氯沙坦和硝苯地平对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞.

氯沙坦和硝苯地平对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的
影响
摘要：目的：观察血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)对培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细
受体拮抗剂氯沙坦和钙通道阻滞剂硝苯地平对增殖胞(VSMC)增殖的作用及AT
1
的影响。

方法：幼龄Wistar大鼠(4周龄)12只，分成对照组、AngⅡ组、氯沙坦加AngⅡ组及硝苯地平加AngⅡ组，采用组织块贴壁法培养胸主动脉平滑肌细胞，分别测定3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)、3H-亮氨酸(3H-Leu)的掺入量和细胞周期中各期细胞构成比。

结果：Ang Ⅱ(0.1 μmol/L)作用24 h能使VSMC的3H-TdR
/M期细胞增多，细与3H-Leu的掺入量比对照组(1%胎牛血清)增多，且S期和G
2
胞增殖指数增大。

与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ加氯沙坦(10 μmol/L)组和Ang Ⅱ加硝苯地平(10 μmol/L)组，3H-TdR、3H-Leu的掺入量减少，S期细胞构成比和细胞增殖指数减少。

结论：Ang Ⅱ对VSMC有促增殖作用，能被氯沙坦与硝苯地平所拮抗。

关键词：血管紧张素Ⅱ血管平滑肌细胞氯沙坦硝苯地平
Effect of losartan and nifedipine on cell proliferation induced by
angiotensinⅡin cultured rat thoracic vascular smooth muscle cell
FANG Qi-zhi ZHONG Ning JIN Man-wen
(Department of Pharmacology,College of Basic Medical Sciences,
Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Abstract：Objective：To investigate the effects of losartan and nifedipine on cell proliferation induced by Ang Ⅱ in cultured rat thoracic vascular smooth muscle
cell(VSMC).Method：12 young rat (4-week old) were divided into control group,AngⅡ group,losartan and AngⅡ group,nifedipine and AngⅡ group.VSMC from thoracic aorta were isolated by outgrowth of the explant method.3H-TdR and 3 H-Leu incorporation and cell cycle distribution were measured.Result：24 h exposure to Ang Ⅱ(0.1 μmol/L) caused an increase in 3H-TdR and 3H-Leu incorporation,cell mitogenic activity also increased. The proliferation was inhibited by losartan (10 μmol/L) and nifedipine (10 μmol/L). Pretreatment with losartan and nifedipine reduced percentages of S period cells and cells mitogenic activity induced by Ang Ⅱ. Conclusion：Losartan and nifedipine antagonized the proliferation of VSMC induced by Ang Ⅱ.
Key words：Angiotensin ⅡVascular smooth muscle cell Losartan
Nifedipine▲
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖是高血压血管重构、动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)和血管成形术后再狭窄(restenosis after angioplasty,RAA)病变的基础〔1〕。

抑制VSMC增殖成为防治高血压、AS
和RAA的重要环节。

血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)作用于心脏与血管，使之增生肥大，形成重构而影响心血管功能，AngⅡ受体拮抗剂不仅可产生与血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)相似的临床疗效，而且可以避免由于ACEI特异性不高引起的一些不良反应。

本文通过观察AT
1
受体拮抗剂Losartan(氯沙坦)和钙通道阻滞剂Nifedipine(硝苯地平)对Ang Ⅱ诱导的VSMC增殖的影响，为其临床应用提供理论及实验依据。

1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物：雄性、4周龄Wistar大鼠(n=12)由同济医科大学实验动物学部
提供。

设对照组、AngⅡ
组(A组)、氯沙坦加AngⅡ组(B组)及硝苯地平加AngⅡ组(C组)等4组。

1.1.2 药品和试剂：胎牛血清(FCS)、M199培养基、D-MEM/F-12培养基为Gibco公司产品。

胰蛋白酶、AngⅡ、硝苯地平为美国Sigma公司产品。

氯沙坦由杜邦公司赠送。

3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)、3H-亮氨酸(3H-Leu)由上海中国科学院原子能研究所提供，放射活度370 GBq/mmol。

