生物化学课件 第四章 核酸杂交
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核酸分子杂交课件
探针标记
将标记物（如放射性同位素、荧 光染料等）连接到探针上，以便 于后续的信号检测。
杂交反应
预杂交
将样品和探针在一定温度和盐浓度下 进行预杂交，使探针与非目的序列的 核酸分子结合，排除非特异性结合。
杂交
将预杂交后的样品和探针进行杂交， 使探针与目的序列的核酸分子结合。
信号检测
放射自显影
对于放射性标记的探针， 可以通过放射自显影技术 检测杂交信号。
背景干扰
由于非特异性结合或交叉杂交的存在，可 能会导致背景干扰，影响结果的判断。
A 对探针质量要求高
探针的长度、纯度、标记方式等因 素都会影响杂交的效率和特异性， 因此需要高质量的探针才能获得可
靠的结果。
B
C
D
实验条件要求高
核酸分子杂交实验需要严格的实验条件， 如温度、盐浓度等，操作不当会影响实验 结果。
02
核酸分子杂交的基本步 骤
样品制备
01
02
03
细胞或组织破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞或组织，释放出核酸 分子。
核酸提取
利用离心、沉淀、洗涤等 手段去除细胞碎片和蛋白 质等杂质，提取出核酸。
核酸变性
通过加热或化学试剂使核 酸双螺旋结构解开，形成 单链。
探针制备
目的基因克隆
将目的基因从生物体中克隆到载 体中，形成重组DNA分子。
生物信息学
利用生物信息学技术对核酸分子杂交 数据进行深入分析，挖掘更多有价值 的信息。
自动化与高通量技术
自动化技术
通过自动化技术实现核酸分子杂 交的快速、准确和高效检测，提
高检测效率。
高通量技术
利用高通量技术实现大规模样本 的同时检测，提高检测通量。
将标记物（如放射性同位素、荧 光染料等）连接到探针上，以便 于后续的信号检测。
杂交反应
预杂交
将样品和探针在一定温度和盐浓度下 进行预杂交，使探针与非目的序列的 核酸分子结合，排除非特异性结合。
杂交
将预杂交后的样品和探针进行杂交， 使探针与目的序列的核酸分子结合。
信号检测
放射自显影
对于放射性标记的探针， 可以通过放射自显影技术 检测杂交信号。
背景干扰
由于非特异性结合或交叉杂交的存在，可 能会导致背景干扰，影响结果的判断。
A 对探针质量要求高
探针的长度、纯度、标记方式等因 素都会影响杂交的效率和特异性， 因此需要高质量的探针才能获得可
靠的结果。
B
C
D
实验条件要求高
核酸分子杂交实验需要严格的实验条件， 如温度、盐浓度等，操作不当会影响实验 结果。
02
核酸分子杂交的基本步 骤
样品制备
01
02
03
细胞或组织破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞或组织，释放出核酸 分子。
核酸提取
利用离心、沉淀、洗涤等 手段去除细胞碎片和蛋白 质等杂质，提取出核酸。
核酸变性
通过加热或化学试剂使核 酸双螺旋结构解开，形成 单链。
探针制备
目的基因克隆
将目的基因从生物体中克隆到载 体中，形成重组DNA分子。
生物信息学
利用生物信息学技术对核酸分子杂交 数据进行深入分析，挖掘更多有价值 的信息。
自动化与高通量技术
自动化技术
通过自动化技术实现核酸分子杂 交的快速、准确和高效检测，提
高检测效率。
高通量技术
利用高通量技术实现大规模样本 的同时检测，提高检测通量。
[课件]核酸分子杂交与应用PPT
![[课件]核酸分子杂交与应用PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/1956ac56f46527d3240ce0db.png)
2018/12/6 16
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
2018/12/6
2
2018/12/6
3
核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
2018/12/6 4
2018/12/6
5
变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
2018/12/6
6
2018/12/6பைடு நூலகம்
7
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
2018/12/6
11
3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
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核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
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变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
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影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
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3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
生物化学ppt核酸
克隆技术
克隆技术是指通过无性繁殖的方 式复制生物体的技术，包括动物
克隆和植物克隆等。
克隆技术在畜牧业、农业和医学 等领域有着广泛的应用，如克隆 动物、转基因植物和组织工程等。
