(完整)高效液相色谱法
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
第二十章高效液相色谱(第五版)
（2）L2 = 30cm:
R1 2 L1 ( ) R2 L2
L2 30 R 2 R1 1.33 1.88 L1 15
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紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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光电二极管阵列检测器
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(二) 荧光检测器 fluorophotometric detector 特点： • 灵敏度高（高于紫外检测器）
• 只适用于能产生荧光或其衍生物能发
荧光的物质。
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(三) 蒸发光散色检测器 evaporative light scattering detector
流动相 （样品）
流动相蒸发除去
加热
组分形成气溶胶
强光
特点： 测定散射光强 • 灵敏度低 I = k mb • 通用型：如糖类、 氨基酸等分析
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(四) 化学发光检测器
组分 + 发光试剂 激发态产物 光辐射
n1/2 -1 k2 R = —— (——) (——) 4 1+k2
：主要受溶剂种类的影响
k ：主要受溶剂配比的影响
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选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失； （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
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第二节 HPLC的固定相和流动相及其选择
一、化学键合固定相：目前应用最广、性能最佳的固定相；
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
高效液相色谱法
高效液相色谱法高效液相色谱法(《中国药典》2010年版二部附录V D)系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带人柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局"液相色谱仪检定规程"定期检定并符合有关规定。
1.1 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等〉也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm(lnm= lOA)以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在3～10µm之间。
粒径更小(约2µm)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40°C，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60°C。
流动相的pH值应控制在2～8之间。
当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
第十八章_高效液相色谱法
疏水基团 C18基 C8基 苯基
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（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
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3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
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一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
第五章高效液相色谱法
数据处理系统
打开工作站，选择工作通道 编辑方法文件，设置方法名称、运行时间及定量方法 输入路径名、样品名、操作者等 样品分离完成后，记录谱图文件名和色谱峰峰高、峰面积和保留值等
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四. 液相色谱固定相
1.液-固色谱固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响
小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
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气相色谱中的固定相原则上都可以用于液相色谱，其选 用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但 在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的 工作，一般很少自行制备。
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光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
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二极管阵列检测器
样品池 D2 / W 灯
光栅
每一组分可在每一波 长处得到一吸光度值
二极管阵列
二极管阵列检测器的优点
1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰
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2. 液-液色谱固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
高效液相色谱法
正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作
流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行 泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
二 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱 本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些 因素包括：进样系统、连接管道及检测器 的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性 差。
2．化学发光检测器
是近年发展起来的高选择性、高灵敏度
（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光 光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池 的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达 1× 10-10g ／ ml ，比紫外检测 器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生 物能发荧光的物质。
主要用于氨基酸、
多环芳烃、维生素、 甾体化合物、酶类、 黄曲霉素、卟啉类 化合物、农药等的 检测。
利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解
度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段
高效液相色谱法
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特点： 特点： 氰基键合相选择性与硅胶类似 键合相选择性与硅胶类似， ① 氰基键合相选择性与硅胶类似， 但极性更小。相同流动相， 但极性更小。相同流动相，组分保留 时间小于硅胶。 时间小于硅胶。 氨基键合相 主要用于糖类分析， ② 氨基键合相 主要用于糖类分析， 糖类分析专用柱 分析专用柱。 是糖类分析敏度： 紫外、荧光、电化学、 紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏 度检测器使用。 度检测器使用。 最小检测量： 最小检测量： 10-9 ~10-11 g 4. 高度自动化： 高度自动化： 采用色谱专家系统为核心的色谱智 能化和仿真优化技术， 能化和仿真优化技术，使 HPLC不仅能 不仅能 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 而且还可以自动控制色谱条件。 而且还可以自动控制色谱条件。
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2. 流动相极性与容量因子的关系 流动相极性大，洗脱能力增加， 流动相极性大，洗脱能力增加， k 减小，tR 减小；反之， k 与 tR 均 减小， 减小；反之， 增加。 增加。 极性小的组分先出柱
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四、正、反相色谱法 正相HPLC（normal phase HPLC） （ 正相 ） 固定相： 固定相：极性 常用：改性硅胶 硅胶、 常用：改性硅胶、氰基柱 流动相: 非极性（或弱极性） 流动相 非极性（或弱极性） 常用： 正己烷 常用： 流动相极性小于固定相极性
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第二节 分离机制 一、液-固吸附色谱法 固吸附色谱法
(Liquid-Solid Chromatography)
（一）吸附机理 根据吸附剂对样品中各组分的吸 根据吸附剂对样品中各组分的吸 附能力差异而分离 而分离。 附能力差异而分离。 吸附过程是被分离组分的分子 与流动相分子争夺吸附剂表面活性 中心(active center)的结果。 的结果。 中心 的结果
第二十章高效液相色谱法
φ A , φB
—每个溶剂体积分数。
例如：如何用水和乙腈配制 P ' 值为6.9二元溶剂？
' ' ' 已知： PH2O 10.2; PACN 5.8; PIPA 3.9.