1.2 方法
1.2.1 VSMC培养：无菌条件下迅速取出大鼠胸主动脉，按组织块贴块法将平
滑肌组织块移入培养瓶，加入M199培养液(10%FCS)，于37℃培养箱密闭培
养，静置5 d左右可见细胞从组织块周围呈梭形生长出来，每2 d换一次液体，细胞逐渐重叠生长达多层，高低起伏呈“峰，谷”状。

细胞生长融合时，用0.1%胰蛋白酶消化，传代培养。

实验采用第3～5代细胞。

1.2.2 3H-TdR 、3H-Leu掺入量测定〔2〕：消化收集细胞，加入无血清D-MEM/F-12培养液调整细胞密度至5×105/ml，以每孔200 μl接种于96孔培养板：贴壁孵育24 h，细胞同步于静止期。

实验按以下方案给药，对照组：1%FCS；A 组：AngⅡ 0.1 μmol/L；B组：氯沙坦 10 μmol/L加AngⅡ 0.1 μmol/L；C 组：硝苯地平 10 μmol/L加AngⅡ 0.1 μmol/L。

氯沙坦和硝苯地平于加
AngⅡ前1 h加入。

给药培养12 h后每孔分别加入3H-TdR、3H-Leu，终浓度为37 kBq/ml，继续培养12 h。

收样时弃去培养液，洗涤后加NaOH溶解细胞。

溶解液收于闪烁瓶中，暗适应4 h后，在液体闪烁计数器(美国FJ 2107型)上进行放射强度检测。

1.2.3 细胞周期分析：以1×106/ml细胞密度接种在培养瓶中，培养24 h后
换无血清D-MEM/F-12培养液作用24 h，按前述分组方案处理后继续培养24 h，分组收集的细胞用70%冷乙醇固定，碘化丙锭(PI 10 μg/ml、RNA酶50
mg/ml)37℃孵育30 min后，经流式细胞仪(Becton Dickinson，USA)进行细胞周期分析，微机处理分析细胞增殖动力周期中各期细胞数所占总细胞的百分
比。

并按分裂增殖指数=(S+G
2/M)/(G
/G
1
+S+G
2
/M)×100%计算细胞分裂增殖指
数。

1.3
表示，采用t检验。

2结果
2.1 4组的3H-TdR、3H-Leu掺入量比较
结果如表1所示。

2.2 氯沙坦、硝苯地平对Ang Ⅱ诱导的培养大鼠VSMC增殖指数的影响
氯沙坦、硝苯地平对AngⅡ诱导的培养大鼠VSMC增殖周期的影响见表2。

B、C组的细胞增殖指数〔(22.7±1.51)、(23.0±2.06)〕亦减少，与A组
(30.6±2.32)比较，均P＜0.01。

表1 4组的3H-TdR、3H-Leu掺入量测定结果比较次/min
与A组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01
表2 氯沙坦、硝苯地平对VSMC增殖周期的影响%，
与A组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01
3讨论
VSMC增殖、迁移可使血管腔增厚变窄、阻力增加引起血压升高；AS及RAA 也以内皮损伤、血小板聚集、生长因子释放致VSMC增殖为基本病变，因而抑制VSMC增殖成为防治原发性高血压、冠心病的研究热点。

对于细胞增殖的研究方法较为常用的是3H-TdR掺入法。

其原理是当细胞进入增殖期，细胞DNA开始复制，这时对底物胸腺嘧啶的需要增多；3H-TdR随之掺入到复制的DNA中，掺入3H-TdR越多，说明进入DNA复制期的细胞越多。