克隆技术的关键在于细胞核移植 和胚胎发育，目前已经成功实现 了哺乳动物的克隆，但技术难度 和伦理问题仍需进一步探讨。
基因治疗与基因诊断
04
核酸的功能
DNA的功能
遗传信息的储存
DNA是遗传信息的载体，通过碱基配对原则，将遗传信息从亲代 传递给子代。
基因表达的调控
DNA中的基因通过转录和翻译过程，控制蛋白质的合成，进而调 控生物体的各种功能。
细胞分裂与增殖的指导
DNA中的遗传信息指导细胞分裂、增殖和分化，维持生物体的正 常生长和发育。
RNA在蛋白质合成过程中起到模板和 催化作用，通过与核糖体的结合指导 氨基酸的合成。
DNA和RNA的比较
DNA和RNA都是核酸， 是生物体的遗传物质， 但它们的结构和功能有
所不同。
01
RNA主要存在于细胞质 中，负责传递遗传信息 并参与蛋白质的合成。
03
DNA中的碱基是A、T、 G、C，而RNA中的碱 基是A、U、G、C。
自然选择与进化
自然选择是指自然界对生物的 选择作用，适者生存，不适者
被淘汰。
自然选择是生物进化的主要动 力，通过自然选择的作用，使 适应环境的生物得以生存和繁
衍，并逐渐形成新的物种。
自然选择具有定向性，即有利 于生存和繁衍的变异会被保留 下来，不利于生存和繁衍的变 异则被淘汰。
自然选择的结果是生物多样性 的形成和生物的不断进化。
03
核酸的研究具有广泛的应用价值
通过对核酸的研究，可以深入了解生物体的生长、发育和代谢等过程，
《核酸分子杂交技术》课件
核酸分子杂交原理
互补配对
核酸分子通过互补配对原理相 结合，碱基之间形成稳定的氢 键。
熔解
通过改变温度，使两条核酸分 子解开，断裂氢键，分离出单 链。
探针结合
利用互补配对原理，核酸探针 与目标核酸结合，形成稳定的 双链结构。
核酸探针的制备
1
设计探针序列
根据目标核酸序列设计探针，考虑碱基
合成探针
2
互补性和特异性。
《核酸分子杂交技术》 PPT课件
核酸分子杂交技术是一种重要的实验技术，能够研究DNA和RNA的结构、功 能以及相互作用。让我们一起探索这门神奇的科学吧！
什么是核酸分子杂交技术
1 定义
核酸分子杂交技术是指通过核酸探针与目标 核酸的互补碱基配对作用实现的一种检测、 分离和研究方法。
2 原理
该技术利用核酸分子的碱基互补性特点，使 探针与目标核酸发生相互结合，从而实现目 标分子的检测和定位。
利用合成技术合成目标序列的核酸探针。
3
标记探针
通过化学反应或酶标记等方法，将探针 标记上荧光剂或放射性示踪剂。
应用领域
遗传研究
核酸分子杂交技术在遗传研究中 起到了至关重要的作用，帮助人 们了解遗传信息的传递和变异。
医学诊断
通过核酸分子杂交技术，可以检 测病原体和基因突变，用于疾病 的早期诊断和治疗。
法医分析
核酸分子杂交技术用于法医学领 域的DNA鉴定和犯罪现场的分析， 提供了重要的法律证据。
核酸分子杂交技术的优势
1 高度特异性
通过合理设计探针序列， 核酸分子杂交技术能够高 度特异地检测目标核酸。
2 灵敏度高
核酸分子杂交技的特点。
3 广泛应用
核酸分子杂交技术在基础 研究、生物医学、农业科 技等领域均有广泛应用。
5.核酸杂交PPT课件
2. cDNA探针：是互补与mRNA的DNA分子，理想的 探针，但一般不易获得。
3. RNA探针：注意PolyA，本身易降解。多用于 基因转录研究。
4. 寡核苷酸探针：人工合成 5. 注意：长度；（G+C）%；发卡结构；碱基重
复；特异性
2021/3/10
10
2021/3/10
11
探针的标记
标记物的要求： 高灵敏度 不影响杂交 检测方法灵敏，特异，无污染，价格廉 易操作，稳定性好
2021/3/10
22
2021/3/10
23
Southren blotting意义
主要用于基因组中 特定基因的定性和定量检测 克隆基因的酶切图谱、基因突变分析 基因重排，丢失等分析
2021/3/10
24
Northren blotting
RNA（mRNA）提取 限制性内切酶消化 变性凝胶电泳分离RNA片段 转膜 预杂交 杂交 放射自显影
2021/3/10
12
探针的放射性同位素标记
1.缺口平移法（nick translation）
2.随机引物法（random priming）
3.DNA的5‘末端标记法
5’----GTGCTGATGACCGTA -----3’
碱性磷酸酶切除
5’----TGCTGATGACCGTA -----3’
17
2021/3/10
18
2021/3/10
19
常用分子杂交技术
液相分子杂交
固相分子杂交
支持物（载体）
硝酸纤维素膜
尼龙膜
化学激活膜
乳胶颗粒
磁珠
微空板
2021/3/10
20
Southern blotting原理
3. RNA探针：注意PolyA，本身易降解。多用于 基因转录研究。
4. 寡核苷酸探针：人工合成 5. 注意：长度；（G+C）%；发卡结构；碱基重
复；特异性
2021/3/10
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探针的标记
标记物的要求： 高灵敏度 不影响杂交 检测方法灵敏，特异，无污染，价格廉 易操作，稳定性好
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Southren blotting意义
主要用于基因组中 特定基因的定性和定量检测 克隆基因的酶切图谱、基因突变分析 基因重排，丢失等分析
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Northren blotting
RNA（mRNA）提取 限制性内切酶消化 变性凝胶电泳分离RNA片段 转膜 预杂交 杂交 放射自显影
2021/3/10
