pH值对赖氨酸保护作用影响的研究

pH值对赖氨酸保护作用影响的研究1贺洪1、2，刘慧敏2，朱泽瑞2，印大中21 湖南师范大学体育学院，湖南长沙（410012）2 湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙（410081）摘要:用紫外吸收研究力竭运动后大鼠血清中赖氨酸（lysine）对丙二醛（MDA）的清除。

通过试管反应发现，在适宜的浓度和pH值下，赖氨酸能与MDA结合形成类似尿液的成分；乳酸升高所营造的微酸性环境能促使这一反应的进行。

提示：剧烈运动前后适时适量饮用赖氨酸能抵抗氧应激代谢产物的生物毒性作用，保护机体免受伤害。

关键词：赖氨酸，丙二醛，运动保护脂质过氧化中间产物MDA、HNE（4-羟基壬烯醛）等不饱和醛酮具有生物活性，能与含氮生物分子发生交联，使动物组织硬化，造成伤害[1-6]。

所以MDA的代谢途径早就成为科学家们研究的热点。

在小鼠和人类的尿液中寻找MDA的分泌物，发现MDA在尿液中主要是以与赖氨酸结合的两种物质的形式—N-ε-2-丙烯醛赖氨酸和N-α-乙酰酯存在[7]。

这就表明在体内MDA主要是作用于蛋白质中的赖氨酸残基。

本文采用体外试管实验考察赖氨酸和MDA的反应产物以及pH值对反应速率的影响。

1. 材料和方法1.1 试剂≧；盐酸赖超纯水，由Milli－Q系统纯化（Millipore China Limited), 电导率18.2MΩ.cm氨酸购于长沙瑞晶生物经营部；TMP购于sigma公司；其他均为常规试剂。

1.2 试剂的配制1.2.1 磷酸缓冲液（PBS）取0.2 mol/L Na2HPO4.12H2O和0.2 mol/L NaH2PO4.2H2O1配制pH7.4、7.2、7.0、6.8的PBS缓冲液。

1.2.2 16 mmol/L赖氨酸称取四份赖氨酸0.2952 g，于少量超纯水中溶解，用6 mol/L NaOH 调节pH值至7.4、7.2、7.0、6.8。

以相应pH值的PBS溶液定容至100 ml。

1.2.3 1 mmol/L MDA[8]用四个50 mL容量瓶分别加1 mol /L HCl 2 mL，再加0.00845 mL TMP，于40℃水浴溶解，精确计时2.5 min后取出，分别用6 mol/L的NaOH调pH至7.4、7.2、7.0、6.8。

最后用相应pH值的PBS溶液定容至50 mL。

1.3 仪器设备PT电动跑台（浙江省杭州立泰科技有限公司）；Lambda Bio45紫外分光光度仪（美国Perkin Elmer公司）；D－37520型高速冷冻离心机（德国Heraeus Biofuge公司）；Molli-Q Academic A 10超纯水系统（Millipore China Limited）；Mettler Toledo A E200分析天平（上海梅特勒—托利多有限公司）。

1.4 MDA和赖氨酸的试管反应1.4.1测定赖氨酸、MDA、力竭大鼠尿液和赖氨酸与MDA反应产物的紫外吸收光谱图将1 mmol/L的赖氨酸、0.01 mmol/L的MDA、即刻取得的力竭大鼠的尿液、16 mmol/L的赖氨1本课题得到湖南师范大学体育学院课题经费资助（课题号：JS0603）酸与1 mmol/L的MDA在6 h的反应产物分别测定吸光值。

1.4.2不同浓度的赖氨酸和１mmol/L的 MDA在pH=7.4的反应将１mmol/L的赖氨酸与１mmol/L、２mmol/L、４mmol/L、８mmol/L、16 mmol/L的MDA混合，放入37℃孵育。

分别在0 h, 1.5 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 96 h时测定吸光值。

1.4.3不同浓度的MDA和１mmol/L的赖氨酸在pH=7.4的反应将１mmol/L的MDA与１mmol/L、２mmol/L、４mmol/L、８mmol/L、16 mmol/L的赖氨酸混合，放入37℃孵育。

分别在0 h, 1.5 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 96 h时测定吸光值。

1.4.4 MDA与赖氨酸在不同pH值下的反应取pH值为7.4，7.2，7.0，6.8的16 mmol/L 赖氨酸溶液各1.5 mL和相应pH值的1 mmol/L MDA溶液各1.5 mL混合。

放入37℃孵育，分别在0, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h, 15 h, 18 h, 21 h, 24 h时测定吸光值。

2. 结果与分析2.1赖氨酸与MDA试管反应产物的紫外吸收光谱分析2.1.1 赖氨酸、MDA、力竭大鼠尿液和赖氨酸与MDA反应产物的紫外吸收光谱图（图1）图1四种物质的紫外可见吸收光谱图Fig.1 spectral photometry of four kinds of matter从图1可知，赖氨酸没有紫外吸收峰，MDA在267 nm处有典型的紫外吸收峰，而赖氨酸与MDA的反应产物却在400 nm附近产生了一个新的紫外吸收峰，与力竭大鼠的尿液产生的紫外吸收峰十分靠近。

这说明，赖氨酸与MDA发生反应生成了新的物质。

并且，这种新物质与力竭大鼠排出的尿液中的某些成分十分相似。

2.1.2 不同浓度赖氨酸与MDA反应产物的紫外吸收光谱分析将赖氨酸与1 mmol/LMDA反应，按赖氨酸与MDA的浓度比值分别为1:1、2:1、4:1、8:1、16:1、32:1进行，反应48 h在400nm处检测反应生成物的紫外吸收峰，结果如图2A。