3H-Leu掺入反映氨基酸摄取、蛋白质合成状态。

流式细胞仪技术是根据细胞所处
的不同时期DNA含量不同的原理，区分出处于不同时相的细胞。

细胞周期由
G 0/G
1
期、S期、G
2
/M期组成，S期是DNA合成期，S期细胞构成比增多，反映细
胞增殖活跃。

细胞增殖指数是指处于S期和G
2
/M期细胞之和占总细胞数的比
例，它反映该群细胞的增殖速度。

本实验结果说明Ang Ⅱ作为一种生长因子在体外有促培养的VSMC增殖作用，AngⅡ使DNA和蛋白质合成明显增加，这与Briand等〔3〕和Bagby等〔4〕的结果一致。

用流式细胞仪技术进行细胞增殖动力
学分析，同样证实了AngⅡ能促进VSMC增殖，与对照组比S期和G
2
/M期细胞增多(P＜0.05)，细胞增殖指数增大(P＜0.01)，氯沙坦和硝苯地平处理后能减弱AngⅡ的促增殖作用，两者均能抑制AngⅡ诱导的VSMC的增殖。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)有重要和广泛的生理和病理生理作用，心血管局部RAS在血管壁肥厚中起着重要的作用〔5〕。

RAS主要通过AngⅡ促生长作用，使VSMC和细胞外间质增生，从而在血管重构中发挥作用〔6〕。

Bauyiedel等〔7〕证实在培养的人冠状动脉VSMC，AngⅡ能明显增加〔Ca2+〕i，并同步刺激VSMC增生。

AngⅡ是VSMC强大的丝裂原，通过自分泌、旁分泌作用可刺激VSMC的DNA和蛋白质合成增加，导致细胞肥大与细胞数目增多。

AngⅡ可诱导细胞内c-fos,c-myc,c-jun等原癌基因的表达〔8〕，c-fos和c-myc表达的产物，通过亮氨酸拉链形成异源二聚体，与DNA结合，促进细胞复制和转录。

而且Ang Ⅱ还介导其他神经多肽或生长因子释放，如促进血小板源性生长
因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生存因子β(TGF-β
1
)、bFGF的合成和释放，当存在其他生长因子，如PDGF、bFGF、AngⅡ促VSMC分裂、增殖作
用加强〔9〕。

AngⅡ促生长作用是由AT
1
受体介导，通过G蛋白-磷脂酶C(PLC)-磷脂酰肌醇系统及酪氨酸蛋白激酶系统，导致胞内Ca2+浓度增高，激活蛋白激酶C(PKC)。

一方面PKC可使核内基因转录增加，DNA和蛋白质合成增多；另一
方面，升高的〔Ca2+〕
i
又可诱导原癌基因转录，促进细胞的DNA合成和增殖，
即〔Ca2+〕
i 参与并中介这些生长因子作用。

此外，AngⅡ和AT
1
受体结合激活酪
氨酸蛋白激酶，使胞内40，45，70，77，82，115和117 ku蛋白增多，40，45
ku蛋白为有丝分裂激活蛋白(MAP)激酶，在细胞从G
0期进入G
1
期中起重要作
用，70～80 ku蛋白是一种局部粘附激酶，调节细胞的粘附、运动、增生〔10〕。

因此，影响以上环节的药物可抑制AngⅡ的促生长作用。

特异性AT
1
受体拮抗剂氯沙坦通过与受体结合，从受体水平阻断AngⅡ对VSMC的促增殖作用，从另一
角度亦说明AT
1
受体介导AngⅡ促VSMC增殖作用。

钙通道阻滞剂硝苯地平影响Ca2+进入细胞内并改变Ca2+的作用，从而抑制VSMC的异常增殖。

■
作者单位：方奇志(同济医科大学基础医学院药理教研室武汉，430030) 钟宁(同济医科大学基础医学院药理教研室武汉，430030)
金满文(同济医科大学基础医学院药理教研室武汉，430030)
参考文献:
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receptor subtype involved in DNA synthesis in
1
cultured vascular smooth muscle cells. Br J Pharmacol,1994,112:1195～1201
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收稿日期：1999-09-03。