' ' ' 解： PAB φ A PA φB PB ' ' φH2O PH2O φ ACN PACN ' ' φH2O PH2O (1 φH2O )PACN
φH2O 10.2 (1 φH2O ) 5.8 6.9 φH2O 0.25
水：乙腈=25：75
3. 溶剂强度参数（表20-1）
（2）溶剂强度参数 ε
*
定义：溶剂分子在单位吸附剂表面的吸附能。
ε* 2 0.8ε* 2O3 SiO Al
使用于吸附色谱或正相色谱
3. 溶剂强度参数（表20-1）
2. 进样系统
1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简 单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进 样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，
如图。
装入样品 采样环 进样
进色谱柱 泵入溶剂 出口
3. 分离系统（色谱柱）
1）柱材料：
常用内壁（抛光）光滑的优质不锈钢柱，使用前
三. 应用
由于HPLC分离分析的高 灵 敏 度 、 定量 的 准 确 性 、
适 于 非挥发性 和 热不稳定
组 分 的 分 析， 因 此 ， 在工 业 、 科 学 研究 ， 尤 其 是在 生 物 学 和 医学 等 方 面 应用 极 为 广 泛 。如 氨 基 酸 、蛋 白 质 、 核 酸、 烃 、 碳 水化 合 物 、 药 品、 多 糖 、 高聚
仪器分析 第7章 高效液相色谱法
由非极性固定相和极性流动相所组成的 液相色谱体系，与正相 HPLC 体系正好相反。 其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶 (ODS 柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。 是当今液相色谱的最主要分离模式。
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流 动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法 将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解 到流动相中去了。
(3)工作温度： 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
高效液相色谱法主要类型
类 型 液固吸附色谱 主要分离机理 吸附能，氢键 主要分析对象或应用领域 异构体分离、族分离，制备
液液分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱
手性色谱 亲和色谱
疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而 被非极性固定相（有机相）提取。组分离 子的性质不同，它与反离子形成离子对的 能力大小不同以及形成的离子对疏水性质 不同，导致各组分离子在固定相中滞留时 间不同，因而出峰先后不同。
B. 键合相反相离子对色谱法
离子对色谱法类型很多，根据流动相和 固定相的极性可分为反相离子对和正相离子 对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重 要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水 键合相［如十八烷基键合相（ ODS ）等］， 流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶 液（如甲醇—水或乙睛—水）。
抑制柱离子色谱的原理：
以阴离子分析为例：
分析柱反应：
R—Cl + NaOH R—OH + NaCl
抑制柱反应： + NaOH
R—Na + H2O
以阳离子分析为例：
高效液相色谱法
液相色谱法固定相
(三) 离子交换色谱法固定相
1. 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体， 在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。
2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基 团键合在惰性担体表面。
液相色谱法固定相
（四） 亲和色谱固定相
亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异
的生物亲合作用来分离生物大分子的技术，它
五 高效液相色谱分离类型的选择
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品
的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应
用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质 量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度
以及化学结构等物理、化学性质。
1、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比
的作用越来越大，主要应用如下：
多环芳烃、农药、酚类、真菌毒素、异腈酸酯等
等。 特别是有机农药方面的检测。
1. 有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m)
流动相：正己烷
流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)
检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残 留量进行分析。
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
适于分离极性组分
反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）
极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分
载体又称担体
(1) 全多孔型担体：
a.
HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球 体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 Φ 100μ m全多孔型担体。
高效液相色谱法(HPLC)简介
高效液相色谱法分离过程
主要在于固定相的性质、形状及粒度，其次 差别： 是检测手段和输液设备。
经典液相色谱 固定相： 粒度：60~600μｍ（多孔） 柱长：10~200cm（d=10~50mm） n 约为 2~50/m
流动相：靠重力输送
经典液相色谱无在线检测器
缺点：
①粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻 力大。 ②无检测设备，分析速度慢、效率低。 只能作为分离手段
（3）不能完全替代气相色谱
（4）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性的
Hale Waihona Puke 生化样品。高效液相色谱法与其他分析方法一样，
不是尽善尽美的。
第二节 高效液相色谱法的基本理论
一、高效液相色谱参数 1.定性参数 tR 、 t 0 、 t’ R t’R= tR- t0 2.柱效参数 σ、 W1/2 、W W=4 σ 或 w=1.699W1/2 n=（ tR / σ）2 H=L/n
四、高效液相色谱法的应用范围和局限性
1.应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易 分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性 物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。 涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工产品 及环境污染物。约占全部有机物的80%。 2.方法的局限性
（1）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境 （2）缺少通用检测器
美国药典委员会（USPC）成立于1820年，至今近200 年。出版发行了25版药典。 75年（19版）将HPLC载入药典 20版-62项；21版-363项；22版-871项；23版-1188项； 24版-含量测定法：1386项 鉴别：519项 杂质检查：206项
如今：在评价世界各国药典水平时，HPLC法成为 反映各国药典先进性的重要指标之一。
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仪器分析练习题（二）——高效液相色谱法部分一、选择题1. 分离一组高聚物（分子量>2000）时最宜采用的色谱方法是（D ）A. 气固色谱B. 反相键合相色谱C. 离子交换色谱D. 凝胶色谱2. Si-O-Si-C型的18烷基固定相可用于（ B ）A. 正相色谱B. 反相色谱C．离子交换色谱 D. 空间排阻色谱3. 反相离子对色谱法分离试样组分时，随着对离子浓度的增大，组分的保留时间（A ）。
A. 增大B. 减小C. 不变D. 不能确定4. 下列试剂中可作为正相色谱流动相的是（C D ）。
A. 水B. 甲醇C．乙腈 D. 正已烷5. 在惰性担体表面健合上基团－SO3ˉ后的离子交换树脂称为（ B ）。
A．强碱性阳离子交换树脂 B. 强酸性阳离子交换树脂C．强碱性阴离子交换树脂 D. 强酸性阴离子交换树脂6. 分离一组高沸点的物质时最宜而是采用的色谱方法是（D ）。
A. 气液色谱B. 气固色谱C. 毛细管气相色谱D. 液相色谱7. 应用正相色谱法分析一组组分时，组分的出峰顺序为（A ）。
A. 极性小的组分先出峰B. 极性大的组分先出峰C. 分子量小的先出峰D. 分子量大的先出峰8. 火焰光度检测器是（ C ）检测器。
A. 通用型、质量型B. 通用型、浓度型C. 选择型、质量型D. 选择型、浓度型9. 梯度洗脱适用于下列哪种色谱分析方法是（ C ）。
A. 气液色谱B. 液液分配色谱C. 凝胶色谱D. 反相键合相色谱10. 下列试剂中最适宜作为反相色谱流动相的是（ A ）。
A. 甲醇水B. 环已烷C．四氯化碳 D. 正已烷11. 在惰性担体表面健合上基团－NR3＋后的离子交换树脂称为（ C ）。