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探针的放射性同位素标记
1.缺口平移法（nick translation）
2.随机引物法（random priming）
3.DNA的5‘末端标记法
5’----GTGCTGATGACCGTA -----3’
碱性磷酸酶切除
5’----TGCTGATGACCGTA -----3’
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常用分子杂交技术
液相分子杂交
固相分子杂交
支持物（载体）
硝酸纤维素膜
尼龙膜
化学激活膜
乳胶颗粒
磁珠
微空板
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Southern blotting原理
核酸杂交课件
利用Klenow DNA聚合酶标记3’-端DNA探针
2）T4噬菌体多核苷酸激酶标记法 （polynucleofide kinase，PNK)
T4噬菌体多核苷酸激酶标记法示意图
（4）聚合酶链反应（PCR）标记DNA探针 （5）同位素标记RNA探针
1）SP6 RNA聚合酶体系 2）成对启动子系列
RNA探针标记
检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 DNA分子 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 RNA分子 检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放 的DNA分子 检测固定在膜上的DNA或RNA分子
检测细胞或组织中的DNA或RNA分子
一、Southern印迹杂交
[原理]
Sourthern印迹杂交是分析DNA的一种方 法，从细胞或组织中提取高分子量的DNA，用 一种或多种限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝 胶电泳按大小分离所得片段，从凝胶中按原来 位置和顺序吸印转移到固相支持膜（硝酸纤维 素膜或尼龙膜）上，然后再与同位素或非同位 素标记探针杂交，最后经放射自显影或显色反 应进行检测。
杂交过程中须注意的问题：
（1）探针的浓度 （2）探针的长度 ：50～100bp （3）杂交的温度和时间：Tm-25℃，3h
5.杂交后处理
洗涤的条件包括盐溶液的浓度、温度、 洗涤次数和时间，一般遵循的原则是盐溶液 浓度由高到低而温度由低到高。值得注意的 是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥，否则 反而会增强背景染色。
2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
组织细胞中的核酸都以核蛋白复合体 的形式存在于细胞浆或细胞核中，经过固 定过程后，胞浆或胞核内生物大分子交联 形成网络结构，影响探针的穿透和杂交体 的形成。因此需要使用去污剂和蛋白酶对 组织细胞蛋白进行水解以去除核酸表面蛋 白。
2）T4噬菌体多核苷酸激酶标记法 （polynucleofide kinase，PNK)
T4噬菌体多核苷酸激酶标记法示意图
（4）聚合酶链反应（PCR）标记DNA探针 （5）同位素标记RNA探针
1）SP6 RNA聚合酶体系 2）成对启动子系列
RNA探针标记
检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 DNA分子 检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的 RNA分子 检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放 的DNA分子 检测固定在膜上的DNA或RNA分子
检测细胞或组织中的DNA或RNA分子
一、Southern印迹杂交
[原理]
Sourthern印迹杂交是分析DNA的一种方 法，从细胞或组织中提取高分子量的DNA，用 一种或多种限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝 胶电泳按大小分离所得片段，从凝胶中按原来 位置和顺序吸印转移到固相支持膜（硝酸纤维 素膜或尼龙膜）上，然后再与同位素或非同位 素标记探针杂交，最后经放射自显影或显色反 应进行检测。
杂交过程中须注意的问题：
（1）探针的浓度 （2）探针的长度 ：50～100bp （3）杂交的温度和时间：Tm-25℃，3h
5.杂交后处理
洗涤的条件包括盐溶液的浓度、温度、 洗涤次数和时间，一般遵循的原则是盐溶液 浓度由高到低而温度由低到高。值得注意的 是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥，否则 反而会增强背景染色。
2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
组织细胞中的核酸都以核蛋白复合体 的形式存在于细胞浆或细胞核中，经过固 定过程后，胞浆或胞核内生物大分子交联 形成网络结构，影响探针的穿透和杂交体 的形成。因此需要使用去污剂和蛋白酶对 组织细胞蛋白进行水解以去除核酸表面蛋 白。
《核酸分子杂交》课件
核酸分子杂交的历史背景
01
1952年，S.E.Luria和 M.Delbrück在研究噬菌体的变 异性时，首次提出了分子杂交 的概念。
02
1961年，R.W.Powell和 E.M.Maxam将分子杂交技术应 用于DNA的化学分析。
03
1973年，J.K.Hershey和 M.Chase用分子杂交技术成功 地检测到了噬菌体PSU-13的基 因组DNA。
利用纳米材料如金纳米颗粒、碳纳米 管等，可以实现核酸分子的高效富集 和信号放大，提高杂交信号的强度和 特异性。