将不同浓度的赖氨酸与MDA反应，测定不同时间反应生成物的紫外吸收峰值，结果如图2B。

用16 mmol/L的赖氨酸与1 mmol/L的MDA反应，检测不同反应时间（1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和96 h）生成物的紫外吸收峰，结果如图2C。

在48 h内，赖氨酸浓度越高，反应生成物的紫外吸收峰值越高（图2A），其中32:1与16:1两条曲线几乎重合。

这说明，16:1的浓度比与MDA的反应已基本完成，增加赖氨酸浓度对反应的影响不太大。

赖氨酸浓度和反应时间与紫外吸收峰值均呈正相关（图2B）。

在浓度为16比1、时间为6 h至24 h范围内紫外吸收峰值呈直线相关。

在赖氨酸与MDA为16:1的浓度比下反应，时间越长，反应生成物的紫外吸收峰值越高（图2C），其中96 h与48 h两条曲线完全重合。

这说明，48 h反应已经基本结束，延长反应时间产物不再增加。

2.1.3 不同浓度MDA与赖氨酸反应产物的紫外吸收光谱分析将MDA与1 mmol赖氨酸反应，按赖氨酸与MDA的浓度比值分别为1:1、2:1、4:1、8:1、16:1进行，反应96 h在400nm处检测反应生成物的紫外吸收峰，结果如图3A。

将不同浓度的MDA与赖氨酸反应，测定不同时间反应生成物的紫外吸收峰值，结果如图3B。

用8 mmol的MDA与1 mmol的赖氨酸反应，检测不同反应时间（1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h和192 h）生成物的紫外吸收峰，结果如图3C。

在96 h内，MDA浓度越高，反应生成物的紫外吸收峰值越高（图3A），其中16:1与8:1两条曲线几乎重合。

这说明，8:1的浓度比与赖氨酸的反应已基本完成，增加MDA浓度对反应的影响不太大。

MDA浓度和反应时间与紫外吸收峰值均呈正相关（图3B）。

在浓度为8比1、时间为6 h至24 h范围内紫外吸收峰值呈直线相关。

在MDA与赖氨酸为8:1的浓度比下反应，时间越长，反应生成物的紫外吸收峰值越高（图3C），其中96 h与以后测的曲线完全重合。

这说明，96 h反应已经基本结束，延长反应时间产物不再增加。

2.2 不同的pH值对赖氨酸与MDA反应体系的影响将赖氨酸与MDA在不同的pH值下进行反应，每隔3 h检测，得到反应时间（min）与紫外吸收峰值的回归曲线（图4）。

图4 不同pH值下反应物的紫外吸收峰值随时间变化的回归曲线从图4 可以看出，不同pH（6.8、7.0、7.2、7.4）下的紫外吸收峰值与反应时间（min）之间均存在着极显著的回归（F值分别为：567.6342、415.9974、137.8739、313.5274，p<0.01）。

即：随着反应时间的延长，紫外吸收峰值升高。

四种pH值环境比较，偏碱性环境（PH=7.4）对紫外吸收峰值的影响最大，与其它三种pH值环境比较，均存在极显著的差异（t值分别为11.7689、5.8483、11.5593，p<0.01）；微酸性环境无影响（pH6.8与pH7.0无差别，t＝-1.6566， p>0.05）；微碱性环境有一定的影响（pH7.0与pH7.2有一定的差别，t＝2.3606, p<0.05)。

3. 讨论3.1 赖氨酸与MDA试管反应在400nm处产生了新的紫外吸收峰，说明赖氨酸确实能与MDA 反应产生新的物质，证明MDA的羰基毒化作用之一是MDA与蛋白质中赖氨酸残基或游离赖氨酸残基的结合，形成老年色素或类似老年色素类物质，从而影响正常的蛋白质功能。

这种物质的紫外吸收峰与尿液中某种物质的紫外吸收峰十分接近，估计该物质也可通过泌尿系统排出体外。

3.2 16 mmol/L的赖氨酸与1 mmol/L的MDA反应48 h，反应基本恒定。

说明赖氨酸清除MDA的最佳浓度比是16:1；在16:1的浓度比下，6～24 h清除速率最快，48 h基本清除。

与此相比较，8 mmol/L的MDA与1 mmol/L的赖氨酸反应96 h，反应才基本恒定。

这也说明当赖氨酸浓度大于MDA浓度时可以更快地清除MDA。

同时也表明运动前后及时补充赖氨酸，能增加血清中游离赖氨酸浓度，抵抗剧烈运动后氧化应激产生的MDA的毒害作用，从而保护机体蛋白质的正常生理功能。

3.3 偏碱性环境（pH7.4）赖氨酸与MDA反应速率最慢，微碱性环境（pH7.2）反应速率较慢，中性环境（pH7.0）和微酸性环境（pH6.8）反应速率最快。

这说明，剧烈运动后，体内血清中乳酸浓度升高，降低了血清的pH值，可促使赖氨酸清除MDA，起到生物的自律保护作用。

这也是体育锻炼能促使新陈代谢的原因之一。

4. 总结综上所述，赖氨酸能清除血清中游离的MDA，反应产物与尿液的某些成分相似，反应速率在微酸性和中性环境下最快。

这些结论对于了解运动后氧应激疲劳，解释运动疲劳恢复机制具有重要的参考作用。

至于正常生理条件下赖氨酸与MDA的生化反应机制如何？反应产物的具体代谢途径怎样？有待于进一步研究。

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