A．强碱性阳离子交换树脂B. 强酸性阳离子交换树脂C．强碱性阴离子交换树脂D. 强酸性阴离子交换树脂12. 分离一组难挥性、可离解的物质时最宜而是采用的色谱方法是（ C ）。
A. 气液色谱B. 正相色谱C. 离子交换色谱D. 气固色谱13. 应用反相键合相色谱分离R-CH3、R-COOH及R-COCH3（R为一长碳链）时出峰顺序为（ A ）。
A. R-COOH、R-COCH3 、R-CH3B. R-CH3 、R-COCH3 、R-COOH、C. R-COCH3 、R-COOH、R-CH3D. R-CH3 、R-COOH、R-COCH314. 离子交换色谱法通常以（ C ）为流动相的主体。
A. 正已烷B. 环已烷C．水 D. 甲醇15. 分离一组蛋白质时，最宜采用的色谱方法是（ D ）。
A. 气固色谱B. 反相键合相色谱C. 离子交换色谱D. 凝胶色谱16. 正相离子对色谱法分离试样组分时，随着对离子浓度的增大，组分的保留时间（ B ）。
A. 增大B. 减小C. 不变D. 不能确定17. 离子交换色谱法分离柠檬酸离子、Brˉ、HCOOˉ、OHˉ时，滞留次序为（A ）。
A. 柠檬酸离子>Brˉ>HCOOˉ>OHˉB. 柠檬酸离子<Brˉ<HCOOˉ<OHˉC. HCOOˉ<OHˉ<柠檬酸离子<BrˉD. 柠檬酸离子<OHˉ<HCOOˉ<Brˉ二、判断题1. 应用正相液液分配色谱分离样品时可通过梯度洗脱方式提出分离效果。
（×）2. 离子色谱分析样品时常采用电解质作为流动相。
（√）3. 空间排阻色谱法是依据组分的分子量或分子尺寸进行分离的。
（√）4. 液液分离色谱可采用改变流动相梯度的方式来提高分离效果。
（×）5. 由于分子的扩散系数较小，在高效液相色谱中分子扩散项对色谱峰扩展的影响可以忽略。
（√）6. 热稳定差的有机化合物原则上可采用高效液相色谱法分离、分析。
（√）7. 在液-液色谱法中，为了避免固定相的流失，对于亲水性固定相可采用疏水性流动相。
（√）8. 静电力是非极性分子间存在的相互作用力。
（×）9. 色谱分析时，如应用内标法分析试样中某组分含量，则测量结果与进样量无关。
（×）10 离子交换色谱法分析样品时，被分析物质电离后产生的离子电荷符号与树脂上的反离子的电荷符号相同。
（√）11. 应用空间排阻色谱法分析样品时，分子量小的组分先出峰，分子量大的组分后出峰。
（×）12. 反相色谱法分离物质时，极性小、沸高低的先出柱。
（×）13. 由于使用了高压输送流动相，在高效液相色谱法分析样品时，谱峰展宽仅与传质阻力有关。
（×）三、填充题1. 高效液相色谱法中流动相传质阻力项分为流动状态的流动相传质阻力项和滞留的流动相中的传质。
2. 液相色谱法中，影响谱峰扩展的因素除了柱内效应还有柱外效应。
3. 在应用反相离子对色谱分离组分时，随着对离子浓度的增大，组分的保留值将增大。
4. 空间排阻色谱法是以凝胶作为固定相。
5. 为了避免固定相的流失，在液-液色谱法中，对于亲水性固定相可采用疏水性作流动相。
7. 离子交换色谱主要依据待测离子对交换剂具有不同的亲和力而进行分离的。
8. 色谱分析时，随着柱温的提高，组分的分配系数将降低。
9. 化学键合固定相的分离机制包括分配和吸附两方面。
10. 分子间的作用力包括静电力、诱导力、色散力和氢键。
11. 毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据试样中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离、分析物质的一类液相技术。
12. 应用反相色谱法分析极性组和非极性组分时，极性组分先出峰。
13. 如采用反相色谱法分离甲苯、苯甲酸，先出峰的是苯甲酸。
14. 如采用凝胶色谱法分离分子量为1.45×107和5.34×104的两种多糖，先出峰的是1.45×107。
15. 离子色谱法是以离子交换树脂作为固定相，以电解质作为流动相。
16. 液固色谱法根据物质在固体吸附剂表面活性中心的吸附能力不同来进行分离的。
17. 采用电子捕获检测器分析样品时，一般要求载气的纯度为 >99.99% 。
四、名词解释1. 梯度洗脱:流动相中含有两种或更多不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过流动相中极性的变化改变被分离组分的容量因子k和选择因子，一提高分离效果。