在核酸分子杂交中，纳米技术可以用 于构建高灵敏度的传感器和检测器， 实现对基因组中特定序列的快速、准 确检测。
生物信息学在核酸分子杂交中的应用
生物信息学是利用计算机科学和统计学 的方法，对生物学数据进行分析和解读
洗脱
去除未结合的核酸分子，留下 与目标序列结合的核酸分子。
检测
对杂交产物进行检测，确定目 标序列的存在。
核酸分子杂交的原理
互补性
通过碱基互补配对原则，使单链核酸分子与目标 序列结合形成双链结构。
特异性
由于碱基互补配对原则，使得核酸分子杂交具有 高度的特异性。
温度依赖性
通过调节温度，可以控制核酸分子的变性和复性 ，从而控制杂交过程。
比较转录组
利用核酸分子杂交技术，可以对不同 条件下的转录组进行比较，揭示基因 表达的差异和变化规律。
基因突变检测
突变筛查
通过核酸分子杂交技术，可以对基因进行突变筛查，为遗传性疾病的诊断和治 疗提供依据。
突变定位
利用核酸分子杂交技术，可以快速、准确地定位突变位点，为突变机制和功能 研究提供帮助。
基因组测序与比较基因组学
《核酸分子杂交》课件
实验步骤
1
样品制备
获得需要研究的核酸样品并进行提取和
合成探针和标记物
2
纯化。
设计和合成与目标核酸互补的DNA或
RNA探针，并标记探针以便检测。
3
杂交反应
将待测核酸样品与探针和标记物进行杂
杂交产物的检测和分析
4
交反应，使它们结合形成杂交分子。
通过不同的检测方法对杂交产物进行分 析和表征，如凝胶电泳、放射性测量等。
核酸杂交的种类
DNA-DNA杂交
两段DNA互相结合形成双链 DNA。
RNA-DNA杂交
RNA和DNA互相结合形成 RNA-DNA杂交分子。
RNA-RNA杂交
两段RNA分子互相结合形成 双链RNA。
应用
检测病原微生物、基因 突变、肿瘤等
核酸分子杂交可用于诊断病 原微生物感染、检测基因突 变和肿瘤相关标记物。
《核酸分子杂交》PPT课 件
核酸分子杂交是指不同DNA或RNA进行结合形成杂交分子的过程。它在分析 核酸序列的同源性和差异性、检测特定序列的核酸以及研究DNA和RNA的结 构、功能和互动关系方面非常重要。
定义
核酸分子杂交是指来自不同DNA或RNA的单链或双链核酸互相结合形成杂交 分子的过程。
重要性
研究基因表达、基因调 控等
通过核酸分子杂交，我们可 以研究基因的表达模式和调 控机制。
设计新型药物和检测方 法
利用核酸分子杂交技术，可 以设计基于核酸的新型药物 和高灵DNA和RNA的结
性和差异性
核酸
构、功能和互动关系
核酸分子杂交可用于比较 DNA或RNA序列，帮助我 们了解核酸之间的相似性 和差异性。
通过配对互补的探针和标 记物，核酸分子杂交可用 于检测具有特定序列的核 酸分子。
《核酸的分子杂交》PPT课件
亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
精选课件ppt
Home 6
二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
精选课件ppt
7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
精选课件ppt
22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
精选课件ppt
12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
精选课件ppt
2
精选课件ppt
3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
精选课件ppt
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
精选课件ppt
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二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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2
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一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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核酸的杂交的概念
核酸的杂交的概念核酸的杂交是指两个单链核酸通过互补碱基配对形成双链结构的过程。
其中，DNA-DNA杂交一般指的是两个DNA分子之间的互补配对，而RNA-DNA杂交则是RNA分子和DNA分子之间的互补配对。
核酸的杂交是基于DNA或RNA的碱基互补配对原则进行的。
DNA的四种碱基包括腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C），而RNA则是用尿嘧啶（U）代替胸腺嘧啶（T）。
两个核酸分子之间的杂交是通过这些互补的碱基配对进行的，即A与T（或U）之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。
这种互补特性使得杂交后的双链结构具有较好的稳定性。
核酸的杂交在生物学研究中有着广泛的应用。
一方面，杂交可以用于核酸的检测和分析。
例如，在基因诊断中，可以通过分子探针与待测样品中的特定DNA序列杂交来检测目标序列的存在与否。
此外，在基因组学研究中，可以利用杂交技术对不同物种的基因组进行比较，从而揭示它们之间的相似性和差异性。
另一方面，核酸的杂交还可以用于分子克隆和基因表达调控的研究。
