，称甲基红试验阳性。
枸橼酸盐利用试验
能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细菌如产气肠杆菌， 分解枸橼酸盐生成碳酸盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，
斜面
1、斜面生长的菌量多，面积大，跟氧分子接触的面积也
大 氧化 丙酮酸 CO2＋H2O 中性，PH不变 2、斜面蛋白质被细菌利用，氨基酸被利用产生NH3，碱性，
酚红指示剂为红色。
高层
• 高层中丙酮酸浓度高，跟氧分子接触少，在24小时内
不会被氧化，因此仍为黄色。
结果
• 高层－黄色
斜面－红色
• 如葡萄糖＋，乳糖＋，则高层与斜面均为黄色（24小时 内）。 • 如果延长培养时间，高层中的丙酮酸也会进一步氧化，同 时细菌利用蛋白质后产碱性物质越来越多，则高层也会变 为红色。
糖发酵试验
细菌对各种糖的分解能力及代谢产物不同，可借以鉴 别细菌。一般非致病菌能发酵多种单糖，如大肠埃希菌能 分解葡萄糖和乳糖，产生甲酸等产物，并有甲酸脱氢酶， 可将其分解为CO2和H2，故生化反应结果为产酸产气， 以“⊕”表示。伤寒沙门菌分解葡萄糖产酸，但无甲酸脱 氢酶，故生化结果为产酸不产气，以“+”表示。伤寒沙 门菌不能分解乳糖，以“-”表示。
由此使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）
由淡绿转为深蓝，此为枸橼酸盐利用试验阳性。
吲哚试验（靛基质）
含有色氨酸酶的细菌（如大肠埃希菌、变形杆菌等）
可分解色氨酸生成吲哚（靛基质），若加入对二甲基氨基
苯甲醛，与吲哚结合形成玫瑰吲哚，呈红色，称吲哚试验
阳性。
硫化氢试验
变形杆菌、乙型副伤寒沙门菌等能分解含硫氨基酸如
实验四
常用的生化反应
实验目的
• 认识染色方法鉴别细菌的局限性 • 掌握几种常用生化反应的原理、方法和结果判断
实验菌种
• 产气肠杆菌（Enterobacter • 普通变形杆菌（Proteus vulgaris） • 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）