2. 电泳：在外加电场的影响下，带电胶体粒子或离子在分散介质中作定向移动的现象称为电泳。
五、简答题1. 简述高效液相色谱仪的基本结构，并各举例1~2个常用部件说明。
答：高效液相色谱仪基本上由输液系统、进样系统、色谱分离系统和检测记录系统等部分组成。
输液系统包括贮液瓶、过滤器、脱气装置、高压泵、梯度洗脱装置、混合室、压力表和阻尼器进样系统包括进样口、注射器或进样阀等；HPLC色谱分离系统包括色谱柱、恒温器、连接管等，是HPLC的核心。
检测系统常用得是电导检测器，紫外光度检测器等。
2.液相色谱的梯度洗提与气相色谱中的程序升温有何异同之处？。
答：在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成或浓度配比，称为梯度洗提．是改进液相色谱分离的重要手段．梯度洗提与气相色谱中的程序升温类似，但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度．程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段．3. 从分离原理、应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。
答：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行分离的。
从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。
同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。
气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。
而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。
但是二者均可与MS等联用。
二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。
而只要试样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。
4.简述HPLC中降低板高，提高柱效的方法。
答：①减小填料粒度是提高柱效的最有效途径；②用低粘度溶剂作为流动相；③减小填料孔穴深度及增大孔径；④采用适当低的流速；⑤提高柱温，降低流动相粘度。
5. 液相色谱有几种类型?写出其中三个的保留机理答：液相色谱有以下几种类型:液-液分配色谱; 液-固吸附色谱; 化学键合色谱;离子交换色谱; 离子对色谱; 空间排阻色谱等。
其中;①液-液分配色谱的保留机理是通过组分在固定相和流动相间的多次分配进行分离的。
②液-固吸附色谱是通过组分在两相间的多次吸附与解吸平衡实现分离的。
③化学键合色谱中由于键合基团不能全部覆盖具有吸附能力的载体。
④离子交换色谱和离子色谱是通过组分与固定相间亲合力差别而实现分离的。
⑤离子对色谱色谱中,样品组分进入色谱柱后,组分的离子与对离子相互作用生成中性化合物,从而被固定相分配或吸附进而实现分离的。
⑥间排阻色谱是利用凝胶固定相的孔径与被分离组分分子间的相对大小关系,而分离、分析的方法。
（以上六种任选三种）6. 简述HPLC法所使用的化学键合固定相的优点。
答：①固定相表面没有液坑,比一般液体固定相传质快的多；②无固定相流失,增加了色谱柱的稳定性及寿命；③可以键合不同的官能团,能灵活地改变选择性,可应用与多种色谱类型及样品的分析；④有利于梯度洗提,也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集；8. 简述HPLC分析时选择流动相应注意的因素。
答：①流动相纯度，一般采用色谱纯试剂，必要时需进一步纯化，以除去有干扰的杂质。
②应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。
③对试样要由适宜的溶解度，否则在柱头易产生部分沉淀。
④溶剂的黏度小些为好。
⑤应与检测器相匹配。
9.简述影响高效液相色谱法塔板高度变化的主要因素。
答：①当流动相得线速度大于0.5cm·s-1时，纵向扩散项对塔板高度的变化是可以忽略的。
②流动的流动相中的传质阻力项影响塔板高度是与线速度u和固定相粒度dp的平方成正比，与试样分子在流动相中的扩散系数Dm成反比。
③柱温，流动相的黏度等。