在分子克隆中，通过将目标DNA序列与载体DNA杂交，可以将目标序列导入到载体中，从而实现重组DNA的构建。
而在基因表达调控研究中，可以通过杂交技术来检测RNA的转录水平，以及分析RNA的亚细胞定位和运输。
此外，杂交技术还可以用于核酸序列的测序和基因组的拼装。
通过将待测DNA片段与已知序列的探针进行杂交，可以确定待测片段的序列。
同时，可以利用多个重叠片段的杂交信息进行基因组的拼装，从而得到完整的基因组序列。
总结起来，核酸的杂交是一种重要的实验技术，它可以用于核酸的检测、分析和克隆，以及基因表达调控和基因组研究等方面。
核酸的杂交原理简单而有效，为生物学研究提供了重要的工具和方法。
随着技术的不断发展，杂交技术在生物学研究中的应用将会更加广泛和深入。
《核酸分子杂交》PPT课件
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一、概念：
1、分子杂交〔hybridization) :有一定同源性的两条 核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱 基互补退火形成稳定的双链分子的过程 。
3、转膜的方式：
将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:
(1)毛细管转移。本方法由Southern创造，故又称为 Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单, 不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信 号较弱。
(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼 龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用，可直 接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度 难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般 是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上， 再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流 下，洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优 点是快速，在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常 琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得 到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小 心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛 细转移要高。
2、固体支持物的种类：
带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、PVDF膜
尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型； 硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格 最廉价；PVDF膜介于二者之间。
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一、概念：
1、分子杂交〔hybridization) :有一定同源性的两条 核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱 基互补退火形成稳定的双链分子的过程 。
3、转膜的方式：
将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:
(1)毛细管转移。本方法由Southern创造，故又称为 Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单, 不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信 号较弱。
(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼 龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用，可直 接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度 难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般 是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上， 再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流 下，洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优 点是快速，在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常 琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得 到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小 心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛 细转移要高。
2、固体支持物的种类：
带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、PVDF膜
尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型； 硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格 最廉价；PVDF膜介于二者之间。
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单链DNA的紫外吸收比双链DNA高40%，所以 变性导致DNA的紫外吸收增加，称为增色效 应（hyperchromic effect）。 在热变性过程中，增色效应达一半时即双螺 旋被解开一半时的温度称为解链温度(Tm)。
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途
印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:
掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应
掌握核酸杂交的基本原理
熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印
核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针
探针的概念 探针的种类和选择
探针的标记
一、探针(probe)的概念
一小段用染料(同位素、生物素或荧光)标 记的(末端或全链)已知序列的多聚核苷酸， 与固定在膜(NC、PVDF或尼龙）上的核苷酸 结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 简言之，探针指已知序列的标记核酸片 段。
一、固相支持物
硝酸纤维素膜 尼龙膜 活化滤纸二、印 Nhomakorabea方法
毛细管虹吸转移法
真空转移法
电转移法
三、印迹杂交过程
样品制备
电泳分离
杂交 预杂交 印迹
洗膜
分析
第四节 常用核酸分子杂交技术
DNA印迹法
RNA印迹法
斑点杂交法
原位杂交
一、 DNA印迹技术 (Southern blotting)
在化学和物理因素的影响下,维系核酸二 级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏,DNA双螺 旋解旋成为单链的过程. DNA变性后，理化性质和生物活性丧失。
（一）引起核酸变性的因素：
物理因素：热（高温） 化学因素：酸、碱； 变性剂（如尿素、胍）； 有机溶剂（如乙醇、丙酮）
（二）变性温度（或解链温度，Tm):
琼脂糖电泳分离待测DNA 中和 预杂交 结果分析
Southern blotting 的步骤：
DNA的纯化、酶切
凝胶电泳分离DNA片段
DNA变性 转膜、固定 制备探针 预杂交、杂交
检测
分析
②
①
③
DNA分子杂交实验
目录
放 射 自 显 影 照 片
二 、RNA印迹技术 (Northern blotting)
二、探针(probe)的种类
基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 人工合成的寡核苷酸探针（ASO）
探针种类
基因组探针：用基因克隆技术分离获得的特异 的DNA序列。 RNA探针：特异DNA序列在体外转录出的RNA序 列。 cDNA探针：以特异mRNA序列为模板，在逆转录 酶催化下合成的cDNA序列。
埃德温· 迈勒· 萨瑟恩
1975年,Southern印迹杂交（Southern blot）由英国人埃德温· 迈勒· 萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）创建。
一、 DNA印迹技术 (Southern blotting)
两个主要过程： 一是印迹（blotting） 二是分子杂交
主要步骤: RE酶切待测DNA 片段 使DNA变性 杂交 放射自显影
影响复性速度的因素
（1）DNA大小：片段越小，复性越快；
反之亦然。
（2）离子强度：增加盐浓度可加速复性。
（3）DNA浓度：浓度越大，复性越快。
（4）若变性不彻底，复性很快。 （5）序列越简单，复性越快。
DNA的变性和复性
三、核酸分子杂交
(nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链 分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间 形成杂化双链(heteroduplex) 。
（4）变性剂：干扰碱基堆积力和氢键的
形成，降低Tm值。
二、核酸的复性(renaturation)
变性的DNA两条互补单链,在适当条件下重新
缔合成双链的过程，又叫退火。 DNA复性后，理化性质和部分生物活性恢复。
复性导致DNA的紫外吸收降低，称为减色效应 （hypochromic effect）。 DNA的最适复性温度（Tor）比解链温度低 20℃ -25℃
体外标记方法：
• 酶标记法 • 化学标记法
几种探针标记方法：
切口平移法（nick translation)
随机引物法 （random priming）
DNA的5’末端标记
PCR标记法
第三节 印迹杂交技术
印迹指将凝胶中的待测核酸转移到固相膜上。 印迹杂交技术是将通过凝胶电泳分离的待测 核酸转移并结合到固相支持物上，然后与探针 进行杂交并分析。 印迹杂交技术以固相杂交为基础.
分子基础：核酸的变性和复性 杂交可以发生在 DNA/DNA、DNA/RNA、 RNA/RNA、以及人工合成的寡核苷酸单链与
DNA或RNA之间。
杂交可分为：液相杂交和固相杂交
液相杂交: 进行杂交的核酸都在杂交液中 特点: 杂交速度快，但误差较高 固相杂交: 将参加反应的核酸先固定在固相支持 物上，与杂交液中的游离探针进行杂交
泡胶，洗去变性剂 转膜、固定 制备探针 预杂交、杂交
检测
分析
与DNA印迹的区别：
DNA印迹是先电泳后变性、转移；
RNA印迹是先变性后电泳、转移，且不能
采用碱变性
三、斑点杂交法(dot blotting)
直接将样品点在膜上 固定 制备探针
预杂交、杂交
检测 分析 特点: 简单,但特异性差.
四、原位杂交法
第四章
核酸分子杂交
nucleic acid hybridization
本章内容
第一节 第二节 第三节 第四节
核酸分子杂交的基本原理 核酸探针 印迹杂交技术 常用的核酸分子杂交技术
第一节
核酸分子杂交的基本原理
核酸变性 核酸复性
核酸杂交
一、核酸的变性(denaturation)
将RNA样品完全变性，通过琼脂糖凝胶电泳按 分子大小分离，然后转移到固相膜上，固定后与探 针进行杂交。 用于RNA的定性定量分析。主要用于检测某一
组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可以
比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。
Northern blotting 的步骤
RNA的纯化
变性、凝胶电泳
寡核苷酸探针（ASO）：人工合成已知序列的 寡核苷酸片段。
三、探针的标记物
（一）放射性同位素标记物：
32P、 3H、 35S
（二）非放射性标记物：
•
• • •
生物素（biotin）
地高辛（digoxigenin ） 荧光素（ fluorescein ） 酶（碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶）
四、探针的标记方法
（三）影响Tm值的因素：
（1）碱基组成：Tm=69.3+0.41(G+C)%
（2）分子大小: （3）离子强度： （3）pH：5～9
主要用于基因组DNA的定性和定量分析(特定序列 定位)，亦可分析重组质粒和噬菌体。
方法：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制 性内切酶消化的DNA片段，将胶上的 DNA变性并在原位将单链DNA片段转移 至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤 或者紫外线照射固定，再与相对应结构 的标记探针进行杂交，通过显色，检测 特定DNA分子的含量。
迹/Northern印迹的步骤及用途
印迹杂交的过程
探针的种类、常用的几种酶促标记方法
小测验
1. PCR的基本原理和步骤。 2. Southern blotting的基本原理、过 程和用途。
44
(in situ hybridization)
在细胞保持基本形态的情况下将探针 注入细胞内与DNA或RNA杂交，杂交反应在 载物片上的细胞内进行。
DNA 点阵
本章重点:
掌握以下概念: 核酸分子杂交;探针;印迹；
核酸的变性/复性;Tm;增色效应/减色效应
掌握核酸杂交的基本原理
熟悉常用的核酸分子杂交技术及Southern 印
核酸分子杂交
复性
RNA
DNA
第二节
核 酸 探 针
探针的概念 探针的种类和选择
探针的标记
一、探针(probe)的概念
一小段用染料(同位素、生物素或荧光)标 记的(末端或全链)已知序列的多聚核苷酸， 与固定在膜(NC、PVDF或尼龙）上的核苷酸 结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 简言之，探针指已知序列的标记核酸片 段。
一、固相支持物
硝酸纤维素膜 尼龙膜 活化滤纸二、印 Nhomakorabea方法
毛细管虹吸转移法
真空转移法
电转移法
三、印迹杂交过程
样品制备
电泳分离
杂交 预杂交 印迹
洗膜
分析
第四节 常用核酸分子杂交技术
DNA印迹法
RNA印迹法
斑点杂交法
原位杂交
一、 DNA印迹技术 (Southern blotting)
在化学和物理因素的影响下,维系核酸二 级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏,DNA双螺 旋解旋成为单链的过程. DNA变性后，理化性质和生物活性丧失。
（一）引起核酸变性的因素：
物理因素：热（高温） 化学因素：酸、碱； 变性剂（如尿素、胍）； 有机溶剂（如乙醇、丙酮）
（二）变性温度（或解链温度，Tm):
琼脂糖电泳分离待测DNA 中和 预杂交 结果分析
Southern blotting 的步骤：
DNA的纯化、酶切
凝胶电泳分离DNA片段
DNA变性 转膜、固定 制备探针 预杂交、杂交
检测
分析
②
①
③
DNA分子杂交实验
目录
放 射 自 显 影 照 片
二 、RNA印迹技术 (Northern blotting)
二、探针(probe)的种类
基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 人工合成的寡核苷酸探针（ASO）
探针种类
基因组探针：用基因克隆技术分离获得的特异 的DNA序列。 RNA探针：特异DNA序列在体外转录出的RNA序 列。 cDNA探针：以特异mRNA序列为模板，在逆转录 酶催化下合成的cDNA序列。
埃德温· 迈勒· 萨瑟恩
1975年,Southern印迹杂交（Southern blot）由英国人埃德温· 迈勒· 萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）创建。
一、 DNA印迹技术 (Southern blotting)
两个主要过程： 一是印迹（blotting） 二是分子杂交
主要步骤: RE酶切待测DNA 片段 使DNA变性 杂交 放射自显影
影响复性速度的因素
（1）DNA大小：片段越小，复性越快；
反之亦然。
（2）离子强度：增加盐浓度可加速复性。
（3）DNA浓度：浓度越大，复性越快。
（4）若变性不彻底，复性很快。 （5）序列越简单，复性越快。
DNA的变性和复性
三、核酸分子杂交
(nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链 分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间 形成杂化双链(heteroduplex) 。
（4）变性剂：干扰碱基堆积力和氢键的
形成，降低Tm值。
二、核酸的复性(renaturation)
变性的DNA两条互补单链,在适当条件下重新
缔合成双链的过程，又叫退火。 DNA复性后，理化性质和部分生物活性恢复。
复性导致DNA的紫外吸收降低，称为减色效应 （hypochromic effect）。 DNA的最适复性温度（Tor）比解链温度低 20℃ -25℃
体外标记方法：
• 酶标记法 • 化学标记法
几种探针标记方法：
切口平移法（nick translation)
随机引物法 （random priming）
DNA的5’末端标记
PCR标记法
第三节 印迹杂交技术
印迹指将凝胶中的待测核酸转移到固相膜上。 印迹杂交技术是将通过凝胶电泳分离的待测 核酸转移并结合到固相支持物上，然后与探针 进行杂交并分析。 印迹杂交技术以固相杂交为基础.
分子基础：核酸的变性和复性 杂交可以发生在 DNA/DNA、DNA/RNA、 RNA/RNA、以及人工合成的寡核苷酸单链与
DNA或RNA之间。
杂交可分为：液相杂交和固相杂交
液相杂交: 进行杂交的核酸都在杂交液中 特点: 杂交速度快，但误差较高 固相杂交: 将参加反应的核酸先固定在固相支持 物上，与杂交液中的游离探针进行杂交
泡胶，洗去变性剂 转膜、固定 制备探针 预杂交、杂交
检测
分析
与DNA印迹的区别：
DNA印迹是先电泳后变性、转移；
RNA印迹是先变性后电泳、转移，且不能
采用碱变性
三、斑点杂交法(dot blotting)
直接将样品点在膜上 固定 制备探针
预杂交、杂交
检测 分析 特点: 简单,但特异性差.
四、原位杂交法
第四章
核酸分子杂交
nucleic acid hybridization
本章内容
第一节 第二节 第三节 第四节
核酸分子杂交的基本原理 核酸探针 印迹杂交技术 常用的核酸分子杂交技术
第一节
核酸分子杂交的基本原理
核酸变性 核酸复性
核酸杂交
一、核酸的变性(denaturation)
将RNA样品完全变性，通过琼脂糖凝胶电泳按 分子大小分离，然后转移到固相膜上，固定后与探 针进行杂交。 用于RNA的定性定量分析。主要用于检测某一
组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可以
比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。
Northern blotting 的步骤
RNA的纯化
变性、凝胶电泳
寡核苷酸探针（ASO）：人工合成已知序列的 寡核苷酸片段。
三、探针的标记物
（一）放射性同位素标记物：
32P、 3H、 35S
（二）非放射性标记物：
•
• • •
生物素（biotin）
地高辛（digoxigenin ） 荧光素（ fluorescein ） 酶（碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶）
四、探针的标记方法